CN102778446A

CN102778446A - 稳态光泵浦上转换发光流式细胞检测装置

Info

Publication number: CN102778446A
Application number: CN2011101230011A
Authority: CN
Inventors: 李富友; 姚立明; 李春炎
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2012-11-14

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种新型稳态光泵浦上转换发光流式细胞检测装置。该装置由稳态光源、聚焦透镜、样品流动室、上转换发光收集透镜、滤光片和检测器单元组成。其特征在于：将中心波长范围500-1500nm的稳态光源产生的稳态光束通过光纤导入该流式细胞检测系统中，沿该稳态光束前进方向上放置聚焦透镜，形成几何尺寸稍大于细胞直径的椭圆型光斑，该稳态光束与流动室内的样品流正交；在穿过样品流与稳态光束正交方向依次放置上转换发光收集透镜、波长范围小于光源波长的滤光片和检测器。本发明能直接对具有稳态光泵浦上转换发光性质的材料(粒径大于500nm)进行光强度分析及分选，也可以对含有上转换发光粒子的活细胞或其它基质进行定性和定量分析检测。

Description

稳态光泵浦上转换发光流式细胞检测装置

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种新型稳态光泵浦上转换发光流式细胞检测装置。

背景技术

流式细胞术(Flow CytoMeter，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其它生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。通过测量细胞及其它生物颗粒的散射光和标记荧光强度，可以高速分析上万个细胞，能同时从一个细胞中测得多个参数(如：细胞体积、DNA/蛋白含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等)进行定性和定量分析，并且可以根据样品的物理和化学性质的不同进行分类筛选。与传统的荧光镜检查相比，流式细胞术具有速度快、精度高、准确性好等优点，被广泛应用于生物工程、医学等相关领域，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

目前的流式荧光检测系统，如中高端血液分析仪及流式细胞分析所用荧光探针都是遵循Stokes定律，即吸收高能光子(短波长)而后辐射低能光子(长波长)。图1为传统荧光发射的示意图。这种短波长激发，长波长发射小分子有机荧光探针存在其固有的缺陷：(1)荧光有机小分子不稳定易发生光漂白，不利于样品的长期保存和分析；(2)目前使用的这些荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，需进行荧光补偿；(3)此类荧光探针都属于共轭体系π电子激发和发射，与生物样品内源性荧光物质的自发荧光过程相似，从而无法完全消除生物样品自发荧光的干扰；(4)用作激发光源的波长以短波为主，尤其是紫外光容易造成生物样品的损伤。因此寻找新型发光材料作为生物标记物提高标记的稳定性、灵敏度、避免生物背景荧光以及减少激发光源对生物样品的损害是流式细胞分析技术的关键所在。

最近，稳态光泵浦的上转换材料在生物、医学中的应用引起了越来越多研究者的重视。和传统的荧光染料相比，这类材料具有特殊的上转换发光性质，即能吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子。图2为上转换发光示意图。例如采用低能量的光作为激发光，可以减少激发光对生物样品的损伤，由于生物样品内源性荧光物质无法产生稳态光泵浦的上转换发光性质，使用这类材料作为探针可以完全消除生物样品自发荧光的干扰。并且用廉价的稳态光源大大降低了仪器造价。此外，在对样品进行双色标记或多色标记时，某些上转换发光材料较窄的发射谱减少了窜色可能，大大提高了检测的灵敏度。因此，如果能将稳态光泵浦的上转换发光材料与流式细胞技术结合起来，发展一种新型的流式细胞检测系统，则有望为生命科学、医学和材料科学提供一种新的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳态光泵浦上转换发光流式细胞检测装置，以及使用上述流式细胞检测装置的上转换发光流式细胞检测方法。该流式细胞检测系统能直接对具有稳态光泵浦上转换发光性质的材料(粒径大于500nm)进行上转换发光光强度分析及分选，也可以对含有上转换发光粒子的活细胞或其它基质进行定性和定量分析检测。

为到达上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一套稳态光泵浦的上转换发光流式细胞检测装置，该装置由稳态光源、聚焦透镜、样品流动室、上转换发光收集透镜、发射滤光片和检测器单元组成。其特征在于：将稳态光源(中心波长范围500-1500nm)产生的稳态光束通过光纤导入该流式细胞检测系统中，沿该稳态光束前进方向上放置聚焦透镜，形成几何尺寸稍大于细胞直径的椭圆形光斑(其中椭圆光斑的长轴不超过100微米，短轴不超过50微米)，该稳态光束与流动室内的样品流正交；在穿过样品流与稳态光束正交方向依次放置上转换发光收集透镜、波长范围小于光源波长的滤光片和检测器。

本发明的工作过程是：光源(中心波长范围500-1500nm)提供的稳态光束经过聚焦透镜形成一束几何尺寸稍大于细胞的椭圆形光斑，光束穿过流动室与样本流正交，样品中具有稳态光泵浦上转换发光性质的材料在光激发下沿各方向发射出上转换发光，一部分上转换发光信号由物镜收集转换成平行光束，通过分光镜，再通过带通滤光片，对应的上转换发光信号被截取，然后被检测器接收。

本发明与已有的流式细胞检测系统相比，具有以下优点：1.由于生物样品内源性荧光物质和常用的有机荧光染料在低功率稳态光激发时只产生下转换发光，因此本发明有效地消除了生物样品自发荧光和有机荧光染料发光等背景信号的干扰，提高了检测的灵敏度；2.本发明采用的激发光源价格低廉，因此本发明易于推广普及。

附图说明

图1是传统荧光发射的示意图。

图2是上转换发光的示意图。

图3是流式细胞检测的基本原理图。

图4是本发明实施例的单一稳态光泵浦的上转换发光流式检测系统的结构示意图(一)。

图5是本发明实施例的单一稳态光泵浦的上转换发光流式检测系统的结构示意图(二)。

图6是本发明实施例的单一稳态光泵浦的上转换发光流式检测系统的结构示意图(三)。

图7是本发明实施例的单一稳态光泵浦的上转换发光流式检测系统的结构示意图(四)。

图8是本发明的一个实施例获得的稳态光泵浦的上转换发光材料标记细胞的流式检测直方图。横坐标：上转换发光强度，纵坐标：细胞数量。。

图9是本发明的一个实施例获得的稳态光泵浦的上转换发光材料及商品化染核试剂DAPI双标人宫颈癌细胞HeLa的流式检测散点图。

图10是本发明的一个实施例中所用的一种上转换发光粒子的上转换发光光谱图。激发波长：980nm。

图11是本发明的一个实施例中所用的一种上转换发光粒子负载的微球照片。激发光波长：980nm，发射收集：650±20nm，a上转换发光；b明场；c叠加。

图12是本发明的一个实施例中所用的一种上转换发光粒子标记人口腔表皮癌细胞KB的共聚焦成像图片。激发光波长：980nm，发射收集：530±20nm，a上转换发光；b明场；c叠加。

图13是本发明的一个实施例中所用的一种上转换发光粒子标记KB细胞在细胞内的上转换发光光谱图。激发波长：980nm

图3中标号：1为激发光源，2为细胞或者样品液流，3为短波长的光通过、长波长的光截止的滤光片，4为上转换发光探测器。

图4中标号：1中心波长为975nm的稳态激发光源，2为聚焦透镜，3为细胞或者样品液流，4为上转换发光收集透镜，5为850nm短通滤光片，6为570nm短通滤光片，7为500nm长通滤光片，8为750nm长通滤光片，9为530/30带通滤光片，10为488/10带通滤光片，11为650/20带通滤光片，12为808/20带通滤光片，13-16为光探测器。

图5中标号：1为激发光源，2为光调制器，3为细胞或者样品液流，4为上转换发光收集透镜，5为全反射镜，6为570nm长通二色分镜，7为750nm长通二色分镜，8为800nm带通滤光片，9为650nm带通滤光片，10为535nm带通滤光片，11-13为检测器。

图6中标号：1为激发光源，2为光调制器，3为细胞或者样品液流，4为聚焦透镜，5为850nm短通二色分镜，6为全反射镜，7为570nm长通滤光片，8为750nm长通滤光片，9为800nm带通滤光片，10为650nm带通滤光片，11为535nm带通滤光片，12-14为检测器。

图7中标号：1为激发光源(600nm)，2为聚焦透镜，3为细胞液流，4为上转换发光收集透镜，5为520nm带通滤光片，6为检测器。或者1为激发光源(550nm)，2为聚焦透镜，3为细胞或者样品液流，4为上转换发光收集透镜，5为480nm带通滤光片，6为检测器。

具体实施方式

下面结合附图5及实施例对本发明作进一步说明，而不是用来限定本发明的范围。

如图5所示，激发光源1产生的稳态光束通过光纤导入，沿该光束前进方向放置光调制器2，调整后的光束与流动室内细胞或者样品液流3正交，穿过样品流与光束正交方向上放置上转换发光收集透镜4，在该收集透镜下方与光轴成45°角放置全反射镜5，在该反射光束的前进方向放置有570nm长通二色分镜6，小于570nm的光被反射后通过535nm带通滤光片10后被检测器11收集。大于570nm的光束穿过6到达750nm长通二色分镜7，小于750nm的光被反射后通过650nm带通滤光片9后被检测器12收集。大于750nm的光束穿过7到达800nm带通滤光片8被检测器13收集。本实施例中，光源采用中心波长为980nm的半导体激光器、输出功率0-600mW。

本实施例的工作过程是：

稳态近红外激光器(中心波长为980nm)1发出的激光束经过光调制器2调整后，激光束与流动室内细胞或者样品液流正交，样品3中具有稳态激光泵浦上转换发光性质的材料在激光的激发下发射沿各个方向的上转换发光，一部分上转换发光信号被上转换发光收集透镜4收集，分别经长通二色分镜6和7以及长通滤光片8，带通滤光片9和10，特定波段的光投射到光电倍增管检测器11-13被接收，进而数据经计算机处理。

Claims

1.一种稳态光泵浦上转换发光流式细胞检测装置，其特征在于由稳态光源、聚焦透镜、样品流动室、上转换发光收集透镜、滤光片和检测器单元组成，由中心波长范围500-1500nm的稳态光源产生的稳态光束通过光纤导入该流式细胞检测系统中，沿该稳态光束前进方向上放置聚焦透镜，形成几何尺寸稍大于细胞直径的椭圆型光斑，其中椭圆光斑的长轴不超过100微米，短轴不超过50微米；该光束与流动室内的样品流正交，在穿过样品流与光束正交方向依次放置上转换发光收集透镜、波长范围小于光源波长的滤光片和检测器。