CN100591688C - 3-0-(3＇,3＇-二甲基琥珀酰基)桦木酸的药用盐 - Google Patents
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Abstract
披露了3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸(DSB)的盐。特别披露了DSB的N-甲基-D-葡糖胺和碱金属盐形式的制备、药物评价和体内生物利用度。包括这些盐形式的药物组合物用于治疗HIV和相关疾病的方法中。还提供了制备DSB的盐和药物组合物的方法。
Description
本申请要求2004年3月17日提交的美国临时申请US 60/553,554和2004年7月2日提交的美国临时申请US 60/584,674的利益，将这两篇文献的全部内容完整地引入作为本文的参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸，也称作″DSB″的新的盐形式。本发明还涉及使用包括DSB的盐形式的药物组合物治疗HIV和相关疾病的方法。本发明进一步涉及包括DSB的盐形式的药物组合物的剂型。
相关领域
人免疫缺陷病毒(HIV)是逆转录病毒亚科慢病毒属中的成员。HIV感染并且侵害免疫系统细胞；它破坏身体的免疫系统并且使患者易感机会致病菌感染和赘生物。免疫缺陷以进行性和不可逆形式出现，在几年内可达100％的高死亡率。
HIV-1使T4淋巴细胞，即表达细胞表面分化抗原CD4的免疫系统细胞，也称作OKT4、T4和leu3发生营养和细胞病变。病毒嗜亲性是因病毒被膜糖蛋白gp120与细胞表面CD4分子之间的相互作用所致(Dalgleish等Nature 312：763-767，1984)。这些相互作用不仅介导HIV感染易感细胞，而且HIV-1使T4淋巴细胞，即表达细胞表面分化抗原CD4的免疫系统细胞，也称作OKT4、T4和leu3发生营养和细胞病变。病毒嗜亲性是因病毒被膜糖蛋白gp120与细胞表面CD4分子之间的相互作用所致(Dalgleish等Nature 312：763-767，1984)。这些相互作用不仅介导HIV感染易感细胞，而且还导致感染和未被感染的T细胞发生病毒诱导的融合。这种细胞融合导致在AIDS患者中形成巨大的多核合胞体、细胞死亡和CD4细胞进行性缺失。这些情况导致HIV-诱导的免疫抑制及其随后的后遗症、机会致病菌感染和赘生物。
除CD4+T细胞外，宿主范围的HIV还包括单核吞噬细胞系细胞(Dalgleish等，上文)，包括血单核细胞、组织巨噬细胞、皮肤朗格汉斯细胞和淋巴结内的树突网状细胞。HIV还为亲神经的，能够感染中枢神经系统中的单核细胞和巨噬细胞，导致严重的神经系统损害。巨噬细胞/单核细胞为HIV主要贮器。它们可以与具有CD4-的T细胞发生相互作用并且与之融合，导致T细胞耗尽砌由此产生AIDS发病机制。
在研发用于HIV-1疗法的药物的过程中已经取得了显著的进展。用于HIV的治疗剂包括，但不限于AZT、3TC、ddC、d4T、ddI、替诺福韦、阿巴卡韦、奈韦拉平、地拉韦啶、依法韦仑、沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、那非那韦、洛匹那韦、安泼那韦和atazanavir中的至少一种或任意其它抗逆转录病毒药或抗体彼此的组合或与基于生物的治疗剂的组合，所述基于生物的治疗剂诸如有：例如gp41-衍生的肽类enfuvirtide(Fuzeon；Timeris-Roche)或可溶性CD4、CD4的抗体和CD4或抗-CD4的缀合物，或本文其它部分中给出的。这些药物的组合特别有效并且可以将血浆中的病毒RNA水平降至不可检测到的水平并且延缓病毒耐受性的发生，从而使得患者的健康和寿命得到改善。
尽管取得了这些进展，但是目前可利用的药物方案仍然存在问题。这些药物中的许多表现出严重的毒性、具有其它副作用(例如脂肪再分布)或需要降低依从性且由此限制功效的复杂给药方案。HIV的抗性株通常甚至在使用联合疗法的延长时间期限内出现。这些药物的高成本也是对其广泛应用，尤其是在研发国外应用的限制。
对研发防止这些问题发生的另外的药物的研发仍然存在巨大的需求。理想的情况是，它们可以靶向病毒生命周期中的不同阶段，从而可以添加到联合疗法用的医疗设备中，并且表现出最低的毒性，具有较低的生产成本。
已经从Syzigium claviflorum中分离了桦木酸和platanic acid并且测定它们具有抗-HIV活性。桦木酸和platanic acid在H9淋巴细胞中表现出对HIV-1复制的抑制活性，分别具有1.4μM和6.5uM的EC50值，并且治疗指数(T.I.)值分别为9.3和14。桦木酸氢化得到二氢桦木酸，它表现出稍高有效的抗-HIV活性，EC50值为0.9且T.I.值为14(Fujioka，T.，等，J.Nat.Prod.57：243-247(1994))。带有某些取代的酰基，诸如3′，3′-二甲基戊二酰基和3′，3′-二甲基琥珀酰基的桦木酸的酯化产生具有增强活性的衍生物(Kashiwada，Y.，等，J.Med.Chem.39：1016-1017(1996))。为有效抗-HIV药的酰化的桦木酸和二氢桦木酸衍生物还描述在美国专利US5,679,828中。抗-HIV试验表明3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)-桦木酸和二氢桦木酸类似物均在急性感染的H9淋巴细胞中表现出极其有效的抗-HIV活性，EC50值分别低于1.7x10-5μM。这些化合物表现出分别大于970,000和大于400,000的惊人T.I.值。
美国专利US 5,468,888中披露了羽扇烷类的28-酰氨基衍生物，将它们描述为具有用于HIV-感染细胞的细胞保护作用。
许多三萜类，包括桦木酸具有几种已知的医药应用，包括作为抗癌药的应用。Anderson等在WO 95/04526中讨论了已经用于癌症疗法的三萜类的衍生物，包括它们对细胞以最佳速率生长所需的聚胺类的活性。已经发现这些三萜类中的某些可以干扰最佳细胞生长所需聚胺类的酶合成，并且由此抑制癌细胞生长，特别是通过抑制鸟氨酸脱羧酶抑制癌细胞生长。已经报导了桦木酸还具有抗炎活性，这可能是因它抑制白细胞三烯生物合成中涉及的酶，包括5-脂氧合酶的能力所致。
Chan在英国专利GB1,425,601中披露了二氢桦木酸羧酸化衍生物可以包括在药物组合物中，但并未暗示有关这些化合物具有何种应用。
日本专利申请JP 01 143,832中披露了桦木及其3，28-二酯类用于抗癌领域。
美国专利US 6,172,110 B1中披露了具有如下通式的桦木脑和二氢桦木脑衍生物或其药物上可接受的盐，将该文献的全部内容引入本文作为参考：
桦木脑和二氢桦木脑衍生物
其中R1为C2-C20取代或未被取代的羧基酰基，R2为C2-C20取代或未被取代的羧基酰基；且R3为氢、卤素、氨基、可选取代的一-或二-烷氨基或--OR4，其中R4为氢、C1-4烷酰基、苯甲酰基或C2-C20取代或未被取代的羧基酰基；其中虚影线表示C20与C29之间可选的双键。
美国专利US 6,172,110 B1中的衍生物通过在桦木脑和二氢桦木脑衍生物的C3-羟基或C28-羟基上引入C2-C20取代或未被取代的酰基以产生相应的3-O-酰基和/或28-O-酰基衍生物而形成。描述了这些化合物用于治疗具有逆转录病毒，特别是HIV感染的感染受试者，通过给予至少一种上述桦木脑衍生物可选地与一种或多种已知的抗-AIDS治疗剂或免疫兴奋剂的组合来进行
美国专利US 60/413,451中披露了3，3-二甲基琥珀酰基桦木脑，并且将该文献引入本文作为参考。Zhu，Y-M.等，Bioorg.Chem Lett.11：3115-3118(2001)；Kashiwada Y.等，J.Nat.Prod.61：1090-1095(1998)；Kashiwada Y.等，J.Nat.Prod.63：1619-1622(2000)；和Kashiwada Y.等，Chem.Pharm.Bull.48：1387-1390(2000)披露了二甲基琥珀酰基桦木酸和二甲基琥珀酰基齐墩果酸。用琥珀酸酯化桦木脑的3′碳产生能够抑制HIV-1活性的化合物(Pokrovskii，A.G.等，Gos.Nauchnyi Tsentr Virusol.Biotekhnol.″Vector，″9：485-491(2001))。
公布的国际申请WO 02/26761中披露了桦木脑及其类似物在治疗真菌感染中的应用。
对有效抗病毒的抗药性菌株的新HIV抑制方法存在需求。本发明在一个实施方案中提供了以来自经批准的疗法中的不同方式抑制病毒的治疗方法和化合物。本发明在一个特定的实施方案中提供了以来自经批准的疗法中的不同方式抑制体内病毒的具有提高的溶解度和生物利用度的DSB的盐。本发明的组合物可以用于治疗人的HIV-1感染。
本发明的化合物和方法具有新的作用机制且由此对耐受目前疗法的HIV菌株具有活性。由此，本发明提供了用于治疗HIV/AIDS的完全新的手段。
发明概述
本发明涉及3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸(″DSB″)的特定盐形式、其药物组合物及其使用方法。本发明特别涉及DSB的胺盐，诸如N-甲基-D-葡糖胺(NmG)盐。本发明还涉及包括这些DSB的盐形式的药物组合物和剂型。这些组合物和剂型可以用于治疗HIV和相关疾病的方法中。还提供了制备DSB的盐和所述药物组合物的方法。
发明详述
本发明的第一个方面涉及3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸，下文的′DSB′的盐形式。DSB具有如下通式：
本发明的第二个方面涉及DSB的NmG盐。在一个实施方案中，DSB的葡糖胺盐为DSB的二-(N-甲基-D-葡糖胺)盐(二-NmG盐)。DSB的二-(NmG)盐可以每个DSB分子带有两个结合的NmG分子，具有分子式C50H90N2O16，分子量为975.28并且具有如下通式：
本发明的第三个方面涉及药物组合物，该组合物包括DSB的NmG盐，诸如DSB的二-(N-甲基-D-葡糖胺)盐和药用载体或稀释剂。
本发明的第四个方面涉及制备DSB的NmG盐的方法。在本发明的一个实施方案中，制备所述盐的方法包括在水溶液中混合NmG和DSB而得到3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸，N-甲基-D-葡糖胺盐。混合可以在有环糊精，诸如羟丙基-β-环糊精存在下进行。
本发明的第五个方面涉及剂型，诸如口服片剂，包括DSB的NmG盐的药物组合物。该剂型可以用于治疗逆转录病毒感染，诸如HIV的受试者。
本发明的第六个方面涉及使用包括DSB的NmG盐的药物组合物治疗逆转录病毒感染，诸如HI V受试者的方法。
DSB的任意无毒性的药物上可接受的胺或季胺盐可以用于本发明。可以在最终分离和纯化化合物的过程中在原位或通过使纯化的游离酸形式的化合物与合适的有机碱反应并且分离由此形成的盐来制备这些盐。它们包括无毒性的铵、季铵和胺阳离子，包括，但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、N-甲基-葡糖胺等。
特别关注的是DSB的NmG盐形式，即3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸，N-甲基-D-葡糖胺盐和碱金属盐形式。已经通过将DSB与NmG或与碱金属氢氧化物合并而得到DSB的一-和二-盐制备了这些盐形式。本发明的这些盐形式具有提高的生物利用度。
本发明的盐具有抗逆转录病毒活性，由此提供了用于治疗逆转录病毒感染的合适的化合物和组合物，可选地与另外的药物活性组分，诸如抗逆转录病毒、抗-HIV和/或免疫刺激化合物或抗病毒抗体或其片段组合。
所谓术语″抗逆转录病毒活性″或″抗-HIV活性″旨在表示抑制如下情况中的至少一种的能力：
(1)病毒前-DNA整合入宿主细胞基因组；
(2)逆转录病毒与细胞粘附；
(3)病毒进入细胞；
(4)允许病毒复制的细胞代谢；
(5)抑制病毒的胞间传播；
(6)病毒抗原的合成和/或细胞表达；
(7)病毒出芽或成熟；
(8)病毒编码的酶的活性(诸如逆转录酶、整合酶和蛋白酶)；和/或
(9)任意已知逆转录病毒或HIV致病作用，诸如，例如免疫抑制。因此，趋向于抑制这些机制中的任意种的任意活性均为″抗逆转录病毒活性″或″抗-HIV活性″。
本发明的DSB的盐可以单独或与本领域中公知的其它治疗方式联合用于治疗逆转录病毒(例如HIV)感染。然而，因为本发明的DSB的盐对正常细胞而言的毒性相对较低或基本上无毒性，所以其应用并不限于治疗已经确定的逆转录病毒感染。例如，本发明的DSB的盐可以用于处理血液制品，诸如那些维持在血库中的制品。目前对国家血液供给测试了对HIV的抗体。然而，该试验仍然不完善并且产生阴性试验的样品仍然可能含有HIV病毒。用本发明的DSB的盐处理血液和血液制品可以通过杀灭可能未被检出的任何逆转录病毒而增加额外的安全范围。
本发明的DSB的盐可以用于治疗无法被其它HIV-1疗法充分治疗的患者的HIV。因此，本发明还涉及治疗需要疗法的患者的方法，其中感染HIV-1的所述细胞不会对其它HIV-1疗法起反应。在另一个实施方案中，将本发明的方法对感染了对用于治疗HIV感染的药物产生耐受性的HIV的受试者实施。在各种应用中，HIV对一种或多种蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、进入抑制剂、核苷类似物、结合抑制剂、免疫调节剂和/或任意其它抑制剂产生耐受性。在某些实施方案中，将本发明的组合物和方法对感染了对用于治疗HIV感染的药物产生耐受性的HIV的受试者施用，所述的药物例如但不限齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、阿巴卡韦、阿巴卡韦、地拉韦啶、恩曲他滨、依法韦仑、沙奎那韦、利托那韦、洛匹那韦、茚地那韦、那非那韦、替诺福韦、安泼那韦、阿德福韦、atazanavir、福沙那韦、enfuvirtide、羟基脲、AL-721、聚肌胞、丁羟甲苯、polymannoacetate、澳粟精胺、contracan、creme pharmatex、CS-87、喷昔洛韦、泛昔洛韦、泛昔洛韦、cytofovir、更昔洛韦、硫酸葡聚糖、D-青霉胺磷酸三钠甲酸盐、夫西地酸、HPA-23、依氟鸟氨酸、壬苯醇醚、羟乙基磺酸喷他脒、肽T、苯妥英、异烟肼、利巴韦林、利福布汀、利福布汀、三甲曲沙、SK-818、苏拉明、UA001及其组合。
此外，本发明的DSB的盐可以用作预防个体之间HIV感染传播的预防剂。例如，可以通过口服或注射对HIV感染的孕妇和/或怀孕过程中或出生前、出生时或之后的胎儿即刻给予DSB的盐，以便减少新生儿受到感染的可能性。此外，可以在分娩前即刻通过阴道给予DSB的以便防止婴儿通过产道的过程中的感染。此外，可以在性交过程中使用本发明的DSB的盐，以便通过在性交前对阴道或其它粘膜施用抑制有效量的包括一种或多种DSB的盐的局部组合物预防HIV的传播。例如，本发明的DSB的盐可以用于预防HIV从受感染的男性传播给未受感染的女性，或反之亦然。
本发明的药物组合物可以包括至少一种DSB，可选地与一种或多种如本文所述的另外的活性剂联合。同样，治疗方法使用包括至少一种如本文所述的单独的DSB的盐或与另外所述的额外活性剂联合的药物组合物。治疗方式可以包括化疗与至少一种如本文提供的另外的药物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包括至少一种其它抗病毒药，诸如，但不限于AZT(齐多夫定，RETROVIRGlaxoSmithKline)、3TC(拉米夫定，EPIVIRGlaxoSmithKline)、AZT+3TC(COMBIVIR
GlaxoSmithKline)、AZT+3TC+阿巴卡韦(TRIZIVIR
GlaxoSmithKline)、ddI(去羟肌苷，VIDEXO
Bristol-Myers Squibb)、ddC(扎西他滨，HIVID
Hoffmann-LaRoche)、D4T(司他夫定，ZERIT
Bristol-Myers Squibb)、替诺福韦(VIREAD
Gilead)、阿巴卡韦(ZIAGEN
GlaxoSmithKline)、奈韦拉平(VIRAMUNE
Boehringer Ingelheim)、地拉韦啶(Pfizer)、依法韦仑(SUSTIVADuPont Pharmaceuticals)、沙奎那韦(INVIRASE
FORTOVASEHoffmann-LaRoche)、利托那韦(NORVIR
AbbottLaboratories)、茚地那韦(CRIXIVAN
Merck and Company)、那非那韦(VIRACEPT
Pfizer)、洛匹那韦、安泼那韦(AGENERASE
GlaxoSmithKline)、阿德福韦(PREVEON
HEPSERA
GileadSciences)、atazanavir(Bristol-Myers Squibb)、福沙那韦(LEXIVAGlaxoSmithKline)和羟基脲(HYDREA
Bristol-MeyersSquibb)或任意其它抗逆转录病毒药或抗体彼此的组合或与基于生物的治疗剂的组合，诸如，例如gp41-衍生的肽类enfuvirtide(FUZEON
Roche和Trimeris)和T-1249或可溶性CD4、CD4的抗体和CD4或抗-CD4的缀合物或本文另外给出的那些。
与至少一种DSB的盐一起最佳应用的另外的合适抗病毒药可以包括，但不限于：两性霉素B(FUNGIZONE
)；Hemispherx Biopharma研发的聚肌胞(错配的RNA)；BETASERON
(β-干扰素，Chiron)；丁羟甲苯；Carrosyn(polymannoacetate)；澳粟精胺；Contracan(硬脂酸衍生物)；Creme Pharmatex(含有苯扎氯铵)；齐多夫定的5-未被取代的衍生物；喷昔洛韦(DENAVIR
Novartis)；泛昔洛韦(FAMVIR
Novartis)；阿昔洛韦(ZOVIRAX
GlaxoSmithKline)；cytofovir(VISTIDEGilead)；更昔洛韦(CYTOVENE
HoffmanLaRoche)；硫酸葡聚糖；D-青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)；FOSCARNET
(磷酸三钠甲酸盐；AstraZeneca)；夫西地酸；甘草酸(甘草根的成分)；HPA-23(铵-21-钨-9-锑酸盐)；ORNIDYL
(依氟鸟氨酸；Aventis)；壬苯醇醚；羟乙基磺酸喷他脒(PENTAM-300)；肽T(辛肽序列，Peninsula Laboratories)；苯妥英(Pfizer)；INH或异烟肼；利巴韦林(VIRAZOLE
Valeant Pharmaceuticals)；利福布汀、安沙霉素(MYCOBUTIN
Pfizer)；CD4-IgG2(Progenics Pharmaceuticals)或其它含CD4或基于CD4的分子；三甲曲沙(Medimmune)；苏拉明及其类似物(Bayer)；和WELLFERON(α-干扰素，GlaxoSmithKline)。
本发明的药物组合物还可以进一步包括免疫调节剂。可选与本发明的桦木酸或桦木脑衍生物一起使用的合适的免疫调节剂可以包括，但不限于：ABPP(Bropririmine)；聚肌胞(错配的RNA，HemispherxBiopharma)；抗-人干扰素-α-抗体；抗坏血酸及其衍生物；干扰素-β；腈美克松；环孢霉素；西咪替丁；CL-246,738；集落刺激因子，包括GM-CSF；二硝基氯苯；HE2000(Hollis-Eden Pharmaceuticals)；干扰素-γ；葡聚糖；超免疫γ-球蛋白(Bayer)；immuthiol(二乙硫基氨基甲酸钠)；白细胞介素-1(Hoffmann-LaRoche；Amgen)、白细胞介素-2(IL-2)(Chiron)；异丙肌苷(异丙次黄嘌呤核苷)；云芝多糖；LC-9018(Yakult)；香菇多糖(Yamanouchi)；LF-1695；甲硫脑啡肽；Minophagen C；胞壁酰三肽、MTP-PE；纳曲酮(Barr Laboratories)；RNA免疫调节剂；REMUNE
(Immune Response Corporation)；RETICULOSE
(Advanced Viral Research Corporation)；shosaikoto；人参；胸腺体液因子；胸腺喷丁；胸腺肽因子5；胸腺肽1(ZADAXIN
SciClone)；胸腺刺激素；TNF(肿瘤坏死因子，Genentech)；和维生素制剂。
本发明的药物组合物还可以进一步包括抗癌治疗剂。可选应用的合适的抗癌治疗剂包括有效抑制肿瘤的抗癌组合物，它包括所述抗癌药化合物或其药物上可接受的盐或前体药物，它们可以用于联合疗法，包括，但不限于：烷化剂，诸如白消安、顺铂、丝裂霉素C和卡铂；抗有丝分裂药，诸如秋水仙碱、长春碱；泰素，诸如紫杉醇(TAXOLBristol-Meyers Squibb)、多西他赛(TAXOTERE
Aventis)、拓扑异构酶I抑制剂，诸如喜树碱、伊立替康和托泊替康(HYCAMTIN
GlaxoSmithKline)、拓扑异构酶II抑制剂，诸如多柔比星、柔红霉素和依托泊苷，诸如VP16；RNA/DNA抗代谢物，诸如5-氮杂胞苷，5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤，DNA抗代谢物，诸如5-氟-2′-脱氧-尿甙、ara-C、羟基脲、硫鸟嘌呤；和抗体，诸如曲妥单抗(HERCEPTIN
Genentech)；和美罗华(RITUXANGenentech和Biogen-Idec)、美法仑、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、长春新碱、米托胍腙、表柔比星、阿柔比星、博来霉素、米托蒽醌、elliptinium、氟达拉滨、奥曲肽、维甲酸、他莫昔芬、阿拉诺新及其组合。
本发明进一步提供了提供与本发明化合物及其药物上可接受的盐联用的抗细菌治疗剂、抗寄生物治疗剂和抗真菌治疗剂的方法。抗细菌治疗剂的实例包括如下化合物：诸如青霉素、氨苄西林、阿莫西林、环青霉素、依匹西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、羧苄西林、头孢氨苄、cepharadine、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢噻肟、头孢唑肟、cefinenoxine、头孢曲松、拉氧头孢、亚胺培南、克拉维酸盐、特美汀、舒巴坦、红霉素、新霉素、庆大霉素、链霉素、甲硝唑、氯霉素、克林霉素、林可霉素、喹诺酮类、利福平、磺胺类药物、杆菌肽、多粘菌素B、万古霉素、多西环素、美他环素、米诺环素、四环素、两性霉素B、环丝氨酸、环丙沙星、诺氟沙星、异烟肼、乙胺丁醇和萘啶酸以及这些化合物中每一种的衍生物和改变形式。
抗寄生物治疗剂的实例包括硫氯酚、枸橼酸乙胺嗪、甲苯达唑、美曲磷酯、niclosamine、尼立达唑、奥沙尼喹和其它奎宁衍生物、柠檬酸哌嗪、吡喹酮、双羟萘酸噻嘧啶和噻苯达唑以及这些化合物各自的衍生物和改变形式。
抗真菌治疗剂的实例包括两性霉素B、克霉唑、柠檬酸益康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素、酮康唑和咪康唑以及这些化合物各自的衍生物和改变形式。抗真菌化合物还包括阿库来菌素A和papulocandin B。
本发明优选的动物受试者为人。在特定实施方案中，本发明用于治疗人体受试者。
术语″治疗″指的是对受试者给予本发明的DSB的盐，目的在于包括预防、改善或治愈与逆转录病毒相关的病理学情况。
认为药物是以提供彼此的″组合物″，如果是将它们同时提供给患者或在给予每种药物之间的时间为，诸如允许生物活性重叠。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包括3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸的二-(N-甲基-D-葡糖胺)盐。
用于本发明给药的药物组合物包括至少一种药物上可接受形式的本发明DSB的盐，可选地将组合物与药物上可接受的载体合并。可以通过实现指定目的的任意形式给予这些组合物。用于本发明DSB的盐的量和方案易于由治疗逆转录病毒病理学情况的临床领域的普通技术人员确定。
例如，可以通过非肠道给药，诸如皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮或口含途径。可供选择地，或同时通过口服途径进行。给药剂量取决于接受者的年龄、健康和体重、在先或同时治疗的类型(如果有的话)、治疗频率和所需作用的性质。
本发明范围内的组合物包括所有含有有效实现指定目的的用量的本发明至少一种DSB的盐的组合物。尽管个体需要是可变的，但是测定各成分有效量的最佳范围属于本领域技术人员的范围。至少一种DSB的盐的典型剂量包括约0.05-约100mg/kg体重。在某些实施方案中，DSB的一种或多种盐的有用的剂量包括约0.1-约100mg/kg体重的活性组分，优选约0.1-约20mg/kg体重的活性组分。在某些实施方案中，DSB的一种或多种盐的更优选的剂量包括约0.2-约10mg/kg体重。DSB的一种或多种盐的有用的剂量包括约0.5-约5mg/kg体重。在某些实施方案中，DSB的一种或多种盐的剂量包括约10-约100mg/kg体重。
可以给予各种剂量的本发明组合物以提供各种血浆水平的DSB。在某些实施方案中，优选的剂量为在患者血浆中提供约1微摩尔(μM)-约1毫摩尔(mM)的DSB的谷浓度。在某些实施方案中，剂量为在患者血浆中提供约4μM(2.34μg/mL)-约1000μM，约40uM-约1000μM或约400μM-约1000μM的DSB的谷浓度的一种剂量。在某些实施方案中，剂量为在患者血浆中提供约4μM(2.34μg/mL)-约200μM，约10μM-约200μM或约40μM-约200μM的DSB的谷浓度的一种剂量。在某些实施方案中，剂量为在患者血浆中提供约4μM(2.34μg/mL)或约4μM(2.34μg/mL)以上，至少约10μM或约10μM以上，至少约40μM或约40μM以上，至少约100μM或约100μM以上，或至少约200μM或约200μM以上的DSB的谷浓度的一种剂量。在某些实施方案中，剂量为在患者血浆中提供约约400μM的DSB的谷浓度的一种剂量。″谷浓度″是指在恰在下一次对患者给药前患者血浆中DSB的浓度。
可以按照本发明给予各种量的本发明的一种或多种盐。在某些实施方案中，可以将约10mg-约1000mg的本发明一种或多种盐的活性组分每天给药一次。在某些实施方案中，可以将约50mg-约500mg的本发明一种或多种盐的活性组分每天给药一次。在某些实施方案中，可以将25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg或500mg的本发明一种或多种盐的活性组分每天给药一次。每天给予的一种或多种盐的量根据24小时期限内给予的一种或多种盐的总量来决定。因此，指导24小时期限内多次给予本发明一种或多种盐的剂量方案属于本发明的范围，只要在24小时期限内给予的累计量属于上述范围。
治疗性给药还可以包括在先、同时或随后或辅助性给予至少一种本发明DSB的另外的盐或其它治疗剂，诸如抗病毒药或免疫兴奋剂。在这类方案中，第二种药物的剂量可以与第一种治疗剂的剂量相同或不同。在本发明的一个实施方案中，在交替的天数时给予各药物推荐用量的药物。
本发明化合物的给药还可以可选地包括在先、同时、随后或辅助性疗法地使用免疫系统增强剂或免疫调节剂。除药物活性化合物外，本发明的药物组合物还可以含有合适的药物上可接受的载体，包括有利于将活性化合物加工成可以在药物上使用的制剂的赋形剂和助剂。在一个实施方案中，制剂，特别是那些可以口服给药的制剂，诸如片剂、锭剂和胶囊，还有可以通过直肠给药的制剂，诸如栓剂以及通过注射或口服给药的合适的溶液，含有约0.01-99％的活性组分与赋形剂。在另一个实施方案中，制剂可以包括约20-75％的活性化合物，以及赋形剂。
可以按照自身公知的方式，例如通过常规的混合、制粒、制锭、溶解或冻干法制备本发明的药物制剂。因此，可以通过下列步骤获得口服应用的药物制剂：将活性化合物与固体赋形剂合并，可选地研磨所得混合物，并且如果需要或必要，在加入合适的助剂后将颗粒混合物加工成片芯或锭芯。
合适的赋形剂为：例如填充剂，诸如糖，例如乳糖或蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；纤维素制品和/或磷酸钙，诸如磷酸钙或磷酸氢钙；以及粘合剂，诸如，例如使用玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉的淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可以进入崩解剂，诸如上述淀粉，且还有羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，诸如藻酸钠。助剂为上述所有调节流动性的试剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其盐，诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。给锭芯包合适的包衣层，如果需要，这些包衣层耐胃酸。为了这一目的，可以使用浓糖溶液，该溶液中可以可选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生耐胃酸的包衣层，使用合适的纤维素制品溶液，诸如邻苯二甲酸乙酰纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素。例如，可以向片剂或锭剂包衣层中加入染料或色素以便鉴别或表征活性化合物剂量的组合。
可以口服使用的其它药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊和由明胶和增塑剂，诸如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊可以含有颗粒形式的化合物，所述颗粒中可以混有填充剂，诸如乳糖，粘合剂，诸如淀粉和/或润滑剂，诸如滑石粉或硬脂酸镁，和可选稳定剂。在软胶囊中，可以将活性化合物溶于或悬浮于合适的液体中，诸如脂肪油或液体石蜡。此外，可以加入稳定剂。
可以通过直肠使用的可能的药物制剂包括：例如有活性化合物与栓剂基质的组合组成的栓剂。合适的栓剂基质例如为天然或合成甘油三酯类或链烷烃。此外，还能够使用由活性化合物与基质组合组成的直肠用胶囊。可能的基质材料包括：例如液体甘油三酯类、聚乙二醇类或链烷烃类。
用于非肠道给药的合适的制剂包括水溶性形式，例如水溶性盐形式的活性化合物的水溶液。此外，可以给予作为合适的油注射混悬液的活性化合物的混悬液。合适的脂溶性溶剂或媒介物包括：脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯类，诸如油酸乙酯或甘油三酯类。可以含有增加混悬液粘度的物质的含水注射混悬液包括：例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该混悬液还可以可选地含有稳定剂。
口服给药用的液体剂型包括药物上可接受的乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如：例如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇；环糊精，诸如羟丙基-β-环糊精；碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油，诸如棉子油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢呋喃甲、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯类及其混合物。
除活性化合物外，混悬液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇类、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨糖醇酯类、纤维素、微晶纤维素、金属氢氧化铝、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其组合。
可以将用于全身给药的药物制剂配制成肠溶、非肠道或局部给药用制剂。实际上，可以同时使用所有三种类型的制剂以便实现活性组分的全身给药。
用于口服给药的合适的制剂包括口服剂型，诸如，但不限于硬胶囊或软胶囊；锭剂；丸剂；片剂，包括包衣片；酏剂；混悬液；糖浆剂或吸入及其控释剂型。
除那些为口服给药配制的剂型外，固体剂型还包括直肠栓剂。
当与生物可降解的缓释载体结合时，还可以将本发明的DSB的盐以植入物的形式给药。或者，可以将本发明的DSB的盐配制成用于连续释放活性组分的透皮贴剂。
用于局部给药的合适的制剂包括霜剂、凝胶、胶冻剂、胶浆剂、糊剂和软膏剂。合适的可注射溶液包括静脉内、皮下和肌内注射溶液。或者，可以以输注溶液、鼻腔吸入或喷雾剂或粘膜或阴道递药系统，诸如阴道环、泡沫、凝胶、含药栓剂和医用卫生栓的形式给予DSB的盐。
用于预防分娩或性交过程中个体之间HIV感染的预防性局部组合物包括DSB的一种或多种盐和至少一种药物上可接受的载体或稀释剂。局部组合物可以为，例如软膏剂、霜剂、凝胶、洗剂、糊剂、胶冻剂、喷雾剂、泡沫或海绵的形式。一般来说，DSB的盐在预防性局部组合物中的剂量低于约1,000毫克，并且在某些实施方案中，约为0.01-约100毫克。局部制剂可以包括其它预防性组分。载体和稀释剂应是可接受的，其与制剂中的其它组分相容并且对接受者无害。
局部用预防性制剂包括那些适合于阴道、直肠或局部给药的制剂。如果合适，可以将这些制剂便利地制成分散剂量单位，并且可以通过制药领域公知的任意方法制备。所有这类方法均包括下列步骤：将活性剂与液体载体、凝胶或细粉固体载体或它们两者混合，且然后如果必要，使产物形成所需制剂。
可以将适合于阴道给药的预防性制剂可以制成阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、胶冻剂、泡沫或喷雾剂或水或油混悬液、溶液或乳剂(液体制剂)，它们含有本领域中公知的合适的载体与所述活性剂。液体制剂可以含有常用添加剂，诸如悬浮剂；乳化剂；非水媒介物，包括可食用油；或防腐剂。这些制剂用于预防HIV的性传播和婴儿通过产道过程中的感染。在一个实例中，可以在性交前或分娩前即刻进行阴道给药。
在某些实施方案中，将含有固体载体的适合于直肠或阴道给药的预防性制制成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和其它本领域中常用的材料。例如，可以通过混合DSB的一种或多种盐于一种或多种软化或熔化载体，随后在塑模中冷却和成形而形成栓剂。
本发明的预防性制剂还可以为配制成包括一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水或非水基质的滴剂形式。可以从加压药包中递送液体喷雾剂。
本发明的预防性制剂可以适合于获得持续递送。此外，预防性制剂可以包括其它活性剂，诸如杀精子剂、抗菌剂和抗病毒药。
当与生物可降解的缓释载体结合时，还可以以植入物的形式给予本发明的三萜衍生物。或者，可以将本发明的三萜衍生物配制成用于持续释放活性组分的透皮贴剂。
通过将碱性或形成阳离子的化合物，诸如NmG和DSB在水溶液中混合制备本发明的盐。混合可以在有环糊精，诸如羟丙基-β-环糊精存在下进行。可以通过美国专利US5,679,828中所述的合成方法获得DSB的游离酸。
由于目前已经一般性地描述了本发明，所以更易于通过参照下面的实施例来理解本发明。
实施例1
3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸的二-(N-甲基-D-葡糖胺)盐的制备
将2.09740g N-甲基-D-葡糖胺溶于250mL甲醇。加入3.13295g DSB并且在同时放置过夜，该混悬液变澄清。借助于氮气流除去溶剂。形成浓稠无色油状物。加入200mL甲醇以便溶解该油状物。缓慢向涡旋混合物中加入200mL乙醚而得到白色固体。通过真空过滤分离该固体物质而得到5.51993g结晶固体。在真空中将该固体干燥72小时而得到4.9737g物质。
实施例2
3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸的二-钠盐的制备
将1.35531g DSB溶于50mL甲醇。将0.18758g固体氢氧化钠溶于2.0mL去离子水。合并两种混合物并且再用15mL甲醇稀释。在该混合物变澄清后，将该甲醇混合物在氮气流中浓缩至25mL。加入90mL乙醚。真空过滤，随后在环境温度下进行真空干燥而得到1.45986g二钠盐。
实施例3
3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸的二-钾盐的制备
将4.14657g DSB溶于50mL甲醇。将0.95287g固体85％氢氧化钾溶于10mL去离子水。合并两种混合物并且再用250mL甲醇稀释。在该混合物变澄清后，通过氮气流除去甲醇。将所得白色固体溶于50mL甲醇并且用200mL乙醚沉淀。真空过滤，随后在环境温度下进行真空干燥而得到4.29679二钾盐。
实施例4
本发明的盐与对比例的评价
A.溶解度
将有关DSB的NmG、钾和钠盐形式(分别为DSB-(NmG)2、DSB-K2和DSB-(Na)2)的溶解度的定性结果分别列在表1、2和3中。以mg/mL报导尝试的浓度，但不包括按重量添加的赋形剂的情况。以mg/g报导这些浓度。所列浓度因盐而未考虑到纯度或额外摩尔质量的校正因子。在大部分情况中，将成功的制剂描述为澄清溶液。然而，某些制剂稍显颜色或甚至在药物物质溶解时仍表现出浑浊。将大部分制剂在室温下和磁性搅拌板上混合。将含有维生素E TPGS(二-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)的制剂维持在40-45℃下以便将该混合物保持在液体状态。
特别关注的是三种盐形式在由在水中10％的羟丙基-β-环糊精组成的溶剂中的溶解度。当27.7mg/mL的DSB-(Na)2在该溶剂系统中的尝试溶液浑浊时，50.0mg/mL的DSB-(NmG)2在该溶剂中的溶液澄清。这提示DSB-(NmG)2在该溶剂中的溶解度显著高于DSB-(Na)2。
在25℃下，测定DSB-(NmG)2的溶解度，作为pH的函数。DSB-(NmG)2在碱性和中性条件下显然为可溶性的。在pH为9.461下观察到了7.537mg/mL的溶解度并且在pH为10.691下观察到了7.463mg/mL的溶解度。在25℃下的强酸溶液中观察到DSB-(NmG)2为不溶性。
DSB-(NmG)2的平衡浓度在两种高极性溶剂去离子水和丙二醇中极高(参见表4)。比较DSB-(NmG)2在去离子水(＞18mg/mL，介电常数＝88.0)、甲醇(37.03mg/mL，介电常数＝32.6)和乙醇(24.99mg/mL，介电常数＝24.3)中的溶解度，显然溶解度随介电常数下降。这与DSB-(NmG)2的离子性质一致。
表1：DSB-(NmG)2
| PEG 400 12维生素E TPGS 10乙醇 3 | 到胶凝。 | |
| 水 75PEG 400 11维生素E TPGS 10乙醇 4 | 50.8 | 溶液澄清，泡沫明显，观察到胶凝。 |
| 水 84PEG 400 11乙醇 4二甲硅油乳剂 1 | 50.5 | 溶液浑浊，存在一定泡沫。 |
| Captex 200 81维生素E TPGS 15DMA<sup>**</sup> 4 | 25.5 | 溶液浑浊，存在一定程度胶凝 |
| 水 96DMA 4 | 52.2 | 溶液加热澄清 |
| 水 96DMA 4 | 71.2 | 溶液浑浊 |
| Captex 200 82维生素E TPGS 16DMA 4 | 24.5mg/g | 溶液浑浊，存在一定程度胶凝。 |
| 水 86PEG 400 10乙醇 4 | 67.3 | 溶液澄清 |
| 羟丙基-β-环糊精 10(在水中) | 50.0 | 溶液澄清 |
| 水 84PEG 400 10乙醇 4维生素E TPGS 2 | 40.4mg/g | 药物看起来溶解，但从液体显微‘结构’下观察为浑浊 |
：聚乙二醇400；*：二-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯；**：二甲基乙酰胺
表2：DSB-K2
| 溶剂系统(％) | 尝试浓度(mg/mL) | 外观 |
| 水 100 | 3.5 | 溶液浑浊 |
| 水 84PEG 400 12乙醇 4 | 42.2 | 溶液浑浊 |
| 羟丙基-β-环糊10精(在水中) | 29.0 | 溶液澄清 |
表3：DSB-(Na)2
| 溶剂系统(％) | 尝试浓度(mg/mL) | 外观 |
| 羟丙基-β-环糊精 10(在水中) | 15.1 | 溶液澄清 |
| 羟丙基-β-环糊精 10(在水中) | 27.7 | 溶液浑浊 |
| 羟丙基-β-环糊精(在水 20中) | 27.9 | 溶液澄清 |
表4
DSB-(NmG)2和DSB(游离酸)在所选溶剂中的平衡溶解度值
| 媒介物 | DSB-(NmG)<sub>2</sub>的溶解度 | DSB游离酸的溶解度 | 平衡时间(天数) |
| HERG缓冲液 | 17.76μg/mL | N/A | 3 |
| 1％在HERG缓冲液中的DMSO | 87.11μg/mL | N/A | 3 |
| 丙二醇<sup>a</sup> | ＞255mg/mL | N/A | 7 |
| PEG 400<sup>b</sup> | 5.12mg/mL | N/A | 7 |
| 甲醇 | 37.03mg/mL | N/A | 7 |
| 乙醇<sup>c</sup> | 24.99mg/mL | N/A | 7 |
| 去离子水 | ＞7mg/mL | N/A | 4 |
| PSS<sup>*</sup> | 80.18μg/mL | 1.50mg/mL | 3 |
| PSS+1％DMSO | 107.9μg/mL | 1.63mg/mL | 3 |
| PSS+0.1％DMSO | 107.7μg/mL | N/A | 3 |
| 去离子水 | ＞18mg/mL | 35.1μg/mL | 3 |
a稻草/琥珀色溶液。所有其它样品为无色或白色。
b在从水浴中取出时化合物可能已经从溶液中沉淀，终浓度降低。
c在从平衡小瓶中将样品转入离心管时，溶液变浑浊。固体可能已经从溶液中沉淀。平衡后的最初视觉评价近似不饱和。不饱和浓度～33mg/mL。可能是平衡浴与室温的温差的结果。
*生理盐溶液
N/A＝因未使用这些溶剂进行试验而不适用。
B.体内生物利用度
在雄性Sprague Dawley大鼠中进行口服生物利用度研究。本研究的目的在于比较作为游离酸给予或作为如下盐形式之一给予的DSB的不同制剂的药代动力学特性：NmG、Na或K。通过使用饲喂针进行口腔管饲法给予所述游离酸或盐的溶液或混悬液以便提供25mg/kg的标称口服剂量。对每种给予的盐而言，给药剂量基于游离酸的当量。组号和制剂列在下面。
组号和制剂
1组：在2％DMA(二甲基乙酰胺)中的25mg/mL DSB游离酸、14％
维生素E TPGS、84％Captex(由选择的高纯度植物脂肪酸和丙二醇形成的二酯(甘油三酯))
2组：在4％维生素E TPGS和96％羧甲基纤维素(CMC)(0.5％)混悬液中的25mg/mL DSB游离酸
3组：在84％水、4％乙醇和12％PEG 400中的41.7mg/mL DSB-(NmG)2盐(相当于25mg/mL游离酸)
组4：在84％水、4％乙醇和10％PEG 400、2％维生素E TPGS中的41.7mg/mL DSB-(NmG)2盐(相当于25mg/mL游离酸)
5组：在10％羟基-β-环糊精/水中的41.7mg/mL DSB-(NmG)2盐(相当于25mg/mL游离酸)
6组：在0.5％CMC混悬液中的25mg/mL微粉化DSB游离酸
7组：在0.5％CMC和维生素E TPGS中的25mg/mL微粉化DSB游离酸混悬液
8组：在10％羟基-β-环糊精/水中的28.3mg/mL DSB-K2盐(相当于25mg/mL游离酸)
9组：在10％羟基-β-环糊精/水中的13.5mg/mL DSB-(Na)2盐(相当于12.5mg/mL游离酸)
10组：在96％Capt ex 200、4％维生素E TPGS中的25mg/mL DSB游离酸
在下列时间通过心脏穿刺采血样(n＝2只大鼠/制剂/时间点)：0.25、0.5、1、2、4、6、12和24小时。将口服制剂的生物利用度计算为口服剂量调整的AUCINF与来自DSB在大鼠中的研究的静脉内给药后报导的剂量调整的AUCINF之比，推定为剂量调节比值(AUCINF＝63.3μgh/mL)。
本研究的结果列在表5中。NmG盐制剂具有最高的生物利用度，范围在49％-71％。第5、8和9组的数据表明在等同剂量下，该盐在10％羟基-β-环糊精/水溶剂中的生物利用度等级次序为NmG＞钾＞钠。
表5
给予25MG/KG的单一口服剂量的大鼠血浆中DSB的药物动力学参
数值
| 组号 | 计算剂量(mg/kg)<sup>a</sup> | C<sub>max</sub>(μg/mL)<sup>b</sup> | Tam(h)<sup>c</sup> | AUC<sub>all</sub>(μg·h/mL)<sup>d</sup> | AUC<sub>INF</sub>(μg·h/mL)<sup>e</sup> | 表观k<sub>e</sub>(h<sup>-1</sup>)<sup>f</sup> | F(％)<sup>g</sup> |
| 1 | 26.05 | 5.52 | 1.0 | 16.6(0-12h) | 16.8 | 0.3327 | 10.6 |
| 2 | 22.45 | 0.419 | 2.0 | 1.36(0-6h) | 2.26 | 0.2051 | 1.65 |
| 3 | 20.12 | 12.0 | 4.0 | 65.3(0-12h) | 66.4 | 0.4675 | 54.2 |
| 4 | 20.48 | 13.7 | 4.0 | 88.9(0-12h) | 89.4 | 0.6019 | 71.7 |
| 5 | 18.15 | 11.4 | 4.0 | 54.3(0-12h) | 54.5 | 0.6496 | 49.3 |
| 6 | 21.08 | 0.570 | 4.0 | 3.28(0-24h) | 3.82 | 0.0837 | 2.98 |
| 7 | 21.80 | 2.00 | 6.0 | 10.2(0-12h) | 10.2 | 0.7486 | 7.69 |
| 8 | 19.87 | 7.28 | 4.0 | 44.1(0-24h) | 44.7 | 0.1971 | 37.0 |
| 9 | 20.22 | 11.0 | 4.0 | 39.1(0-12h) | 39.2 | 0.5496 | 31.9 |
| 10 | 24.54 | 1.32 | 2.0 | 6.05(0-12h) | 6.63 | 0.0876 | 6.70 |
a根据剂量溶液分析测定的浓度
b测定的峰值平均血浆浓度
c时间对血浆浓度
d血浆浓度与时间曲线下的面积
e外推至无穷大的血浆浓度与时间曲线下的面积
f消除速率常数；半衰期＝0.693/ke
g将生物利用度计算为DSB口服后获得的剂量调整的AUCINF与静脉内给药后报导的剂量调整的AUCINF之比(剂量＝10.4mg/kg，AUCINF＝63.3mg·h/mL)。静脉内数据获自DSB在大鼠中的研究。
F(％)＝100×(剂量静脉内×AUCINF口服)/(剂量口服×AUCINF静脉内)
实施例5
DSB-(NmG)2在HIV感染的SCID-hu Thy/Liv小鼠模型中的体内抗
-HIV功效的表征
进行本研究是为了评价DSB(DSB-(NmG)2)的NmG盐在100和300mg/kg/天剂量下在每天两次通过口腔管饲法治疗22天的雄性SCID-huThy/Liv小鼠(7只/组)中的抗病毒活性。(剂量指的是游离酸当量，即存在于剂量中的DSB的量)。在300mg/kg/天剂量水平下，对一组未感染的SCID-hu Thy/Liv小鼠给药以便评价该剂量水平的耐受性。将每天一次口服管饲30mg/kg/天3TC(拉米夫定)，持续22天用作阳性对照。获得6周龄的雄性C.B-17SCID小鼠并且植入来自单一供体的人胎儿组织。在14周时，给小鼠的肾囊下植入人胎儿肝和人胎儿胸腺部分以生成SCID-hu Thy/Liv小鼠。当植入物达到约30mm3时，使动物进入实验。在BSL3指导下，对受限动物屏障实验室中的麻醉小鼠进行SCID-hu Thy/Liv小鼠的HIV-1接种。使用250-μL Hamilton玻璃注射器和30-标准量度x1/2-英寸钝圆针头给每个Thy/Liv植入物在1-3个位置上注射50μL(1,000TCID50)NL4-3批号的JK WS1 D3(按1∶2稀释)或注射RPMI 1640培养基。为了进行本研究，在组织植入后18周接种植入物。在接种后21天采集所有植入物。
给药媒介物为10％在无菌PBS(磷酸缓冲盐水)中的羟丙基-β-环糊精。在每次给药前新鲜制备浓度为12和38mg/mL的给药溶液以便给予100和300mg/kg/天的DSB游离酸。
每天两次通过管饲法对小鼠口服给药(200μL/剂量)并且观察毒性征兆。因为在以300mg/kg/天治疗的小鼠中观察到了毒性，所以在未治疗的5天恢复期后开始治疗后的7天开始将剂量水平降至150mg/kg/天。观察治疗小鼠毒性征兆的给药时间并且每隔2-5天给小鼠称重。在第一次剂量后1天给小鼠接种NL4-3(AM剂量后1-2小时)，并且将给药进行22天。
在接种后21天，通过手术切下Thy/Liv植入物并且转入含有无菌PBS/2％FBS(胎牛血清)的6-孔组织培养板。通过下列步骤制备单一细胞混悬液：将植入物放入无菌尼龙过滤袋，将该袋浸入在60-mm组织培养皿中的PBS/2％FBS中，并且用镊子分散在尼龙层之间。用Coulter计数器对细胞计数并且对每次试验而言将适量的细胞进行等分。就p24 ELISA而言，将2.5×106个细胞的沉淀重新悬浮于400μL p24裂解缓冲液中，在4℃下旋转过夜并且储存在-20℃下。就通过分支DNA试验进行RNA定量而言，冷冻5×106个细胞的干燥沉淀并且储存在-80℃下。为了进行FACS分析，将106个细胞/孔放入96-孔平板以便进行固定和染色并且在同一天通过4-色FACS分析进行分析。
在本研究中，在病毒接种前24小时开始每天两次以100和150mg/kg/天口腔管饲DSB-(NmG)2，对NL4-3具有有效的剂量依赖性抗病毒活性。在最高剂量水平下，p24被减少了99％(14与未治疗小鼠的440pg p24/106个细胞)并且HIV-1RNA被减少了97％(103.4与105.6个拷贝/106个细胞)，且CD4+CD8+胸腺细胞上的MHC-I表达被减少至更为正常的水平(在平均荧光强度中的250与530)。在植入物p24和100mg/kg/天的病毒RNA方面存在适度而具有统计学显著性的减少(69pg p24和104.0个拷贝/106个细胞)，并且在单独用10％羟丙基-β-环糊精媒介物治疗后则没有减少(590pg 24和105.6个拷贝/106个细胞)。
在病毒接种前24小时开始每天一次以100mg/kg/天口服管饲3TC在本研究中已经显示出显著的抗病毒活性，使p24减少了97％(35与440pg p24/106个细胞)并且使HIV-1RNA减少了96％(104.2与105.6个拷贝/106个细胞)且保留了胸腺细胞存活力(71％活胸腺细胞)。
这些数据证实DSB-(NmG)2为有效的体内HIV-1复制抑制剂。在该模型中DSB-(NmG)2显示出与3TC类似的功效。
概述
所有三种DSB的盐表现出显著高于游离酸(～100μg/mL)的水溶性。DSB的NmG盐比钾盐和钠盐显然更易溶于10％羟丙基-β-环糊精在水中的溶液。大鼠生物利用度研究评价了5种不同制剂(三种均含有NmG，一种含有钠，且一种含有钾)的DSB的三种盐形式和5种不同含有游离酸的制剂。NmG盐制剂具有最高的口服生物利用度，范围在49％-71％。此外，SCID-Hu小鼠研究证实DSG-(NmG)2为有效的体内HIV-1复制抑制剂。
上述具体实施方案的描述由此完整地揭示了本发明的一般性能，可以通过应用最新的知识易于修改和/或改变本发明这类具体实施方案的其它性能以用于各种应用，而不会背离一般性的概念，并且由此这类改变和修改包含在披露的实施方案的等同方案的含义和范围内。应理解本文的措词或术语的目的在于描述而非限定。
将本说明书中引述的所有参考文献引入本文作为参考。
Claims (19)
1.3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸N-甲基-D-葡糖胺盐。
2.3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸的二-(N-甲基-D-葡糖胺)盐。
3.药物组合物，包括权利要求1或权利要求2所述的盐和药物上可接受的载体或稀释剂。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述的载体或稀释剂为含水溶剂。
5.权利要求4所述的药物组合物，进一步包括环糊精。
6.权利要求5所述的药物组合物，进一步包括羟丙基-β-环糊精。
7.权利要求3所述的组合物，其中进一步包括至少一种另外的活性剂。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述另外的活性剂为抗病毒药。
9.权利要求7所述的组合物，其中所述另外的活性剂为免疫调节剂、抗癌药、抗细菌剂、抗真菌药或其组合。
10.权利要求2所述的盐制备用于治疗HIV感染的药物的用途。
11.权利要求3所述的药物组合物制备用于治疗HIV感染的药物的用途。
12.权利要求4所述的药物组合物制备用于治疗HIV感染的药物的用途。
13.权利要求5所述的药物组合物制备用于治疗HIV感染的药物的用途。
14.权利要求6所述的药物组合物制备用于治疗HIV感染的药物的用途。
15.制备权利要求1所述的盐的方法，该方法包括将N-甲基-D-葡糖胺与3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸在含水溶剂中混合而得到3-O-(3′，3′-二甲基琥珀酰基)桦木酸，N-甲基-D-葡糖胺盐。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的混合在有羟丙基-β-环糊精存在下进行。
17.包括权利要求3所述的药物组合物的剂型。
18.权利要求17所述的剂型，其中该剂型为固体口服剂型、非肠道剂型、液体剂型、混悬液剂型或直肠栓剂。
19.权利要求17所述的剂型，其中该剂型为片剂。
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