CN100579534C - S-腺苷同型半胱氨酸在制药中的应用 - Google Patents

S-腺苷同型半胱氨酸在制药中的应用 Download PDF

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本发明公开了一种S-腺苷同型半胱氨酸的医学用途，通过对AdoHcy能够抑制DNFB诱导的小鼠迟发性超敏反应，AdoHcy能够抑制卵清蛋白(OVA)诱导的抗原特异性免疫反应，AdoHcy能够阻止髓磷脂少突细胞糖蛋白35-55肽段(MOG 35-55)诱导实验性自身免疫性脑脊髓膜炎，AdoHcy能够改善MRL-lpr/lpr小鼠自发性红斑狼疮疾病的症状实验，证明S-腺苷同型半胱氨酸具有明显的免疫抑制作用，具有高效低毒的优点，可用于制备免疫抑制剂。

Description

S-腺苷同型半胱氨酸在制药中的应用
技术领域
本发明涉及在生物体氨基酸代谢过程中，S-腺苷蛋氨酸在甲基转移酶的作用下，将甲基转移给其他物质，参与生成多种含甲基的重要生物活性物质如蛋白质、脂质和核酸。更具体地说是体内的S-腺苷蛋氨酸通过上述反应提供甲基后，转变为S-腺苷同型半胱氨酸(S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine，AdoHcy)，而S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷蛋氨酸依赖的转甲基反应强大的抑制剂。
背景技术
在生物体氨基酸代谢过程中，S-腺苷蛋氨酸在甲基转移酶的作用下，将甲基转移给其他物质，参与生成多种含甲基的重要生物活性物质如蛋白质、脂质和核酸。体内的S-腺苷蛋氨酸通过上述反应提供甲基后，转变为S-腺苷同型半胱氨酸(S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine，AdoHcy)，而S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷蛋氨酸依赖的转甲基反应强大的抑制剂。
蛋白质、脂质、核酸(尤其是mRNA)等生物分子的甲基化对于维持细胞的活性是必需的，一些细胞膜信号分子的翻译后加工也需要甲基化的参与。以前的研究表明，甲基化抑制剂S-腺苷同型半胱氨酸能影响脑内神经物质代谢，防治神经细胞缺血坏死，具有诱导睡眠和抗惊厥的作用。文献也表明S-腺苷同型半胱氨酸是一个安全无毒的甲基化抑制剂。但是迄今为止，S-腺苷同型半胱氨酸在体内对于免疫系统的影响一直没有研究。我们在此进行了大量的S-腺苷同型半胱氨酸体内免疫抑制活性研究。
Figure C20051010846600031
发明内容
本发明的目的是提供S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)的医学用途。
S-腺苷同型半胱氨酸是生物体氨基酸代谢过程中的代谢中间产物。本发明对S-腺苷同型半胱氨酸在体内的药效药理学研究中发现并证明，AdoHcy体内给药能产生强烈的抗炎免疫抑制活性作用。AdoHcy作为新型抗炎免疫抑制药物有非常好的研究和开发应用前景，将有可能用于治疗自身免疫性疾病、严重过敏性疾病、糖尿病等与机体免疫系统的功能及反应状态异常有关疾病，以及用于预防器官等移植后的排斥反应。
经动物试验证明，S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)具有如下免疫抑制活性：
(一)AdoHcy能够抑制DNFB诱导的小鼠迟发性超敏反应
(二)AdoHcy能够抑制卵清蛋白(OVA)诱导的抗原特异性免疫反应
(三)AdoHcy能够阻止髓磷脂少突细胞糖蛋白35-55肽段(MOG 35-55)诱导实验性自身免疫性脑脊髓膜炎
(四)AdoHcy能够改善MRL-lpr/lpr小鼠自发性红斑狼疮疾病的症状
附图说明
图1是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能抑制OVA免疫诱导小鼠的淋巴细胞对抗原特异性刺激的增殖反应。A是抑制脾淋巴细胞对OVA的反应；B是抑制淋巴结细胞对OVA的反应。
图2是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能抑制OVA免疫诱导小鼠的淋巴细胞对抗原特异性刺激的细胞因子产生。A是抑制脾淋巴细胞对OVA的反应；B是抑制淋巴结细胞对OVA的反应。
图3是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能抑制抗OVA特异性抗体的产生。
图4是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能有效抑制MOG 35-55诱导的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的发病严重程度。
实心园圈代表EAE模型组，空心圆圈代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸给药组
图5是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能有效抑制MOG 35-55诱导的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的淋巴细胞对抗原特异性刺激的增殖反应。A是抑制脾淋巴细胞对MOG 35-55的反应：B是抑制淋巴结细胞对MOG 35-55的反应。
黑色条图代表EAE模型组，灰色条图代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸给药组
图6是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能有效抑制MOG 35-55诱导的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的淋巴细胞对抗原特异性刺激的细胞因子产生。左面两图；抑制脾淋巴细胞对MOG 35-55的反应；右面两图：抑制淋巴结细胞对MOG 35-55的反应。
黑色条图代表EAE模型组，灰色条图代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸给药组
具体实施方式
实验药物、动物及材料
药物名称：S-腺苷同型半胱氨酸S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine)，MW：384.4。
实验动物：实验采用Balb/c小鼠，C57BL/6小鼠，6-8周龄，全为雌性小鼠，购于中科院上海实验动物中心，动物合格证书号：中科沪动管第99-003号。MRL-lpr/lpr小鼠从日本引进，由中科院上海药物研究所SPF级动物房繁育提供。动物饲养于中科院上海药物所清洁级动物房，12小时光/暗循环，24℃室温，50-60％湿度。
试剂：
百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)和Ovalbumin(grade V)购自Sigma公司(St.Louis，MO.USA)。
完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant，CFA)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis H37Ra)购自Difco公司(Detroit，MI，USA)。MOG 35-55由上海生工生物工程技术有限公司合成(Shanghai，P.R.China)。
ELISA试剂盒为Pharmegen公司产品。
RPMI-1640培养液及小牛血清为GIBCOL公司产品。
[3H]-胸腺嘧啶核苷为上海原子能研究所产品，其余试剂均为国产分析纯。
实验方法：
[一]迟发性超敏反应动物模型(DTH)
1.Day0，Balb/c小鼠(雌性，6-8周龄)每只后脚以20ul 0.5％DNFB致敏。次日加强。(DNFB溶于[丙酮∶橄榄油＝4∶1]油剂中)；
2.Day(7-9)，鼠左耳内外两侧各10ul 0.4％DNFB进行攻击；
3.攻击前1小时腹腔注射一次。12小时后，再给药一次；
4.攻击后24-48小时，检测各指标。
实验数据表1.
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能抑制DNFB诱导的小鼠迟发性超敏反应(抑制耳肿胀程度)
Figure C20051010846600051
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)抑制DNFB诱导的小鼠迟发性超敏反应(DTH)
我们选用了经典的小鼠DTH反应模型。DTH实验是一种体内检测细胞介导免疫功能的方法，与接触性超敏反应相似。DTH也包括致敏和触发两个阶段。致敏约需要6天，在触发后的24～48小时DTH的炎症反应达到高峰。在初始的致敏阶段有记忆性的抗原特异性细胞分布到外周各淋巴组织，在任何局部的抗原刺激会使这些细胞迅速活化引起DTH。结果显示，体内腹腔给药AdoHcy剂量在0.2，1和5mg/kg时，能显著抑制耳肿胀程度，与对照组相比抑制率分别22.9％，28.5％和39.1％(见实验数据表)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
[二]卵清蛋白(OVA)诱导的抗原特异性免疫反应
将OVA(2mg/ml)与等体积的CFA充分乳化，给雌性C57BL/6小鼠背部皮下注射(100μl/只)。为了探讨S-腺苷同型半胱氨酸的免疫抑制作用，我们将OVA免疫的小鼠随机分成4组；①模型对照组；腹腔注射等体积的PBS，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸低剂量组(0.2mg/kg/d，i.p.)；③S-腺苷同型半胱氨酸中剂量组(1mg/kg/d，i.p.)；④S-腺苷同型半胱氨酸高剂量组(5mg/kg/d，i.p.)。
免疫后21天处死小鼠，无菌取脾脏和淋巴结细胞(腋窝和腹股沟)，制成单细胞悬液，计数。调细胞浓度为5×106/ml，加入96孔培养板中(100μl)，RPMI 1640和OVA(终浓度100μg/ml)分别加入，终体积200μl，每实验组设3个复孔。细胞于含5％CO2的培养箱中培养3天，用3H掺入法测细胞增殖；培养2天收上清，用ELISA检测细胞因子IL-2、INF-γ和IL-4。
免疫后第21天摘眼球取血，用ELISA检测血清中OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG3。结果用OD570±S.E.M表示。
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)抑制OVA诱导的抗原特异性免疫反应
卵清蛋白(OVA)免疫的小鼠，体外用100μg/ml OVA能诱导脾细胞和淋巴结细胞抗原特性增殖，产生细胞因子自介素-2(IL-2)、γ-干扰素(INF-γ)和白介素-4(IL-4)。S-腺苷同型半胱氨酸(1和5mg/kg/d)给药21天明显抑制脾细胞和淋巴细胞OVA特异性增殖反应(见实验数据图1A和1B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；S-腺苷同型半胱氨酸对淋巴细胞产生Th1型细胞因子(IL-2和INF-γ)的抑制作用明显强于Th2型细胞因子(IL-4)(见实验数据图2A和2B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；对降低血中抗体总IgG的水平，IgG2a和IgG3的抑制作用也明显强于IgG1(见实验数据图表3)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
[三]MOG 35-55诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎
将MOG 35-55(4mg/ml)与等体积的CFA(含4mg/ml Mycobacterium tuberculosisH37Ra)充分乳化，给雌性C57BL/6小鼠背部皮下注射(100μl/只)。在免疫当天和免疫后48小时腹腔注射PTX(400ng/只)。免疫后按体重年龄将小鼠随机分成2组：①模型对照组(9只)：腹腔注射等体积的磷酸缓冲液(Phosphate-buffered saline，PBS)，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸给药组(10只)：腹腔注射5mg/kg AdoHcy，每天1次。
实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的临床评分采用常用的5分制。评分标准如下：0分，没有明显疾病症状；1分，尾巴张力消失或者后肢无力；2分，尾巴张力消失和后肢无力；3分，后肢部分瘫痪；4分，后肢完全瘫痪；5分，濒死状态或者死亡。免疫后每天观察小鼠的状态和临床评分。
实验结束时处死小鼠，无菌取脾脏和淋巴结细胞(腋窝和腹股沟)，制成单细胞悬液，计数。调细胞浓度为5×106/ml，加入96孔培养板中(100μl/Well)，RPMI 1640和MOG 35-55(终浓度10μg/ml)分别加入，终体积200μl，每实验组设3个复孔。细胞于含5％CO2的培养箱中培养3天，用3H掺入法测细胞增殖；培养2天收上清，用ELISA检测细胞因子IL-2和INF-γ。
AdoHcy抑制MOG 35-55诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎
3.1.AdoHcy抑制MOG 35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓膜炎
在MOG 35-55免疫C57BL/6小鼠当天腹腔注射AdoHcy(5mg/kg/d)，能明显降低EAE的发病率(模型组发病率8/9，AdoHcy给药组发病率3/10)，延迟EAE的发病时间(模型组7天开始发病，平均发病时间为12天；AdoHcy给药组14天开始发病，平均发病时间为15天)。如(见实验数据图4)所示，AdoHcy能明显降低平均临床评分，减轻疾病的严重程度。
3.2AdoHcy抑制MOG 35-55诱导淋巴细胞增殖和Th1细胞因子的产生
MOG 35-55免疫的小鼠，体外用10μg/ml MOG 35-55能诱导脾细胞和淋巴结细胞抗原特性增殖以及Th1型细胞因子IL-2和INF-γ的产生；而AdoHcy给药24天能明显抑制淋巴细胞MOG 35-55特异性增殖反应(见实验数据图5A和5B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；AdoHcy给药24天能明显抑制淋巴细胞MOG 35-55特异性IL-2和INF-γ的产生(见实验数据图6)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
[四]MRL-lpr/lpr小鼠自发性红斑狼疮疾病
将16周雌性MRL-lpr/lpr小鼠随机分成2组：①模型对照组(10只)：腹腔注射等体积的磷酸缓冲液(Phosphate-buffered saline，PBS)，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸给药组(10只)：腹腔注射5mg/kg AdoHcy，每天1次。连续给药8周致24周左右，处死小鼠。称体重，取脾脏和淋巴结、称重并计数。
[五]AdoHcy改善MRL-lpr/lpr小鼠自发性红斑狼疮疾病的症状
S-腺苷同型半胱氨酸(5mg/kg/d，i.p.)给药8周对MRL-lpr/lpr小鼠体重没有明显影响，提示其在体内没有明显的毒性。S-腺苷同型半胱氨酸明显降低取脾脏和淋巴结的重量，减少脾细胞计数，抑制自发性红斑狼疮模型动物过渡激活的免疫系统，改善疾病的症状(见实验数据下表)，(*P≮0.05；**P＜0.01)。
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)体内给药能有效改善MRL-lpr/lpr小鼠自发性红斑狼疮疾病的症状
Figure C20051010846600081
结论：
在体内实验中S-腺苷同型半胱氨酸对于DTH反应模型的小鼠的耳肿胀程度都具有显著的抑制作用，能够抑制卵清蛋白(OVA)诱导的抗原特异性免疫反应，防治实验性自身免疫性脑脊髓膜炎，改善MRL-lpr/lpr小鼠自发性红斑狼疮疾病的症状。试验证明一种S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的组合物在制备免疫抑制药物中应用。可以进一步将其开发成为高效低毒的免疫抑制药物，如在无菌条件下被制成液体剂型如针剂、溶液，或者是口服剂型如片剂和胶囊等。由于这些技术都是药物研发领域的常规技术手段，因此不再赘述。

Claims (1)

1、一种S-腺苷同型半胱氨酸的用途，其特征在于所述的S-腺苷同型半胱氨酸在制备治疗自发性红斑狼疮疾病的药物中的应用。
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