CN100552026C - 固定化黑芥子酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及固定化黑芥子酶及其制备方法。采用十字花科蔬菜种子，特别是西兰花种子，在提取黑芥子酶过程中添加甘油、EDTA、DTT保护酶活性；在4℃低温下操作，完成去杂质获得酶初提液；在固定化步骤中添加海藻酸钠，在不影响酶活性的温度下溶解混合，滴入氯化钙溶液制成海藻酸钙小颗粒，用戊二醛溶液处理颗粒，将游离的黑芥子酶固定化。本发明的固定化方法，使固定化后黑芥子酶的活力达到游离酶的70.84%；催化反应的pH值稳定范围从原来的5～7增宽到4～9，耐热能力从原来的55℃提高到65℃；黑芥子酶使用次数从原来的1次，增加到3次以上。

Description

固定化黑芥子酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种固定化酶及其制备，具体为一种从植物中分离并直接固定化的黑芥子酶，及其制备方法。

背景技术

黑芥子酶主要存在于十字花科植物中。在一定的条件下，黑芥子酶可以将硫代葡萄糖苷分解，生成葡萄糖、硫酸盐、异硫代氰酸盐、乙腈、硫氰酸盐等物质。其中许多异硫代氰酸盐具有生物活性，具有比较好的抗癌效果。

目前，在国际上有多种从不同十字花科植物中提取分离黑芥子酶的报道，但游离的黑芥子酶存活时间很短，在酶解催化反应中也很难重复使用，因为该酶含有6对二硫键，酶在提纯过程中容易受重金属离子危害，并对氧化还原很敏感。而其粗酶往往混有蛋白酶等，也容易造成其水解失活。因此，该酶难以作为酶制剂应用于工业中。如果将游离的黑芥子酶固定化，可以提高该酶的利用率，使之能适合于现代工业应用的要求，这对于黑芥子酶的工业化应用显得十分有意义。

将游离酶的催化活动完全或基本上限制在一定空间内的过程称为固定化。它解决了酶的工程化应用中存在的问题，极大地提高了酶的应用价值，促进了酶工程地飞跃发展。日本在上世纪六十年代就实现了固定化酶的工业化应用，在世界上开创了固定化酶应用于工业生产的先例。我国固定化酶的研究起步较晚，开始于1970年。目前能够采用固定化技术的酶种类还比较少。采用固定化酶技术大规模生产的企业更少。其原因一方面是适合固定化的酶，其底物和产物分子量应该都比较小。另一方面是酶固定化后容易失活。

黑芥子酶的固定化研究目前还未见报道。黑芥子酶作用对象硫代葡萄糖苷和酶解产物分子量都比较小，属于可以使用固定化技术的酶。黑芥子酶的分子量和一些蛋白酶的分子量差异比较小，其分离比较困难。如果将黑芥子酶粗酶进行固定化就可以减少蛋白酶对其的攻击，延长其使用时间。黑芥子酶又可以重复使用。但是黑芥子酶含有大量二硫键，是一种容易失活的酶。其固定化难度比较大。

发明内容

本发明经过多次试验，获得了比较好的黑芥子酶固定化方法。本发明的目的是提供一种固定化黑芥子酶，并提供适合于黑芥子酶的固定化方法。

本发明提供的固定化黑芥子酶，是从十字花科蔬菜种子或植株中分离获取黑芥子酶，制成2mm～3mm的海藻酸钙凝胶珠，硬化后用戊二醛交联而成。

本发明的固定化黑芥子酶其制备方法包括以下步骤：

(1)按每克十字花科蔬菜种子粉末加3毫升pH为6.0的磷酸缓冲液计加入磷酸缓冲液，搅拌过滤除杂后，再4℃低温离心去杂质，获黑芥子酶液；所述磷酸缓冲液中含5％体积份的甘油，1mM EDTA，3mM DTT；

(2)按体积/重量比计在上述酶液中加80％硫酸铵，4℃低温静置2小时后，在4℃条件下离心，获得酶沉淀，4℃下蒸馏水透析2小时，获得液体酶；

(3)在液体酶中加入海藻酸钠，添加量为每100毫升酶液加入3.5～4.5毫克海藻酸钠，35℃～45℃水浴溶解海藻酸钠，将混合液呈小滴状滴加到2％～3％氯化钙水溶液中，形成直径2mm～3mm的海藻酸钙凝胶珠；

(4)将海藻酸钙凝胶珠在3℃～5℃静置硬化2小时，用蒸馏水洗涤后，取颗粒加入到0.15％～0.3％的戊二醛溶液交联4小时，再用蒸馏水洗涤，得到固定化黑芥子酶颗粒，在3℃～5℃密封保存。

步骤(1)所述十字花科蔬菜种子选用西兰花种子可以提高固定化黑芥子酶的活性。

上述步骤概括如下：

将西兰花种子或其他十字花科蔬菜种子碎成粉末，加pH为6.0的磷酸缓冲液，其中含5％甘油，1mM EDTA，3mM DTT，将其搅拌后纱布过滤，将滤液在4℃下，12000×g离心20min，收集上清夜，按体积重量比加80％硫酸铵，在4℃下静置2h后，4℃下12000×g离心20min，收集沉淀，4℃下蒸馏水透析2h，截留分子量为14000D，取透析袋内酶液，将海藻酸钠加入酶液中混合，海藻酸钠添加量为3.5～4.5％(w/v)，35℃～45℃水浴溶解海藻酸钠后，将混合液呈小滴状加入到氯化钙溶液中，氯化钙含量为2％～3％(w/v)，形成2mm～3mm的海藻酸钙凝胶珠，于3℃～5℃硬化2小时后蒸馏水洗涤，再加入到戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液浓度为0.15％～0.3％(w/v)，交联4小时后蒸馏水洗涤，获得的固定化黑芥子酶于3℃～5℃密封保存。

本发明方案中：二硫苏糖醇(DTT)可以保护游离巯基免被氧化。乙二胺四乙酸(EDTA)是金属螯合剂，能避免酶受重金属离子危害。甘油对不少酶具有保护作用，防止蛋白质脱水。

当海藻酸钠浓度小于3％，清洗酶珠会造成酶的较多损失；当海藻酸钠浓度超过4.5％时，酶活力下降。酶解反应时扩散阻力大，粘度大制粒难度。选用4％海藻酸钠对酶进行固定化最为适宜。

戊二醛作为一种双功能交联剂，可以使海藻酸钠分子发生交联，同时也能使酶交联在载体上，能够增强海藻酸钠的机械强度和固定化酶的稳定性。戊二醛浓度低于0.15％时，所固定的酶比较少；当戊二醛浓度为0.2％时，固定化酶相对酶活最高；继续增加戊二醛浓度达到0.3％以上，由于酶分子活性基团被戊二醛过多修饰，酶活力明显下降。

具体实施方式

下面通过以十字花科植物西兰花的种子为实例，进一步说明本发明，其具体实施工艺流程如下：

200g西兰花种子碎成粉末后加600ml缓冲液，缓冲液为pH为6.0的磷酸缓冲液，其配制方法为：300ml 0.1mol/L磷酸二氢钾+33.6ml 0.1mol/LNaOH，含5％甘油，1mM EDTA，3mMDTT。搅拌后纱布过滤，滤液在4℃下，12000×g离心20min，收集上清夜，加入固体硫酸铵，使达到80％饱和度，在4℃下静置2h后，4℃下12000×g离心20min，收集沉淀，用少量的蒸馏水溶解，4℃下蒸馏水透析2h(截留分子量14000D)，透析袋内液体为黑芥子酶液。取100ml的酶液加水稀释到500ml，加海藻酸钠混合。按重量/体积比计，海藻酸钠最终浓度为4％。37℃水浴溶解海藻酸钠，将海藻酸钠和黑芥子酶的混合液呈小滴状加入到氯化钙溶液中，氯化钙浓度为2.0mol/L，形成直径为2mm～3mm的海藻酸钙凝胶珠，于4℃硬化2小时后过滤，再用蒸溜水洗涤，将硬化后的海藻酸钙凝胶珠加入到1L戊二醛溶液交联4小时，戊二醛溶液浓度为0.2％，用蒸溜水洗涤后获固定化黑芥子酶，4℃密封保存。

本发明的固定化方法，使固定化后黑芥子酶的活力达到游离酶的70.84％(含相同酶量，通过HPLC测定sinigrin酶解后的减少量确定)；催化反应的pH值稳定范围从原来的5～7增宽到4～9，耐热能力从原来的55℃提高到65℃；黑芥子酶使用次数从原来的1次，增加到3次以上。

Claims (3)

1.固定化黑芥子酶，其特征在于：其通过从十字花科蔬菜种子或植株中分离获取黑芥子酶，制成2mm～3mm的海藻酸钙凝胶珠，硬化后用戊二醛交联而获得。

2.如权利要求1所述固定化黑芥子酶的制备方法，其特征在于以下步骤：

(1)按每克十字花科蔬菜种子粉末加3毫升pH为6.0的磷酸缓冲液计加入磷酸缓冲液，搅拌过滤除杂后，再4℃低温离心去杂质，获黑芥子酶液；所述磷酸缓冲液中含5％体积份的甘油，1mM EDTA，3mM DTT；

(2)在上述酶液中加入固体硫酸铵，使达到80％饱和度，4℃低温静置2小时后，在4℃条件下离心，获得酶沉淀，4℃下蒸馏水透析2小时，获得液体酶；

(3)在液体酶中加入海藻酸钠，添加量为每100毫升酶液加入3.5～4.5毫克海藻酸钠，35℃～45℃水浴溶解海藻酸钠，将混合液呈小滴状滴加到2％～3％氯化钙水溶液中，形成直径2mm～3mm的海藻酸钙凝胶珠；

(4)将海藻酸钙凝胶珠在3℃～5℃静置硬化2小时，用蒸馏水洗涤后，取颗粒加入到0.15％～0.3％的戊二醛溶液交联4小时，再用蒸馏水洗涤，得到固定化黑芥子酶颗粒，在3℃～5℃密封保存。

3.如权利要求2所述固定化黑芥子酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述十字花科蔬菜种子选用的是西兰花种子。