CN100548311C - 硒代硫酸钠在制备临床补硒和治疗癌症药物中的应用及快速制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硒代硫酸钠的新用途，即补充硒和改善癌症化疗药物治疗效果中的应用，以及硒代硫酸钠的快速制备方法。本发明证明使用硒代硫酸钠，能有效降低化疗药的毒性，大幅提高化疗药的治愈率。本发明硒代硫酸钠的快速制备方法解决了硒代硫酸钠不稳定的问题，该方法采用亚硒酸钠、还原剂与亚硫酸钠三者按一定比例的混合，能快速形成硒代硫酸钠，可以保证简易快捷获取新鲜的硒代硫酸钠，使临床上利用硒代硫酸钠补充硒或改善化疗药治疗效果易于实施。

Description

硒代硫酸钠在制备临床补硒和治疗癌症药物中的应用及快速制备方法

技术领域

本发明涉及硒代硫酸钠的新用途，确切地说是硒代硫酸钠在补充硒和改善癌症化疗药物治疗效果中的应用，以及硒代硫酸钠的快速制备方法。

背景技术

硒是人体必需的微量元素。硒半胱氨酸是谷胱甘肽过氧化物酶、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶、蛋氨酸亚砜还原酶、碘甲腺原氨酸脱碘酶活性中心，参与机体抗氧化和能量代谢。此外，高剂量硒有抑制癌细胞生长、杀伤癌细胞作用。

已知高危病人在重症病房监护期通过注射补充高剂量亚硒酸钠，其生存质量明显改善，死亡率明显下降。由于亚硒酸钠是一种具有很强毒性的硒形式，硒的有益剂量与有害剂量范围很窄，因此临床上需要一种具有和高剂量的亚硒酸钠具有相同生物活性的但毒性更低的硒形式来替换它。

化疗具有导致病人的白细胞下降、腹泻、呕吐、水肿等副作用，甚至会威胁到病人自身生命，这些副作用严重地限制了化疗药的用量和治疗效果。已有的研究表明，亚硒酸钠能够降低顺铂毒性，但不影响其疗效，从而允许高剂量顺铂的应用，进而增强顺铂抗肿瘤作用。然而，这些研究使用的亚硒酸钠剂量都处于毒性水平(0.5-2mg Se/kg)，长期使用会影响到它和化学药物合并治疗的效果。由于硒的有益与有毒剂量之间范围十分窄，因此在药理剂量上补充硒以及在和化学药物合并治疗癌症的应用上，采用自身的毒性较低的硒化合物才能保证它们的安全实施。

硒代硫酸钠(sodium selenosulfate)是一种不稳定的无机硒化合物，所以无市售产品。它被广泛用于含硒纳米材料的制备，如用硒代硫酸钠制备纳米硒化铜、硒化镉、硒化铅等。硒代硫酸钠的制备通常是采用零价元素硒粉末与亚硫酸钠混合，摩尔质量比(硒/硫)达1∶3至1∶6范围，在80至100℃回流2至4小时，亚硫酸钠过量对于新生的硒代硫酸钠的稳定时间十分重要，亚硫酸钠愈多，稳定时间愈久，一般是将新制备的硒代硫酸钠很快用于含硒纳米材料的制备。硒代硫酸钠是一种含硒化合物，关于硒代硫酸钠的补硒效应以及与硒相关的生物学功能未见任何报道。

发明内容

本发明针对硒毒性的现实问题，试图寻找能够替代亚硒酸钠的安全性更高的硒化合物。

本发明旨在提供硒代硫酸钠的新用途，即硒代硫酸钠在补充硒和改善癌症化疗药物治疗效果中的应用。

本发明的另一目的是：提供硒代硫酸钠的快速制备方法。

本发明证明在药理剂量硒代硫酸钠与亚硒酸钠补充硒能力相同，见图1两者结构式，有趣的是硒代硫酸钠对正常组织的毒性显著低于亚硒酸钠，而对癌细胞的毒性又显著高于亚硒酸钠，这些特点显示使用硒代硫酸钠的合理性。

本发明证明使用硒代硫酸钠，在药理剂量它产生与亚硒酸钠同样有效的补硒效果，但毒性明显低于亚硒酸钠；硒代硫酸钠能有效降低化疗药的毒性，大幅提高化疗药的治愈率，这些性质显示出利用它的必要性。但是，临床上长期使用硒代硫酸钠补充硒和改善化疗药的治疗效果，面临着硒代硫酸钠不稳定的问题，这就需要它在临用前制备。而已知的制备方法是将零价元素硒粉与亚硫酸钠混合，在高温回流几小时，显然这不易于在临床上推广使用。为方便获得硒代硫酸钠，本发明采用亚硒酸钠、还原剂与亚硫酸钠三者按一定比例的混合，能快速形成硒代硫酸钠。

具体的快速制备方法如下：

将亚硒酸钠、还原剂与亚硫酸钠三者按一定比例的混合。

一种操作方法是：亚硒酸钠被含巯基的还原剂还原。还原剂可以是谷胱甘肽、或半胱氨酸、或N-乙酰半胱氨酸、或硫辛酸等，它们与亚硒酸钠混合以后形成RS-Se-SR，在酸性下稳定，在中性与碱性下转化为零价硒。在亚硒酸钠与还原剂的混合物中加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的弱碱性作用使RS-Se-SR产生零价硒，亚硫酸钠与这些新生的零价硒迅速反应瞬间形成硒代硫酸钠。

另一种操作方法是：亚硒酸钠被其他类型的还原剂还原。还原剂可以是抗坏血酸，二氧化硫等不含巯基的物质，它们与亚硒酸钠混合以后形成零价元素硒。在亚硒酸钠与还原剂的混合物中加入亚硫酸钠，亚硫酸钠与零价元素硒反应快速形成硒代硫酸钠。

这些手段可以保证简易快捷获取新鲜的硒代硫酸钠，使临床上利用硒代硫酸钠补充硒或改善化疗药治疗效果易于实施。

附图说明

图1为硒代硫酸钠和亚硒酸钠的化学结构式，

图2为小鼠平均体重图，

图3为小鼠生存曲线图，

图4为血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)变化图，

图5为亚硒酸钠作用后的肝组织切片图，

图6为硒代硫酸钠作用后的肝组织切片图，

图7为硒对HepG2癌细胞的杀伤(A)和生长抑制作用(B)图，

图8为硒对GaGo2癌细胞的杀伤(A)和生长抑制作用(B)图，

图9为不同尺寸元素硒的电镜观察图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。

实施例1：药理剂量硒代硫酸钠与亚硒酸钠补充硒的效果比较

已报道高剂量亚硒酸钠能改善重症疾病病人的症状，提高化疗药治疗癌症的疗效。硒代硫酸钠在这些药理剂量上与亚硒酸钠补硒效果是否有区别尚无研究。在本例中，使用缺硒小鼠，腹腔注射亚硒酸钠和硒代硫酸钠0.5和1mg Se/kg，连续一周。测定酶活力和硒，以比较两者补充硒的差别。

实验动物：缺硒昆明小鼠，雄性，体重20-23克，购于安徽医科大学实验动物中心。给药方案：取35只小鼠，随机分为5组，每组7只。对照组注射生理盐水，其余组分别注射不同剂量(0.5和1mg Se/kg)的亚硒酸钠和硒代硫酸钠，连续7天。生化指标测定：未次补硒24小时后眼静脉取血，离心取血清，测定其中的硒态和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力；同时取肝和肾，-30℃冻存。取部分肝肾组织测定硒。取部分肝肾匀浆，离心取上清，测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力以及肝中谷胱甘肽硫转移酶(GST)的活力。统计学处理：数据以平均值±标准差表示，用ANOVA检验处理间显著性差异，P值小于0.05被认为有显著性差别。

实验结果与结论：实验结果如表1所示，硒代硫酸钠和亚硒酸钠都能有效增加组织硒水平，组织内GPx活力以及GST活力，两者在药理剂量上的生物活性没有区别。因此临床上如需要使用高剂量硒，采用硒代硫酸钠与采用亚硒酸钠同样有效。显然两者在毒性上有无差别是取舍的关键，因为硒的药理剂量与毒性剂量非常贴近，甚至某些药理剂量已有毒性后果。

表1药理剂量下硒代硫酸钠与亚硒酸钠的生物活性比较

注：血清、肝和肾中的基础硒分别为0.07微克/毫升血清，0.15微克/克肝和0.44微克/克肾。血清，肝和肾中的GPx活力基础值分别为525.5单位/毫升血清、88.5单位/毫克蛋白和142.8单位/毫克蛋白。肝中GST活力基础值4071.4单位/毫克蛋白。

实施例2：硒代硫酸钠与亚硒酸钠对正常组织的毒性比较

实验动物：足硒昆明小鼠，雄性，体重23±1克，购于中国科学院上海实验动物中心。给药方案：50只小鼠随机分为5组，每组10只。对照组，腹腔注射生理盐水；硒代硫酸钠和亚硒酸钠各2组，每日分别按照2和3mg Se/kg的剂量腹腔注射，连续14天。低剂量组末次给硒24h后脱臼处死小鼠。动物状态：每天记录一次动物体重和死亡情况。生化指标：眼静脉取血，检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力。病理：取肝组织，送检，切片采用HE染色。统计学处理：数据以平均值±标准差表示，用ANOVA检验处理间显著性差异，P值小于0.05被认为有显著性差别。

实验结果与结论：图2显示，与正常对照相比，高剂量硒能压制小鼠生长，但在同等硒水平时，亚硒酸钠压制显著强于硒代硫酸钠。图3显示，在2mg Se/kg剂量，亚硒酸钠造成了20％动物死亡，但是硒代硫酸钠不造成动物死亡；在3mg Se/kg剂量，亚硒酸钠造成了90％动物死亡，但是硒代硫酸钠仅造成20％动物死亡，两硒组间差异显著，P＜0.001。图4显示，2mg Se/kg亚硒酸钠造成明显肝毒性，ALT和AST显著升高；硒代硫酸钠则没有这一现象，并和亚硒酸钠组有明显区别(所有P＜0.001)。图5显示，2mgSe/kg亚硒酸钠造成了明显的肝毒性，病理切片中多达80％的范围都发生了中度水样或脂肪性变性，并有点状坏死灶。图6显示，硒代硫酸钠肝组织切片中仅有20％范围发生了轻微程度的水样变性。这些结果一致地说明硒代硫酸钠对正常组织的毒性低于亚硒酸钠。

临床上补充高剂量硒能增强含硒酶活力，如谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，它能清除机体内的过剩的过氧化氢，起到维持机体抗氧化反应平衡的作用；高剂量硒还能诱导机体的二相脱毒酶，如谷胱甘肽硫转移酶(GST)，它能脱毒有害物质和清除脂质过氧化物，起到脱毒维持机体抗氧化反应平衡的作用；高剂量硒能抑制与炎症有关的转录因子(NF-κB)，降低其转录效率，使诱导型一氮化氮合成酶和诱导型环氧合酶水平下降，从而使与炎症有关的小分子如一氧化氮和前列腺素水平下降，起到抗炎作用。因此临床上补充高剂量亚硒酸钠对一些重症疾病患者产生了改善生存质量和降低死亡率的良好效应。从表1可见，由于亚硒酸钠与硒代硫酸钠两者在药理剂量上补充硒能力、增加GPx和GST活力是相同的，显然临床上使用硒代硫酸钠补充药理剂量的硒更安全。

实施例3：硒代硫酸钠与亚硒酸钠对癌细胞的毒性比较

细胞培养：人肝癌细胞HepG2和人肠癌细胞CaCo2细胞使用EMEM细胞培养基，含10％胎牛血清。细胞培养条件为37℃和5％CO₂。细胞杀伤处理：在96孔板上每孔加入5000个癌细胞，24小时后更换为含有不同浓度硒的培养基，72小时用MTT方法测定细胞数，每个处理设3个平行，数据用相对于未加硒细胞数的百分数表示。细胞增殖处理：在96孔板上每孔加入1000个HepG2或CaCo2细胞，24小时后更换为含有12.5μM硒的培养基，设为0天，分别在第0、2、4和6天用MTT方法测定细胞数，每个处理设8个平行，数据用相对于0天细胞数的百分数表示。MTT测定：终止培养前4小时每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，终止培养时弃上清，用盐酸异丙醇(100μl/孔)溶解甲赞颗粒，在酶标仪595nm读值。

实验结果与结论：在6-18μM水平，硒代硫酸钠对HepG2癌细胞有剂量依赖的杀伤作用，亚硒酸钠效应远低于硒代硫酸钠(图7A)。在12.5μM水平，硒代硫酸钠完全抑制HepG2癌细胞增殖，而亚硒酸钠无明显效应(图7B)。在CaCo2癌细胞上也观察到相似的结果(图8A和B)。这些结果说明硒代硫酸钠针对癌细胞的毒性远大于亚硒酸钠。结合上述的两项结果，硒代硫酸钠具有低毒、在药理剂量上补充硒等效、抑制与杀伤癌细胞高效的鲜明特征，是一种优于亚硒酸钠的补充硒的硒形式。

实施例4：硒代硫酸钠改善化疗药治疗癌症的疗效

实验动物：足硒昆明小鼠，雄性，体重20～23克，购于中国科学院上海实验动物中心。给药方案：48只小鼠随机分为6组，每组8只。每只小鼠腹腔接种肝癌H22细胞悬液，细胞数20×10⁶。按照顺铂给药剂量(5、8和10mg/kg)分为3个顺铂组和2个顺铂补硒组(8和10mg/kg顺铂分别对应硒代硫酸钠0.6和0.75mg Se/kg)以及1个对照组。实验每周为一个周期，5和8mg/kg剂量总共4个周期，10mg/kg剂量总共3个周期。从每个周期第一天开始，所有顺铂组腹腔注射对应浓度顺铂，而顺铂补硒组小鼠在腹腔注射顺铂前4小时分别对应注射硒代硫酸钠0.6和0.75mg Se/kg，连续5天。首次顺铂化疗在接种癌细胞之后48时启动。记录动物死亡情况，并观察癌性腹水发展情况。统计学处理：数据以平均值±标准差表示，用ANOVA检验处理间显著性差异，P值小于0.05被认为有显著性差别。

实验结果与结论：表2显示，顺铂剂量为5mg/kg，100％小鼠死亡，此时小鼠死亡原因主要是该剂量顺铂无法抑制癌性腹水的快速发展，以致腹水过多引起动物死亡；而8和10mg/kg顺铂能够有效地压制癌性腹水，但是自身的毒性明显，造成100％和75％死亡。结合硒代硫酸钠后，8和10mg/kg顺铂小鼠死亡率下降到12.5％和25％，所有存活动物均达到治愈目的，而且之后观察50天没有腹水复发现象。单纯顺铂组治疗过程中，小鼠毛色灰暗、有竖毛和弓背现象；结合硒代硫酸钠后，尤其8mg/kg组，小鼠毛色正常、没有竖毛弓背现象。

这些结果表明，低剂量顺铂，如5mg/kg顺铂毒性不大，虽安全，但不能产生很好的治疗作用。高剂量顺铂，如8和10mg/kg顺铂虽产生很好的治疗作用，但毒性大，产生大量毒性致死作用。这里的现象是当前癌症化疗临床现实的写照。动物的存活率和存活状态都说明硒代硫酸钠降低了顺铂的毒性，并增进了顺铂的疗效。

表2硒代硫酸钠对顺铂治疗H22腹水的影响

注：*表示和对照相比，p＜0.05；n表示死亡小鼠的数目。

实施例5：利用亚硒酸钠、谷胱甘肽和亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

如上所示，使用硒代硫酸钠可以补充硒和改善化疗药的治疗效果，并且硒的安全性有所提高。但临床上长期使用硒代硫酸钠面临着硒代硫酸钠不稳定的问题，这就需要它在临用时制备。而已知的制备硒代硫酸钠的方法是将零价元素硒粉末与亚硫酸钠混合，在高温回流几小时，显然这不易于在临床上推广使用。为方便获得硒代硫酸钠，将亚硒酸钠、谷胱甘肽与亚硫酸钠三者按一定比例的混合。

谷胱甘肽(GSH)是含巯基的化合物，它与亚硒酸钠混合以后形成GS-Se-SG，在酸性下稳定，在中性与碱性下转化为零价硒。在亚硒酸钠与谷胱甘肽的混合物中加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的弱碱性作用使GS-Se-GR产生零价硒，由于新生的零价硒原子还没有聚集为零价元素硒粉末，亚硫酸钠与这些新生的零价硒迅速反应瞬间形成硒代硫酸钠。

分别配制1mM亚硒酸钠、谷胱甘肽和亚硫酸钠，以摩尔计，将1份亚硒酸钠和4份谷胱甘肽混合均匀，在此混勺液中加入3份亚硫酸钠，在室温下，2-3分钟内形成硒代硫酸钠。

配制后的三种溶液可以在零下20度冷冻保存，临用前解冻混合均匀。配制后的三种溶液还可以制成冻干粉，临用前加生理盐水或水溶解之后再混合均匀。

实施例6：利用亚硒酸钠、半胱氨酸和亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

分别配制1mM亚硒酸钠、1mM半胱氨酸和亚硫酸钠，以摩尔计，将1份亚硒酸钠和10份半胱氨酸混合均匀，在此混勺液中加入30份亚硫酸钠，在室温下，2-3分钟内形成硒代硫酸钠。

配制后的三种溶液也可以先将亚硒酸钠和半胱氨酸混合均匀，亚硫酸钠单独包装，在零下20度冷冻保存，临用前解冻混合均匀。

实施例7：利用亚硒酸钠、N乙酰半胱氨酸和亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

分别配制1mM亚硒酸钠、1mM N乙酰半胱氨酸和亚硫酸钠，以摩尔计，将1份亚硒酸钠和4份N乙酰半胱氨酸混合均匀，在此混勺液中加入20份亚硫酸钠，在室温下，2-3分钟内形成硒代硫酸钠。

配制后的三种溶液也可以先将N乙酰半胱氨酸和亚硫酸钠混合均匀，亚硒酸钠单独包装，在零下20度冷冻保存，临用前解冻混合均匀。

实施例8：利用亚硒酸钠、硫辛酸和亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

分别配制1mM亚硒酸钠、1mM硫辛酸和1mM亚硫酸钠，以摩尔计，将1份亚硒酸钠和6份硫辛酸混合均匀，在此混勺液中加入20份亚硫酸钠，在室温下，2-3分钟内形成硒代硫酸钠。

配制后的三种溶液也可以先将亚硒酸钠和亚硫酸钠混合均匀，硫辛酸单独包装，在零下20度冷冻保存，临用前解冻混合均匀。

实施例9：利用亚硒酸钠、抗坏血酸和亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

与以上利用含巯基还原剂不同的是，亚硒酸钠还可以被不含巯基的被还原剂还原。还原剂可以是抗坏血酸等不含巯基的物质，它们与亚硒酸钠混合以后形成零价硒。由于零价硒原子还没有聚集为零价元素硒粉末，在亚硒酸钠与还原剂的混合物中加入亚硫酸钠，亚硫酸钠与零价硒反应快速形成硒代硫酸钠。

分别配制1mM亚硒酸钠、1mM抗坏血酸和1mM亚硫酸钠，以摩尔计，将1份亚硒酸钠和0.3份抗坏血酸混合均匀，在此混勺液中加入4份亚硫酸钠，在室温下，2-3分钟内形成硒代硫酸钠。

配制后的三种溶液可以在零下20度冷冻保存，临用前解冻混合均匀。配制后的三种溶液还可以制成冻干粉，临用前加生理盐水或水溶解之后再混合均匀。还可以先将抗坏血酸与亚硫酸钠混合均匀后单独包装，将亚硒酸钠单独分装，临用时加入亚硒酸钠混合均匀。还可以先将亚硒酸钠与抗坏血酸混合均匀后冷冻保存，将亚硫酸钠单独分装，临用时加入亚硫酸钠混合均匀。

实施例10：利用亚硒酸钠、抗坏血酸和亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

分别配制1mM亚硒酸钠、1mM抗坏血酸和1mM亚硫酸钠，以摩尔计，将1份亚硒酸钠和10份抗坏血酸混合均匀，在此混勺液中加入30份亚硫酸钠，在室温下，2-3分钟内形成硒代硫酸钠。

实施例11：利用纳米尺寸零价元素硒与亚硫酸钠快速制备硒代硫酸钠

上述使用含巯基还原剂与不含巯基还原剂均涉及到这些还原剂将亚硒酸钠还原产生零价硒的过程，由于这些新生的零价元素硒还没来得及有效聚合，新生的零价元素硒与亚硫酸钠的反应已经开始，所以很容易迅速产生硒代硫酸钠。有报道指出，牛血清白蛋白等具有阻止零价元素硒聚合的作用，从而形成能稳定存在的纳米尺寸的零价元素硒。由于它比市售的零价元素硒粉末小得多，它可以被亚硫酸钠迅速还原。首先依文献方法制备纳米尺寸零价元素硒：使用谷胱甘肽将亚硒酸钠还原为零价硒原子，在这个氧化还原体系中加入牛血清白蛋白等具有分散吸附作用的物质，它们可以控制新生的零价硒原子聚合在纳米尺寸水平，纳米尺寸的零价元素硒在2-8℃可以长期存放，呈红色，尺寸基本不再增长，色泽基本不再改变。将存放达一年的尺寸为5-15nm零价元素硒(1mM)与亚硫酸钠(4mM)按1∶1混合，置于60℃水浴中，零价元素硒可以在1分钟内红色消失，生成硒代硫酸钠。显然，与零价元素硒粉末相比，纳米尺寸零价元素硒与亚硫酸钠反应极快，且不需高温回流。

这些手段可以保证简易快捷获取新鲜的硒代硫酸钠，使临床上利用硒代硫酸钠补充硒或改善化疗药治疗效果易于实施。

以上实施方法目的是为了举例，并不代表本发明实施仅限于举例所示内容。在实施例四中，改变化疗药形式，使用硒代硫酸钠也会有改善其治疗效果的作用；在实施例五至十中，变化还原剂形式也能快捷生成硒代硫酸钠，如在亚硒酸钠中通入二氧化硫，或加入亚硫酸钠然后再加酸使亚硫酸钠形成二氧化硫，二氧化硫使亚硒酸钠还原为零价元素硒，在零价元素硒形成后再加亚硫酸钠将其还原为硒代硫酸钠。在实施例五至十中，变化还原剂与亚硫酸钠的比例也能快捷生成硒代硫酸钠；增大亚硫酸钠浓度，可以使硒代硫酸钠的稳定时间延长。在实施例十一中，与市售零价元素硒粉末相比，使用不同纳米尺寸零价元素硒与亚硫酸钠反应均能缩短反应时间和减少反应温度。显然这些变化是本发明基础上同领域技术人员所公知的内容。

Claims (2)

1、硒代硫酸钠在制药中的应用，其特征在于：硒代硫酸钠在制备用于补充硒的药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硒代硫酸钠在制备通过补充硒而改善癌症化疗药物治疗效果的药物中的应用。

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