CN100545262C - 一种固定化微生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种固定化微生物的制备方法，涉及微生物的固定化方法。本发明用聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋材料，用硫酸钠代替传统方法中的硼酸，并通过氯化钙和硫酸钠分两步进行固化反应。采用本发明方法固定化微生物在制备过程中基本无粘连，反应试剂和反应条件对细胞活性的影响较小，无毒性，操作简便，制得的固定化微生物强度高，稳定性好，可用于连续运行。因此本发明方法可广泛应用于废水生物处理、生物制药、食品发酵和酿造工业等领域中，具有良好的应用前景和实用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物固定化技术领域，特别涉及一种微生物的固定化方法。
背景技术
生物催化剂(如酶、微生物、动植物细胞、细胞器等)通过物理或化学方法固定化后，其催化性能得以改善，使用效率大大提高。现在固化生物催化剂的应用研究，已涉及食品与发酵工业、化学合成工业、环境污染治理与检测等各个领域中。
生物固定化技术是现代生物工程领域中的一项新兴技术，应用范围涉及到生物学、有机化学、化学分析、医疗诊断、环境净化及能源生产等多个领域。其固定化的方法和条件对固定化细胞的性能有重要影响，决定了固定化细胞的强度、活性和重复使用性。目前固定化细胞的方法主要有：吸附法、包埋法和交联法，其中最常用的是包埋法。包埋法是将细胞包埋在半透性的聚合物或膜内，使细胞扩散进入多孔性的载体内部。其特点是操作简单，能保持多酶系统，对细胞的活性影响小。目前常用的包埋材料有：琼脂、海藻酸钠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等，其中，海藻酸钠固定化的细胞制备过程简便，传质性能较好，但强度较低；聚乙烯醇是对环境无污染和对细胞无毒性的优良的人工合成高分子材料，成本低廉、形成载体具有强韧的机械性能等优势。因此，海藻酸钠和聚乙烯醇是研究较多的材料，备受关注。
现有用聚乙烯醇和海藻酸钠固化细胞的方法，通常是与硼酸惊醒固化反应，如公开号为CN1696285A的“聚乙烯醇铅盐固定化酶/微生物的方法”专利，公开的是与饱和硼进行固化反应，但是硼酸对细胞的毒性较大，且制备过程中有较严重的粘连情况，不利于推广应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有用聚乙烯醇和海藻酸钠固化细胞方法的不足之处，提供一种固定化微生物的制备方法，具有能制备出活性高、机械性能和稳定性好的固定化微生物，无毒性，并解决制备过程中的粘连问题。微生物细胞被固定化后，对温度和pH值的稳定性高等特点。
实现本发明的目的技术方案是：一种固定化微生物的制备方法，用聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋材料，用硫酸钠代替传统方法中的硼酸，并通过氯化钙和硫酸钠分两步进行固化反应，具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1～1.5％的海藻酸钠溶液∶9～12％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶6～12的比例，在容器中，将1～1.5％的海藻酸钠溶液和9～12％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，制备出载体材料溶液。然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，制备出微生物混合溶液。微生物∶载体材料的质量比为1∶4～6。
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为1～5％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5～6.7，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为0.5～1小时。
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，取出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤1～3次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为2～4小时。
(4)洗涤
第(3)步完成后，取出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤1～3次，备用。
本发明的工作原理是：用聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋材料，用硫酸钠代替传统方法中的硼酸，并通过氯化钙和硫酸钠分两步进行固化反应。本发明能够很好的解决聚乙烯醇反应过程中的粘连问题，制备出的固定化微生物细胞具有较高的机械强度和活性，是一种适用于废水生物处理、生物制药、食品发酵和酿造工业等涉及到固定化微生物技术的领域，能进行长期稳定运行和高负荷连续运行的新型固定化微生物技术。
采用上述技术方案后，本发明主要优点是：
采用本发明方法固定化微生物在制备过程中基本无粘连，反应试剂和反应条件对细胞活性的影响较小，无毒性，操作简便，制得的固定化微生物强度较高，稳定性好，可用于连续运行。发明方法可广泛应用于废水生物处理、生物制药、食品发酵和酿造工业等领域中，具有良好的应用前景和实用价值。
具体实施方案
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1
一种固定化微生物的制备方法的具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1.1％的海藻酸钠溶液∶11％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶10的比例，在容器中，将1.1％的海藻酸钠溶液和11％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，制备出载体材料溶液。然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，制备出微生物混合溶液。微生物∶载体材料的质量比为1∶5。
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为4％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.6，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为0.5小时。
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，用网捞出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤3次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为3小时。
(4)洗涤
第(3)步完成后，用网捞出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤2次，备用。
实施例2
一种固定化微生物的制备方法的具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1.5％的海藻酸钠溶液∶9％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶6的比例，在容器中，将1.5％的海藻酸钠溶液和9％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，制备出载体材料溶液。然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，制备出微生物混合溶液。微生物∶载体材料的质量比为1∶4。
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为1％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.7，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为0.8小时。
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，用网捞出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤1次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为2小时。
(4)洗涤
第(3)步完成后，用网捞出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤1次，备用。
实施例3
一种固定化微生物的制备方法的具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1％的海藻酸钠溶液∶12％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶12的比例，在一般容器中，将1％的海藻酸钠溶液和12％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，制备出载体材料溶液。然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，制备出微生物混合溶液。微生物∶载体材料的质量比为1∶6。
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为5％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为1小时。
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，用网捞出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤2次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为4小时。
(4)洗涤
第(3)步完成后，用网捞出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤3次，备用。
实验结果
应用实施例1所述方法步骤做实验，即所选用的实验条件为：PVA浓度11％，海藻酸钠浓度1％，微生物与载体材料的质量比为1∶5，CaCl2浓度4％，第一步与CaCl2的反应时间为30min，第二步与Na2SO4的反应时间为3h。
在此制备固定化微球的过程中，微球基本无粘连。这样制备的微球，其弹性系数为65.3N/m，强度较高；连续运行5次(15天)，破碎率在8％以下，稳定性较好。脱水后，该微球的比表面积为1628.7893m2/g，即8.4697m2/颗，孔容为3.562929cm2/g，即18.5272×10-3cm3/颗，平均孔径为
40分钟即可完全渗透。从以上试验结果来看，应用该法制备的固定化微球具有良好的弹性和渗透性，较高的比表面积和孔容，其内部的孔隙结构有利于反应底物和营养物质的传递。并且，在制备固定化微球的过程中，微球基本无粘连。
Claims (4)
1.一种固定化微生物的制备方法，其特征在于具体的方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1～1.5％的海藻酸钠溶液∶9～12％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶6～12的比例，在容器中，将1～1.5％的海藻酸钠溶液和9～12％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，即为载体材料溶液，然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，微生物∶载体材料的质量比为1∶4～6；
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为1～5％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5～6.7，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为0.5～1小时；
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，取出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤1～3次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为2～4小时；
(4)洗涤
第(3)步完成后，取出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤1～3次。
2.按照权利要求1所述的一种固定化微生物的制备方法，其特征在于一种固定化微生物的制备方法的具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1.1％的海藻酸钠溶液∶11％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶10的比例，在容器中，将1.1％的海藻酸钠溶液和11％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，即为载体材料溶液，然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，微生物∶载体材料的质量比为1∶5；
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为4％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.6，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为0.5小时；
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，用网捞出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤3次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为3小时；
(4)洗涤
第(3)步完成后，用网捞出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤2次。
3.按照权利要求1所述的一种固定化微生物的制备方法，其特征在于一种固定化微生物的制备方法的具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1.5％的海藻酸钠溶液∶9％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶6的比例，在容器中，将1.5％的海藻酸钠溶液和9％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，即为载体材料溶液，然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，微生物∶载体材料的质量比为1∶4；
(2)进行微生物球的第一步固化
第(1)步完成后，先在质量浓度为1％的氯化钙溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.7，然后将第(1)步制备出的微生物混合液，滴加入调节pH值后的氯化钙溶液中，进行微生物球的第一步固化反应，固化反应时间为0.8小时；
(3)进行微生物球的第二步固化
第(2)步完成后，用网捞出第一步固化后的微生物球，先用蒸馏水洗涤1次，再放入饱和硫酸钠溶液中，进行第二步固化反应，固化反应时间为2小时；
(4)洗涤
第(3)步完成后，用网捞出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤1次。
4.按照权利要求1所述的一种固定化微生物的制备方法，其特征在于一种固定化微生物的制备方法的具体方法步骤如下：
(1)制备微生物混合液
按1％的海藻酸钠溶液∶12％的聚乙烯醇溶液的质量比为1∶12的比例，在容器中，将1％的海藻酸钠溶液和12％的聚乙烯醇溶液混合并搅拌均匀，即为载体材料溶液，然后将被固化的微生物加入载体材料溶液中，微生物∶载体材料的质量比为1∶6；
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(4)洗涤
第(3)步完成后，用网捞出第二步固化后的微生物球，用蒸馏水洗涤3次。
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| 聚乙烯醇-海藻酸钠固定Microbacterium sp.S_2-4的微环境分析. 李海波，杨瑞崧，李培军，巩宗强，孙丽娜，孙铁珩.生态学杂志，第26卷第1期. 2007 |
| 聚乙烯醇-海藻酸钠固定Microbacterium sp.S_2-4的微环境分析. 李海波，杨瑞崧，李培军，巩宗强，孙丽娜，孙铁珩.生态学杂志，第26卷第1期. 2007 * |
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