CN100528228C - 作为标志疫苗的新城疫病毒逃逸突变株 - Google Patents

Abstract

抗新城疫疫苗含有NDW株的一种或多种突变免疫原。该突变免疫原缺乏mAb 54单克隆抗体所识别的F糖蛋白上的抗原结合位点。用于检验家禽的试剂盒和检测方法有助于将禽群中已接种家禽与那些也许已经感染了野生型新城疫病毒的家禽区分开来。

Description

作为标志疫苗的新城疫病毒逃逸突变株

发明领域

本发明涉及一种新的抗新城疫疫苗，并且涉及保护家禽免患新城疫的方法。更详细地说，本发明涉及一种安全而有效的抗新城疫的标志疫苗，以及用于检验家禽的试剂盒和检测方法，从而使养禽者能将禽群中已接种家禽与那些可能已感染野生型新城疫病毒的家禽区分开来。本发明也涉及新的用于抗新城疫疫苗的突变免疫原。

发明背景

对于家禽来说，新城疫(ND)常常是一种严重的致命性疾病，因而可以造成重大的经济损失。此病由新城疫病毒(NDV)引起，NDV属于副粘病毒科(Paramyxovirdae)副粘病毒属(Paramyxovirus)。在禽副粘病毒中，业已识别9种不同的血清型，命名为PMV-1至PMV-9。NDV属于PMV-1或血清型1。根据美国专利号5,149,530，NDV株现在命名为“Wiltenberg”(亦称“Wiltenburg”)或NDW株，该专利通过引用结合到本文中。

两种类型的表面突起(刺突)从NDV的病毒包膜突出。一种由糖基化蛋白组成，该蛋白含有病毒粒子的血凝(H)和神经氨酸酶(N)两种活性(HN糖蛋白)。另一种由糖蛋白F组成，糖蛋白F负责细胞融合、溶血和病毒穿入。无糖基质蛋白M掺入到膜的内侧，作为核衣壳的结合位点，当病毒从质膜出芽时，可能参与HN糖蛋白和F糖蛋白的聚集反应。

生产出极大地介导免疫的抗所有这三种蛋白的抗体。那些只单独抗HN或F蛋白的抗体是保护性的。

新城疫影响许多商用的家禽，包括鸡、火鸡、雉、几内亚鸡、鸭、鹅和鸽子。另外，它也可能快及各种被捕获的鸟类和放养的半驯化鸟类以及自由生活的鸟类，包括迁徙的水鸟。笼养的和鸟舍里的鸟类也可能受到影响。

新城疫病毒通过呼吸道和肠道进入动物体内。经空气传播的小于5微米的颗粒布满整个呼吸道，包括气囊。大于5微米的颗粒进入结膜、鼻腔和气管下至支气管。在气管里通过纤毛的作用和细胞之间的感染而扩散病毒。在入侵位点开始繁殖后，强毒病毒进入脾、肝、肾和肺。病毒最终侵入大脑，随之许多鸟开始死亡。

新城疫的症状主要是呼吸症状和神经症状。通常是气喘。神经症状包括翅膀和/或双腿单侧和两侧麻痹，头颈的转圈运动、摆动/波动，翅、颈或腿肌的抽搐。全身症状可包括食欲丧失和产蛋减少，通常产蛋会减少40％以上。

死亡率的变化取决于介入病毒的性质和具体禽群的免疫状态。通常，快速致死的那些毒株在感染禽类间的传播慢于那些缓慢致死的毒株。此外，人们推测在某些家禽种类如鸡中存在长期无症状的病毒携带者。传播疾病的最大危险就是由于人员或设备的流动而导致的疾病暴发。由于养禽业中许多工序的集约化，因此就有从一个禽群到另一个禽群的人员大量流动和设备的搬迁。

现在已经开发出许多疫苗保护禽类免患新城疫。一些活抗原疫苗和弱毒抗原疫苗可通过滴眼、滴鼻或喷雾或饮水给予。灭活疫苗也可提供保护，通常都没有接种后的呼吸反应。这类疫苗许多是油乳剂疫苗，其中油性佐剂用来提高疫苗抗原的免疫原性。疫苗也可卵内接种到发育中的鸡胚。有时候这种方式可能会更准确。

美国专利号5,149,530、5,250,298、6,348,197、5,750,111和5,733,556每种都说明了抗新城疫病毒疫苗领域的现状。某些引用的文献还进一步说明了一些联合疫苗，例如那些含有一种或多种除针对新城疫外还针对另外的家禽疾病的抗原的联合疫苗。

不幸的是，现在仿佛无法将已接种禽群与那些受到致病力强、“野生型”的新城疫病毒感染的未接种禽群区分开来。这两种情况下，抗体都在动物体内产生。然而，现在接种的抗NDV免疫原诱生的抗体，通常与感染致病力强有传染性的NDV后所发现的抗体通常很难区别。

因此，本领域需要抗新城疫病毒的新疫苗。当滴眼、滴鼻或喷雾或饮水或卵内给予家禽疫苗时，这种疫苗能安全有效预防新城疫。还要供养禽者能将已接种的家禽成员和已感染新城疫的未接种的家禽成员区分开来。开发一种新的疫苗也应当能开发一种试剂盒以判断动物是否已适当地接种，或已经感染了致病力强的新城疫，或者也许已接种了多种常规NDV疫苗。

发明概述

作为本发明的一部分，提供一种抗新城疫病毒疫苗，所述疫苗含有约10⁰-10⁹EID₅₀的来自新城疫病毒NDW株的突变免疫原，其中所述突变免疫原缺乏名为mAb 54的单克隆抗体所识别的F糖蛋白上的抗原结合位点。

还提供了一种经鉴定的新城疫病毒的突变免疫原，该病毒株保藏于CNCM，保藏号为#I-2928。该突变免疫原适合作为进一步开发成ND疫苗的母种病毒，本发明也提供了一种具有上述已保藏病毒株的免疫原性特点的ND病毒的免疫原。

还提供了一种保护家禽动物免患新城疫的方法，所述方法包括给予所述动物含有约10⁰-10⁹EID₅₀的来自新城疫病毒NDW株的突变免疫原的疫苗，其中所述突变免疫原缺乏mAb 54单克隆抗体所识别的F糖蛋白上的抗原结合位点。

本发明还涉及一种检测接种抗新城疫的突变免疫原的试剂盒，所述试剂盒包含标准NDV抗原和发光抗体，其中所述发光抗体与已接种禽类血清中的所述抗原结合，但不与未接种禽类血清中的所述抗原结合。

还提供了一种生产用于抗新城疫疫苗的新城疫病毒突变免疫原的方法，所述方法包括在有名为mAb 54的单克隆抗体时培养新城疫病毒，致使所述突变免疫原在有所述单克隆抗体时发育和生长而不被所述单克隆抗体中和。突变免疫原缺乏mAb 54识别的F糖蛋白上的结合位点，因而也不被这种抗体所中和。

还说明了一种从Seq.ID No.1中所示的核苷酸序列获得的突变免疫原。该部分核苷酸序列编码缺乏mAb 54单克隆抗体结合位点的免疫原的F糖蛋白。因此，Seq.ID No.2中所示的氨基酸序列代表新城疫病毒F糖蛋白的相应部分序列。

因此，本发明也提供一种新城疫病毒的免疫原，所述免疫原具有Seq.ID No.2中所示的氨基酸序列突变免疫原的免疫原性特征。

本发明还提供一种新城疫病毒的突变免疫原，该病毒的丝氨酸，通常在野生型NDW株157位，被精氨酸所取代。

本发明另外还提供了一种以判断家禽动物是否已按照本发明如下所述接种，或者用另外的NDV疫苗接种，或者是否感染了野生型ND病毒的试剂盒和方法。

根据下面的详述和所附权利要求书，本发明的其他目的和特征将会变得显而易见。

优选实施方案的详细描述

现在业已发现得自新城疫病毒Wiltenberg株的突变免疫原能用于生产抗新城疫的标志疫苗。所得的免疫原缺乏本领域称为“mAb54”单克隆抗体的结合位点，而所有已知的现有ND病毒株都具有mAb 54的结合位点。mAb 54结合NDV的F融合蛋白的特性为M.S.Collins等作了进一步的描述，见“Evaluation of Mouse MonoclonalAntibodies Raised Against an Isolate of the Variant Avian ParamyxovirusType I Responsible for the Current Panzootic in Pigeons”，Arch.Virol.(1989)104：53-61。

缺乏mAb 54结合位点的突变免疫原的生产可以通过在有单克隆抗体mAb 54时培养新城疫病毒的活病毒株。更优选利用本领域的Wiltenberg或NDW株。合适的NDW株可得自法国巴黎的巴斯德研究所CNCM(国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes))(25，Rue de Docteur Roux，F-75724 PARISCEDEX)，保藏号为1-781，美国专利号5,149,530中作了进一步描述。在Russell，P.H.，J.Gen.Virol.65，795-798(1984)中可以找到培养和选择突变免疫原的多项技术。概括地讲，mAb 54抗体与抗体识别的病毒结合位点结合，即F糖蛋白部分上的病毒结合位点结合，中和培养的新城疫病毒。例外的是某些逃逸突变株即没有该结合位点的突变免疫原。这些突变株因而逃避中和从而能够生长和增殖。

正是这些逃逸突变株即突变免疫原，它们进一步成为疫苗开发的基础。突变免疫原可在合适的培养基如非洲绿猴肾细胞(VERO)中进一步培养，例如，通过免疫选择可对所得突变免疫原与mAb 54抗体反应性，以及毒力作进一步筛选。野生型病毒回复突变可采用遗传和抗原方法进行评价。上面Russell中所描述的一些技术或许有帮助，就像本领域可用的一些技术。

合适的突变免疫原，即母种病毒突变免疫原，保藏在上述地址的CNCM，保藏日为2002年8月29日，保藏号为I-2928。这个特别优选的突变免疫原即突变原，Fort Dodge Animal Health进一步命名为“p.13.”。如下所述，此p.13.突变免疫原是进一步连续传代的理想对象。本发明还包括其它基本上与本文中所述方法相同的方法制备的且具有其基本上相同的免疫原性特征的NDV突变免疫原。

本发明的ND病毒突变免疫原的进一步特征在于野生型NDW病毒中157位的丝氨酸以突变形式被精氨酸取代。

可以通过用禽蛋连续传代，优选用禽胚连续传代，或者用来自鸡胚的胚成纤维细胞或者VERO(非洲绿猴)细胞进行组织培养，使用可利用的技术，来大规模生产所述突变免疫原。本发明预期是大约2次连续传代，而经证实有用的至多大约10次连续传代。而优选的是经技术人员传代大约4次至大约8次。鸡胚对于传代突变免疫原是特别理想的。

上述所得突变免疫原特别适用于提供抗新城疫的免疫保护。该突变免疫原可以配制成抗新城疫疫苗。合适的疫苗每剂含有约10⁰至约10⁹ EID₅₀(50％的卵感染剂量)的一种或多种突变NDW免疫原或其免疫原性活性组分。更优选的范围，尤其是对于喷雾接种，是在约10⁴至约10⁹ EID₅₀的范围内。当经过滴眼或滴鼻，或者饮水给予时，上述范围可以作进一步调整。若卵内接种，每剂用量在约10⁰至约10¹EID₅₀的范围内。

典型的剂量为约0.01ml至约10ml，更优选约0.01ml至约1.0ml的疫苗(范围可以由技术人员作调整)，该疫苗含有上述剂量的突变免疫原，以及任何佐剂、赋形剂和载体，下面作进一步说明。

本发明的疫苗可以含有一种或多种合适的疫苗佐剂和药学上可接受的载体，合适的疫苗佐剂可以包括本领域可利用的相容的油和油乳剂。药学上可接受的载体可以包括例如水或生理盐水。疫苗里也可以包含其它赋形剂，例如，药物和兽用疫苗领域可接受的稳定剂和防腐剂。这些组分与突变ND免疫原可以混合一起，生产最终的疫苗。

本发明的疫苗对家禽家族成员安全有效，其中包括鸡、火鸡、雉、几内亚鸡、鸭、鹅、矮脚鸡、鸽子等等。

本发明含有突变ND免疫原的疫苗也可以与另一些能提供免疫保护预防其它家禽疾病的疫苗抗原配制在一起。例如可以使用抗Bursal病、马立克病(Marek′s disease)和由禽疱疹病毒引起的疾病的免疫原。

本发明疫苗的用药方式优选通过喷雾，但也可以通过滴眼或滴鼻或饮水，技术人员可采用所有的使用方法，也可以使用合适的卵注射设备进行卵内注射接种，例如美国北卡罗来纳州Embrex公司的机器。可以给孵育1天至高达约21天的蛋接种。特别优选给在大约10-18天期间的蛋接种一次。因此，保护家禽免患新城疫的方法包括将所述疫苗如上所述卵内接种到发育中的家禽。

也包括作为本发明组成部分的试剂盒和检测方法，藉此可以将已接种本发明疫苗的家禽与那些未接种和感染了强毒、野生型或“野外”新城疫病毒的家禽区分开来，还可以将其与那些已接种利用含有F融合糖蛋白的免疫原的常规NDV疫苗的家禽区分开来。实例包括ELISA、免疫过氧化物酶染色法、蛋白质印迹法、或者本领域技术员所用的任何其它合适的方法。

作为非限制的实例，试剂盒可以包含“标准的”NDV抗原(具有mAb 54识别的F融合糖蛋白的结合位点)，以及也能与标准抗原上这个位点结合的发光抗体。“发光”抗体按本领域可用的一些方法标记，因而会“发光”并且当与标准抗原结合时，会发出颜色改变的信号。发光抗体也可以是一种抗小鼠抗体(因mAb 54得自小鼠)，例如是用一种能催化产生颜色化学反应的酶标记，就如本领域可用的方法。抗小鼠抗体能与第二抗体(作为试剂盒的部分)结合，再依次与标准抗原上的结合位点结合(如在标准的夹心测定中)。

在检测试剂盒和检测方法的一个进一步实施方案中，也有竞争型检测，其中发光的检测试剂盒抗体和第二检测试剂盒抗体都会与标准的ND检测试剂盒抗原结合。这两种抗体均竞争F糖蛋白结合位点，因此不同的读数会显示阳性和阴性。

非限制的检验家禽的方法简述如下：自受调查家禽成员中取血样，然后逐个检验。感染野生型、野外NDV或已接种仍有F糖蛋白结合位点的另一ND株的家禽都会产生内部抗体，内部抗体抗这些抗体识别的病毒上的该位点(F融合糖蛋白)。当向样品添加检测试剂盒的“标准”抗原时，这些内部抗体也将与标准抗原上同一结合位点结合。这将阻断或明显减少发光抗体结合到标准抗原上的这个位点(如在竞争性检测中)，因而将阻断或明显降低颜色改变。另一方面，按本发明接种的家禽成员将会缺乏F糖蛋白上的结合位点。因而不会产生抗此结合位点的内部抗体(mAb 54)。当添加含有标准抗原的试剂时，发光抗体能与标准抗原结合，发生颜色改变，显示特定的动物已按本发明接种。或者，第二检测试剂盒抗体能与标准抗原结合，因而发光抗体可与第二抗体(如在夹心测定中)结合而发生颜色改变。

当家禽成员已接种常规NDV疫苗时，还可以产生抗F糖蛋白位点的抗体，但这些家禽常常在不同程度上感染了野生型病毒。在这些情况下，颜色改变的差异可以区别这些动物。

前述试剂盒和检测方法的实施方案的一些变通方案也是在本发明的范围内。

以下的实施例说明本发明各个优选方面，但不得解释为对本发明范围的限制。

实施例

实施例1-实验方案

下述4期实验方案简要说明开发抗新城疫病毒标志疫苗的有用路线。

1期

确定自然感染PMV1(副粘病毒血清型1，鉴定为NDV)时是否诱生mAb 54抗体所识别的抗原位点的抗体。对产生融合蛋白上缺乏mAb 54所识别的抗原位点的逃逸突变株作进一步分析。

2期

遗传鉴定融合蛋白上缺乏mAb 54所识别的抗原位点的逃逸突变株。

3期

进行逃逸突变株的稳定性试验，检查野生型或毒力回复突变情况。

4期

开发和确认用于区别抗野生型抗体和抗疫苗株抗体的检测方法。

更详细说明：

1期

·用竞争性结合测定，检查自然感染PMV1禽类的血清中抗mAb 54所识别的抗原位点的抗体。

·在有mAb 54时在鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物上培养NDV的NDW株。

·空斑纯化CEF中所产生的病毒，在禽胚内经有限传代生产病毒贮备液(称病毒贮备母液)。

·采用免疫过氧化物酶(IPX)试验筛选与mAb 54有反应性的逃逸突变株。

2期

·测定“野生型”和逃逸突变株融合蛋白的核苷酸序列。

·按照所提供的实验方案(当1期的竞争性测定)在1日龄的无特定病原体(“SPF”)的鸡中进行确定病毒贮备母液效力的研究。

·选择用mAb 54确定的无抗原位点/修饰抗原位点的逃逸突变株进行3期试验。

3期

·用禽胚传代所选逃逸突变株的病毒贮备液2次以生产母种病毒(第一次传代)和工作种子病毒(第二次传代)。

·用禽胚传代工作种子病毒4次以生产用于稳定性试验的疫苗病毒。

·用mAb 54的IPX试验和核苷酸测序确认疫苗病毒的特征。

·用禽胚传代“已确认的”疫苗病毒10次并确认上述特征。

·用CEF传代“已确认的”疫苗病毒10次并用IPX试验确认特征。

·用总共10次传代在1日龄SPF鸡中进行毒力和野生型回复突变的体内研究。

·用mAb 54的IPX试验和核苷酸测序确认从第10次体内传代再分离的病毒(如果少于10次则从最后的一次传代再分离病毒)的特征。

·用1日龄SPF鸡测定母种、疫苗、体外传代(10x)疫苗和体内传代(10x，参见上文)疫苗病毒的大脑内致病性指数(ICPI)。

4期

·用6周龄鸡生产抗“野生型”和NDW逃逸突变株的单特异性抗血清。用疫苗病毒生产后者的抗血清(参见上文)。

·开发检测NDV抗体的ELISA用作试剂盒试验以筛选抗NDV“野生型”毒株抗体和抗NDV疫苗株抗体的禽血清。

·如果适当(随着ELISA的进展)改进现行的NDV抗体的IPX试验，用作试剂盒试验以筛选抗NDV“野生型”毒株抗体和抗NDV疫苗株抗体的禽血清。

·用已知的抗NDV野生型毒株的阳性和阴性血清确认选育试验。

实施例2-选育逃逸突变株的方法

可以采用Russell，P.H.，J.Gen.Virol.(1984)65，795-798所描述方法。这些程序概述如下。

·用‘Technomouse’制备一批单克隆抗体617/54(mAb54)。

·用9日龄禽胚培养NDW株。

·测定mAb54的中和指数。用不同稀释度的热灭活mAb通过微量-中和试验测定病毒感染性滴度。等量(50μl)的病毒和mAb在37℃反应2小时，然后吸附到VERO细胞的微孔中。进行IIP试验，统计感染的细胞数。期望病毒感染性降低10⁵以上。

·病毒空斑的免疫选育。等量的病毒和热灭活mAb在37℃孵育2小时。用PBS/培养基将此混合物按1/10、1/100和1/1000稀释。将每种溶液，包括未稀释的溶液吸附到2个含有融合鸡胚成纤维细胞(CEF)的孔(100μl/孔)中。37℃1小时后，用含1/100-1/500稀释度的mAb和胰蛋白酶(2-5μg/ml)的琼脂覆盖每个孔。于37℃/5％CO₂孵育平板。

·3-4天后，用中性红染料可见单个空斑。用巴斯德吸管穿过琼脂至细胞层“挑取”空斑。将含有突变株的琼脂斑块放入PBS中。每次制备再用过量的mAb处理一次然后经CEF或禽胚再传代。

·用含有和不含mAb 617/54的VERO细胞培养从每一空斑中经再传代的病毒。用免疫过氧化物酶(IPX)试验筛选与mAb 617/54和鸡多克隆抗血清反应的逃逸突变株。

实施例3

NDW逃逸突变株和‘POULVAC’疫苗的效力研究方法

·两个接种的组(一个突变株和‘Poulvac’疫苗)，每组由25日龄鸡组成。

·十只未接种的小鸡为对照组。

·用禽胚将空斑中取出的病毒传代六次，用于突变株的所有接种。

·每只接种的小鸡预定以0.5ml脱矿质水获取10^6..5 EID₅₀。

·给鸟肌注致病力强的NDV(Herts/33)，用于攻毒，每只用量0.5ml10^5.0 ELD₅₀。

开始时，滴定突变株测定病毒的滴度。如表1所示。突变株p.13稀释到10^6.5EID₅₀/0.5ml而总量12.5ml对25只小鸡粗放喷雾给药，每只隔离喂养。每小瓶‘Poulvac’疫苗的滴度是10^10.02 EID₅₀(由FortDodge Animal Health Holland，The Netherlands提供)，再经配制使每只小鸡接受0.5ml内含10^6.5EID₅₀。后来滴定用于接种小鸡的病毒制剂是在接种后立即用禽胚完成。这些滴度用来计算每只小鸡接受的所计算的病毒剂量的平均值(表1)。随机混合两房之间的组用于攻毒。每只鸡接受的攻毒剂量为0.5ml Herts/33含10^4.6 ELD₅₀。

实验期间那些患病以致不能进食的鸡会死亡。能进食及饮水的病鸡和实验15天后残存的鸡的记录详见表2和表3。

结果

攻毒前和攻毒后(15天)，从所有残存的鸡采集血清，用NDW病毒血凝抑制(HI)反应进行检测。

效力的研究结果概述于表2和表3中。

病毒组

未接种的

十只未接种的对照小鸡在攻毒的三天内死亡(死亡率100％)。

攻毒前这些鸡的血清全部为HI试验阴性。

“Poulvac”疫苗

接种了‘Poulvac’疫苗的鸡在攻毒后4天死亡1只(死亡率4％)。从这只死鸡回收毒力强的ND病毒是通过接种脑组织匀浆到禽胚中。

·另两只小鸡显示了临床症状，一只仅一天而另一只直到实验结束。

·攻毒前HI抗体滴度在2-16，其中的24只小鸡小于或等于8。

攻毒后全部鸡的抗体滴度都有增加(范围16-512)。

突变株p.13

·接种了突变株p.13的25只鸡中虽然有3只鸡显示了临床症状但是无一死亡(死亡率0％)。

·攻毒前HI滴度为8或更少，但在攻毒后绝大多数都明显增加，范围为32-1024。

表1.

每只鸡的疫苗病毒的免疫剂量

^a按每只鸡用0.5ml所计算的接受剂量

^b每小瓶的病毒滴度

表2.

应用NDW逃逸突变株病毒和‘POULVAC’疫苗研究疫苗效力的资料概要

表3.

效力研究-各组死亡百分率

注解适用于表2和表3。

¹HI滴度攻毒前表示为血清完全抑制病毒的4个血凝反应单位的稀释度的倒数。

²HI滴度攻毒后残存的鸡数。D＝死的。

^*鸡运动失调，一些体重减轻，受到侵扰时仅能移动但是能够进食和饮水。

实施例4-对NDW逃逸突变株和‘POULVAC’疫苗的

融合蛋白(F_o)基因测序

经鸡胚传代6次的突变株用ABI Prism^TM 310 Genetic Analyzer自动测序仪测定核苷酸序列以检测其“野生型”回复突变。(F基因的部分序列示于-Seq.ID No.1，随附相应的氨基酸序列示于Seq.IDNo.2)。测定了突变株p.13的融合蛋白F基因的短序列，跨过157位氨基酸改变的编码区。氨基酸序列保持不变-精氨酸仍在NDW‘野生型’丝氨酸的位置。然而突变株p.13的精氨酸密码子由AGA变成CGC。

测序的发现受此IPX试验的支持。仿佛全无mAb 54与任何突变株结合的证据。然而，NDW‘野生型’显然与此单克隆抗体结合。

对现存于‘Poulvac’疫苗中的病毒，测定了全基因序列(包括F₀多肽前体)的阅读框。该序列与Fort Dodge提供的NDW‘野生型’病毒的母种相同。然而，这些序列和用鸡胚进一步传代所得的NDW母种的序列有一点不同。这就是基因1195位的沉默突变。

实施例5-进一步效力测试

所用的逃逸突变株p.13如下：母种病毒(MSV)，工作种子病毒(MSV+1次传代)，和实验疫苗(MSV+5次传代)。按欧洲药典中规定检测MSV的毒力回复突变并检测其经鸡蛋和VREO细胞的组织培养物传代后的遗传稳定性。检测实验疫苗(MSV+5次传代)在商用煮器中的效力。所述实验都表明本发明的逃逸突变株(突变免疫原)和疫苗均有高效力。

实施例6-ND标志测试

概述

在本实施例中，研究区别接种ND标志毒株p.13的鸡的血清与抗NDW疫苗(Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，Iowa and Weesp，the Netherlands)抗体的鸡的血清和抗毒力强的NDV抗体的鸡的血清的可行性。前面已指出，ND标志毒株p.13缺乏单克隆抗体号为54(Mab#54)的结合位点。

编号“MV”的血清取自接种ND标志毒株p13的鸡；编号“FS”的血清取自急性感染NDV的鸡；编号9、10、11和12的血清取自接种

NDW疫苗的鸡。作为对照，本项研究中包括SPF鸡的血清和接种了NDV B1并用NDV Herts 33攻毒的鸡的血清。采用免疫过氧化物酶染色试验(IPX)进行研究。

编号MV的血清稍许阻断Mab#54，而SPF血清没有。编号MV的血清的阻断效应的原因尚不清楚。若不拘泥于任何特别的理论，则可能由于NDV抗体与靠近Mab#54的结合位点的结合有空间障碍。这也可能由非特异性结合活性所引起。编号FS的血清中等阻断Mab#54的结合，但结果有些变化。编号FS的血清显示其阻断活性高于编号MV的血清的阻断活性。编号9-12的血清的阻断活性十分明显而且明显强于编号MV的血清的阻断活性。编号MV的血清和NDV抗血清两者之间也存在明显差异。

可以确定，应用IPX阻断Mab#54的试验有可能从鸡血清中将接种过ND标志毒株p13的鸡血清区分出来：

-实验性感染NDV，

-接种NDW活疫苗。

材料与方法

材料

-融合单层VERO细胞的96孔组织培养板。

-Mab#54

-NDV Ulster株

-10％缓冲甲醛溶液

-磷酸缓冲盐溶液(PBS)

-SPF鸡血清

-抗

NDW批的抗血清

-用活的无毒的B1感染鸡，随后用毒力强的NDV Herts 33攻毒获得NDV阳性血清。

-从患急性新城疫的鸡中取得野外血清

-用ND标志毒株p13的母种病毒给鸡喷雾接种，随后肌注加强免疫所获得的血清

-山羊抗小鼠免疫球蛋白过氧化物酶缀合抗体

-底物溶液A：10ml无菌脱矿质水中0.2g尿素H₂O₂

-底物溶液B：25ml乙醇中含0.1g 3-氨基-9-乙基咔唑

方法，免疫过氧化物酶染色试验(IPX)

-用NDV Ulster-1/1000感染平板并静置过夜

-每孔加入50μl 10％缓冲甲醛溶液20分钟以固定细胞

-倒出甲醛，用200μl pH 7.2的温的0.1M PBS冼孔两次

-加200μl PBS并静置

-用PBS制备系列稀释(1/2，1/10，1/25，1/50和1/100的P13，野外血清和SPF血清)

-倒出PBS并且将板拍干

-将100μl每一稀释度的血清加到有NDW病毒的10个孔中，37℃孵育45分钟

-轻轻拂去血清稀释液，将板拍干并用200μl PBS将全部小孔洗3x。将板拍干。

-用PBS制备系列稀释1/500-1/10,000的mAb 54，将100μl每种稀释液加到1/2孔中，所述孔含有每种稀释度的测试血清的抗原/抗体。

-37℃孵育平板45分钟

-轻轻拂去mAb并将板拍干

-用200μl PBS清洗各孔3次并将板拍干

-给每个孔中加入100μl山羊抗小鼠免疫球蛋白过氧化物酶缀合抗体

-37℃孵育50分钟

-轻轻拂去缀合物并用200μl PBS洗孔3x

-将0.1ml底物溶液A和0.1ml底物溶液B加到9.8ml PBS中并混合，制备最终底物溶液

-加底物，每孔100μl，置室温15分钟

-用PBS洗孔两次

-显微镜下辨读平板

-棕色细胞表示结合Mab#54

结果

Mab#54的最佳稀释

SPF血清和NDV抗血清与不同稀释度的抗原反应。随之，Mab#54也与不同稀释度的抗原反应。这个试验进行两次。第一次试验结果见表4。(第二次试验结果十分相同)。

结果表明SPF抗血清不会阻断Mab#54与NDV抗原的结合，虽然如果用1/2稀释的SPF血清反应会稍许低些。1/2、1/5和1/25稀释度的NDV阳性抗血清阻断Mab#54的结合。1/50稀释度的血清阻断较弱，而1/100稀释度几乎不阻断。

可以认为SPF血清和NDV阳性血清二者之间的差异，在血清稀释度为1/5和25/1时最明显。

进一步稀释Mab#54，1/50和1/100稀释度的阳性血清的反应性下降。决定用1/2500稀释度Mab#54作进一步试验。

表4.与系列稀释度SPF血清和NDV阳性抗血清预孵育后不同稀释度的Mab#54与NDV抗原的反应性

SPF抗血清

抗血清稀释度

Mab稀释度	1/2	1/2	1/5	1/5	1/25	1/25	1/50	1/100
									1/500	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
1/1000	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
									1/2500	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
1/5000	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++

NDV抗血清

抗血清稀释度

Mab稀释度	1/2	1/2	1/5	1/5	1/25	1/25	1/50	1/100
									1/500	-	-	-	-	-	-	++	+++
1/1000	-	-	-	-	-	-	+	++
									1/2500	-	-	-	-	-	-	+	++
1/5000	-	-	-	-	-	-	-	+

+染色明显++强染色+++特强染色

-无染色

不同抗血清阻断Mab#54的结合

阻断研究的结果见表5。编号MV的血清取自接种ND标志毒株p13的鸡。编号FS的血清是野外血清，取自急性感染NDV的鸡。编号9、10、11和12的血清取自接种

NDW疫苗的鸡。

结果表明SPF血清不阻断Mab#54的结合，而阳性的NDV血清阻断Mab#54的结合。编号MV的血清有稍许阻断活性。当稀释度为1/2时8份血清中有2份阻断Mab#54的结合，而当稀释度为1/10时，检测到Mab#54的明显结合。编号FS的血清的阻断变化极大；FS1明显阻断Mab#54的结合，而FS6几乎不显示阻断活性。

编号9-12的血清全都阻断Mab#54的结合，特别是11和12。

表5.与系列稀释度的不同鸡血清预孵育后1/2500稀释度的Mab#54与NDV抗原的反应性，A部和B部系分开检测A部.

多克隆抗血清的稀释度

抗血清	1/2	1/2	1/10	1/10	1/25	1/25	1/50	1/100
									MV1	-	-	+	+	++	++	+++	+++
MV2	-	-	+	+	++	++	+++
									MV3	+w	+w	++	++	+++	+++	+++	+++
MV5	+w	+	+++	+++	+++	+++	+++	+++
									MV6	+	+	+++	+++	+++	+++	+++	+++
MV7	+	+	+++	+++	+++	+++	+++	+++
									MV8	+？	+？	++	++	+++	+++	+++	+++
MV9	+w	+w	++	++	+++	+++	+++	+++
									FS1	-	-	-	-	+	+	+++	+++
FS3	-	-	+	+	++	++	+++	+++
									FS4	-？	-	++	++	+++	+++	+++	+++
FS5	+w	+w	++	++	+++	+++	+++	+++
									FS6	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
SPF	++	++	++	++	+++	+++	+++	+++
									NDV	-	-	-	-	-	-	-	+

B部.

多克隆抗血清的稀释度

抗血清	1/2	1/2	1/10	1/10	1/25	1/25	1/50	1/100
									9	-	-	+w	+w	++	++	+++	+++
10	-	-	ND	ND	ND	ND	ND	ND
									11	-	-	-	-	-？	-？	++	+++
12	-	-	-？	-？	+	+	+++	+++
									SPF	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
NDV	-	-	-	-	+	+	+++	+++

+w＝弱阳性

-？＝很轻微的染色

+＝染色

++＝强染色

+++＝特强染色

ND＝血清不足未做

讨论

编号MV、FS和9-12的血清结果评估如下。+值为1，++值为2，而+++值为3，-值为0。依此计算每份血清的平均值。SPF血清和NDV阳性血清的计算同样进行。

结果见表6。编号MV的血清稍许阻断Mab#54，SPF血清不阻断。编号MV的血清阻断效应的原因尚不清楚。如不拘泥于任何特别的理论，则可能由于NDV抗体与靠近Mab#54结合位点的结合有空间障碍。这也可能由于血清组分的非特异性结合所引起。

编号FS的血清的阻断活性一般强于编号MV的血清。前面已经指出，编号FS的血清的结果有一些变化。编号FS的血清取自有急性感染NDV症状的鸡。由于感染和收集血清间的时间短，因此这些血清中有一些可能没有NDV抗体。可能解释为阻断活性在不同血清之间存在个体差异。

编号9-12的血清的阻断活性强。与之比较，观察到的编号MV的血清的阻断相对弱些。这种差异在血清稀释度为1/10和1/25时最明显。编号MV的血清和NDV抗血清两者间也有明显差异。

表6.阻断研究结果总结

结论

用IPX阻断Mab#54的检测有可能从鸡血清中将接种了ND标志毒株p.13的鸡血清区分出来。

-实验性感染NDV，

-接种了活的NDV疫苗。

尽管用优选实施方案具体说明了本发明，但是预期在不偏离本发明的精神和范围的情况下，如同说明书和所附权利要求中所给出的一样，技术人员可以对本发明作出某些修改。

CPCH0561820P    序列表

<110>Geerligs，Harmen J.

     Brown，Ian H.

     Alexander，Dennis J.

     Collins，Michael S.

<120>作为标志疫苗的新城疫病毒逃逸突变株

<130>AM100044

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1662

<212>DNA

<213>副粘病毒/新城疫病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1662)

<400>1

atg ggc tcc aga tct tct acc agg atc cca gta cct ctg atg ctg acc     48

Met Gly Ser Arg Ser Ser Thr Arg Ile Pro Val Pro Leu Met Leu Thr

1               5                   10                  15

gtc cgg gtc gcg ctg gca ctg agt tgc gtc tgt ccg aca agc tcc ctt     96

Val Arg Val Ala Leu Ala Leu Ser Cys Val Cys Pro Thr Ser Ser Leu

            20                  25                  30

gat ggc agg cct ctt gca gct gca ggg att gtg gtg aca gga gac aaa    144

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

        35                  40                  45

gca gtc aac ata tac acc tca tct cag aca ggg tca atc ata gtc aag    192

Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

    50                  55                  60

tta ctc cca aat atg ccc aaa gat aaa gag gcg tgt gca aaa gcc ccg    240

Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

65                  70                  75                  80

ttg gag gcg tac aac agg aca ttg act act ttg ctc acc ccc ctt ggt    288

Leu G1u Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

                85                  90                  95

gat tct att cgt agg ata caa gag tct gtg act aca tct gga gga ggg    336

Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly

            100                 105                 110

aaa cag gga cgc ctt ata ggc gcc att atc ggc ggt gca gct ctc ggg    384

Lys Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Ala Ala Leu Gly

        115                 120                 125

gtt gca acc gct gca cag ata aca gca gct tcg gct ctg ata caa gcc    432

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ser Ala Leu Ile Gln Ala

    130                 135                 140

aac caa aat gct gcc aac atc ctc cgg ctt aaa gag aga att gct gca    480

Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Arg Ile Ala Ala

145                 150                 155                 160

acc aat gag gct gtg cac gag gtc act gat gga tta tca caa cta gca    528

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala

                165                 170                 175

gtg gca gtt ggg aag atg cag caa ttt gtt aat gac cag ttt aat aaa    576

Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Lys

            180                 185                 190

aca gct cag gaa ttg gac tgt ata aaa att acc cag cag gtt ggt gta    624

Thr Ala Gln Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

        195                 200                 205

gaa ctc aac ctg tat cta act gaa ttg act aca gta ttc ggg cca caa    672

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

    210                 215                 220

atc act tcc cct gcc tta acc cag ctg act atc cag gcg ctt tac aat    720

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

225                 230                 235                 240

cta gct ggt ggg aat atg gat tac ttg ttg act aag tta ggt gta ggg    768

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Gly

                245                 250                 255

aac aac caa ctc agc tca tta att ggt agc ggc ctg atc acc ggc aac    816

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn

            260                 265                 270

cct att ctg tac gac tca cag act cag ctc ttg ggt ata cag gta acc    864

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Thr

        275                 280                 285

cta ccc tca gtc ggg aac ctg aat aat atg cgt gcc acc tac ttg gaa    912

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

    290                 295                 300

acc ttg tct gta agt aca acc aaa gga ttt gcc tca gca ctc gtc cca    960

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro

305                 310                 315                 320

aag gtg gtg atg aag gtc ggt tcc gtg ata gaa gaa ctt gac acc tca    1008

Lys Val Val Met Lys Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

                325                 330                 335

tac tgt ata gag acc gat ttg gat cta tat tgt aca aga ata gtg aca    1056

Tyr Cys Ile Glu Thr Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

            340                 345                 350

ttc cct atg tct cct ggt att tat tcc tgt ttg agc ggc aat aca tcg    1104

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

        355                 360                 365

gct tgc atg tac tcg aag act gaa ggc gca ctc act acg ccg tac atg    1152

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

    370                 375                 380

act ctc aaa ggc tca gtt att gcc aac tgt aag atg aca aca tgt aga    1200

Thr Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg

385                 390                 395                 400

tgt gca gac ccc ccg ggt atc ata tcg caa aat tat gga gaa gct gtg    1248

Cys Ala Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

                405                 410                 415

tct cta ata gat agg caa tca tgc aat gtc cta tcc tta gac gga ata    1296

Ser Leu Ile Asp Arg Gln Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

            420                 425                 430

act ttg agg ctc agt ggg gaa ttt gat gca act tat caa aag aat atc    1344

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

        435                 440                 445

tca ata caa gat tct caa gta atc gtg aca ggc aat ctc gat atc tcg    1392

Ser Ile Gln Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

    450                 455                 460

act gag ctt ggg aat gtc aac aac tcg ata agt aat gct tta gat aag    1440

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser IIe Ser Asn Ala Leu Asp Lys

465                 470                 475                 480

tta gag gaa agc aac agc aaa cta gac aag gtc aat gtc aaa ctg acc    1488

Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr

                485                 490                 495

agc aca tcc gct ctc atc acc tat atc gtt tta act gtc ata tct ctt    1536

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu

            500                 505                 510

gtt tgt ggt ata ctt agc ctg gtt cta gca tgc tac ctg atg tac aag    1584

Val Cys Gly Ile Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

        515                 520                 525

caa aag gcg caa cag aag acc ttg tta tgg ctt ggg aat aat acc ctg    1632

Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

    530                 535                 540

gat cag atg aga gcc act acg aaa atg tga                            1662

Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Lys Met

545                 550

<210>2

<211>553

<212>PRT

<213>副粘病毒/新城疫病毒

<400>2

Met Gly Ser Arg Ser Ser Thr Arg Ile Pro Val Pro Leu Met Leu Thr

1               5                   10                  15

Val Arg Val Ala Leu Ala Leu Ser Cys Val Cys Pro Thr Ser Ser Leu

            20                  25                  30

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

        35                  40                  45

Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

    50                  55                  60

Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

65                  70                  75                  80

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

                85                  90                  95

Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly

            100                 105                 110

Lys Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Ala Ala Leu Gly

        115                 120                 125

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ser Ala Leu Ile Gln Ala

    130                 135                 140

Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Arg Ile Ala Ala

145                 150                 155                 160

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala

                165                  170                  175

Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Lys

            180                  185                  190

Thr Ala Gln Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

        195                  200                  205

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

    210                 215                 220

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

225                 230                 235                 240

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Gly

                245                 250                 255

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly LeuIle Thr Gly Asn

            260                 265                 270

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Thr

        275                 280                 285

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

    290                 295                 300

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro

305                 310                 315                 320

Lys Val Val Met Lys Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

                325                 330                 335

Tyr Cys Ile Glu Thr Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

            340                 345                 350

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

        355                 360                 365

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

    370                 375                 380

Thr Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg

385                 390                 395                 400

Cys Ala Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

                405                 410                 415

Ser Leu Ile Asp Arg Gln Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

            420                 425                 430

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

        435                 440                 445

Ser Ile Gln Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

    450                 455                 460

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys

465                 470                 475                 480

Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr

                485                 490                 495

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu

            500                 505                 510

Val Cys Gly Ile Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

        515                 520                 525

Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

    530                 535                 540

Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Lys Met

545                 550

Claims (15)

1.一种抗新城疫病毒的疫苗，所述疫苗包含10⁰-10⁹ EID₅₀的来自新城疫病毒NDW株的突变免疫原，其中所述突变免疫原缺乏名为mAb 54的单克隆抗体所识别的F糖蛋白上的抗原结合位点。

2.权利要求1的疫苗，其中所述突变免疫原是连续传代的。

3.权利要求2的疫苗，其中所述连续传代在禽蛋中进行。

4.权利要求3的疫苗，其中所述连续传代包括至少2次和至多10次的连续传代。

5.权利要求4的疫苗，其中所述连续传代包括4至6次的连续传代。

6.权利要求1的疫苗，其中所述突变免疫原被鉴定为p.13，并且保藏于法国巴黎的CNCM，保藏号为I-2928。

7.一种新城疫病毒NDW株的免疫原，所述新城疫病毒NDW株的免疫原具有保藏于CNCM的保藏号为I-2928的毒株的免疫原性特征。

8.来自新城疫病毒NDW株的突变免疫原在制备用于保护家禽动物免患新城疫的疫苗中的用途，其中所述免疫原为10⁰-10⁹EID₅₀而且其缺乏mAb 54单克隆抗体所识别的F糖蛋白上的抗原结合位点。

9.权利要求8的用途，其中所述突变免疫原为10⁴-10⁹EID₅₀。

10.一种用于抗新城疫病毒疫苗的新城疫病毒NDW株突变免疫原的生产方法，所述方法包括在有名为mAb 54的单克隆抗体时培养新城疫病毒，致使所述突变免疫原在有所述单克隆抗体时发育和生长而不被所述单克隆抗体中和。

11.权利要求10的方法，其中所述病毒在禽胚中培养。

12.一种新城疫病毒NDW株的突变免疫原，其中所述病毒的F糖蛋白得自Seq.ID No.1中所示的核苷酸序列，而且其中所述糖蛋白缺乏名为mAb 54的单克隆抗体的结合位点。

13.一种新城疫病毒NDW株的突变免疫原，其中所述病毒的F糖蛋白具有Seq.ID No.2中所示的氨基酸序列。

14.一种新城疫病毒NDW株的免疫原，所述免疫原具有Seq.IDNo.2中所示的氨基酸序列的突变免疫原的免疫原性特征。

15.一种新城疫病毒NDW株的突变免疫原，其中所述病毒的F糖蛋白的157位丝氨酸被精氨酸所取代。