CN100515428C - 钨酸锂在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了钨酸锂在制药中的应用，特别是在治疗神经退行性疾病、糖尿病引起的神经病变、脑缺血包括脑功能障碍药物的制备中应用。由于钨酸锂阴、阳离子都有活性，二者发挥协同作用，可以更好地抑制GSK-3的活性。通过抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；通过抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。通过提高皮质神经元内BDNF的含量，在缺血缺氧状态下，促进神经细胞的存活和损伤修复，改善学习记忆功能障碍。

Description

钨酸锂在制药中的应用

技术领域

本发明涉及钨酸锂作为有效成分在治疗神经退行性疾病，治疗糖尿病引起的神经病变，治疗脑缺血(包括脑功能障碍)及其相关疾病的药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年性痴呆，是一种以进行性记忆减退、认知障碍以及人格改变为临床特征，以大脑皮质和海马区域出现细胞外老年斑(senile plaque，SP)、细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和胆碱能神经元丢失为病理特征的神经退行性疾病。

SP略成球形，其主要成分为β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)。新产生的Aβ是可溶的，不仅没有神经毒性，还具有一定的神经营养作用。但Aβ老化、聚集，则产生神经毒性，是引起AD主要病理改变的分子基础。Aβ沉积在胞外，周围被溃变的轴突与树突、激活的小胶质细胞和星形胶质细胞包围形成SP。

除了SP，另一个诊断AD的病理指标是NFT。NFT为双螺旋丝结构，由过度磷酸化的tau蛋白组成。后者是一种多功能的微管相关蛋白，能稳定微管，促进微管的装配。由此可见，治疗AD的关键在于阻止Aβ的聚集、拮抗其神经毒性及降低tau蛋白的过度磷酸化，减少NFT的形成。

随着年龄的增长，AD患病率呈明显上升趋势。一般认为，超过65岁，每5岁AD患者所占比例增加一倍。目前世界人口逐年老化，该病发病率进一步升高，使其在老年人群中所占比例进一步扩大。AD已成为65岁以上人群痴呆最常见的病因，在发达国家已被认为是一个主要的公众健康问题，成为人类继心血管病、癌症、中风之后的第四号杀手。

目前用于治疗AD的药物主要有胆碱酯酶抑制剂(ChEI)、钙离子拮抗剂、抗氧化剂、抗炎药物、他汀类降血脂药物、脑代谢激活剂及某些中药天然药物。现有的治疗AD药物大多是针对该病的某些症状进行治疗，缺乏对已知病因的干预。

钨酸钠目前正进行治疗I期糖尿病的临床试验，它通过使葡萄糖载体(GLUT)、胰腺β细胞恢复正常，增加胰岛素活性和胰腺β细胞数量发挥治疗糖尿病的作用。近来研究表明它还是GSK-3的抑制剂，在神经细胞中，它可以在Ser-9位点磷酸化GSK-3β，使GSK-3灭活，从而抑制tau蛋白的过度磷酸化。

长期的锂盐治疗也能抑制GSK-3β，同时能增加重要的保护性蛋白Bcl-2的水平，以抑制细胞凋亡。

GSK-3是一种Ser/Thr蛋白激酶，是最早发现的蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的直接底物之一，活化的PKB与GSK-3结合，诱导GSK-3向细胞膜转移，磷酸化其N端的Ser活性位点(GSK-α作用位点为Ser21，而GSK-β为Ser9)使之失活。GSK有许多不同的底物，如tau蛋白、c-Jun转录子、β-catenin、cyclinD1、胰岛素受体底物(IRS-1)、eLF2B等，tau和β-catenin在AD等中枢退行性疾病的发病中起重要作用。同时GSK还是Wnt信号通路的重要组成部分。

GSK-3还在PI3-K/PKB对细胞生长调节、尤其在抗凋亡过程中发挥重要功能。Marianna等在Rat-1成纤维细胞以及未分化嗜铬细胞瘤PC12细胞中表达、催化失活的GSK-3，结果显示失活GSK-3可阻止由PI3-K或PKB受抑制所致的细胞凋亡。近来还发现，PKB通过抑制GSK-3可增加cyclin D的积累促进细胞进入细胞周期，促进细胞增殖，而GSK-3抑制剂——氯化锂(LiCl)可以刺激突起(轴突和树突)生长。

Aβ是APP在β、γ分泌酶的共同参与下水解产生的多肽。生理状态下，Aβ浓度低，是一种可溶性物质。病理情况下大量产生，并由可溶性形式转变为不溶性的β-折叠结构，逐渐聚集形成老年斑的核心。Aβ可能通过诱导神经细胞凋亡、过氧化损伤、炎症反应等产生神经毒性作用，如Aβ可以直接产生羟自由基，自由基可以直接或间接造成谷氨酸转运体的功能降低，突触间隙谷氨酸堆积触发兴奋毒作用。Phiel等研究证实GSK-3α通过针对γ分泌酶的特异性底物或接近其复合物的底物调节γ分泌酶的活性，他们在细胞水平观察到，用LiCl减少GSK-3α的表达，可使Aβ₄₀及Aβ₄₂的产量分别降低45％及43％。在AD大鼠脑中，应用LiCl后，不溶性Aβ₄₀及Aβ₄₂也各减少62％及51％。Sheng等发现糖尿病鼠海马神经元Aβ₄₀及Aβ₄₂含量增加，但机制不详；在痴呆鼠模型，饮食诱导的胰岛素抵抗可以增加Aβ₄₀及Aβ₄₂的产生，并伴有γ分泌酶活性的增加。进一步研究显示，此类鼠脑中胰岛素受体信号转导途径障碍，并可能通过降低PKB活性而影响GSK-3α的活性，从而导致Aβ产物的增加。曲忠森等报道糖尿病引起的Aβ₄₀生成异常增加可能是通过GSK-3途径，LiCl可明显降低Aβ的生成。

Arai等在一侧大脑中动脉阻塞(MCAO)的动物模型上发现，在同侧脑梗死灶周围的皮层及远离病灶的双侧海马，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和TrkB mRNA表达均增加。Kokaia等发现MCAO 2h后，在缺血的周边区BDNF mRNA表达明显增加，海马的CA1区的表达也增加，再灌注2h表达水平最高。Schabitz等在MCAO阻塞前24 h开始给大鼠脑室内注射BDNF，结果表明其脑缺血后梗死灶较对照组明显缩小。Kiprianova等在整个大脑半球缺血的模型上向脑室内连续注射BDNF后发现，BDNF能防止海马CA1区神经元死亡。由此可见，脑缺血缺氧可诱导内源性BDNF和TrkB mRNA的表达增加，在缺血缺氧状态下，BDNF能促进神经细胞的存活和损伤修复。

中枢胆碱能神经系统是学习、记忆神经环路的重要组成部分，BDNF可支持海马和前脑胆碱能神经元存活和分化，上调胆碱乙酰转移酶表达，并可通过影响海马胆碱能神经传递发挥促进学习、记忆的作用。此外，BDNF能增强海马突触后NMDA受体磷酸化，使本已下调的NMDA受体功能逆转，从而诱导长时程增强(long-term potentiation，LTP)，而后者被认为是学习记忆的细胞模式。由此可见，BDNF对学习、记忆功能障碍性疾病的治疗具有应用前景。

Hashimoto等研究表明，LiCl能提高皮质神经元内BDNF的含量，激活TrkB受体。

经文献检索发现，钨酸锂目前只限于化学工业上的应用，尚无治疗相关疾病的报道或专利申请。

发明内容

本发明的目的在于提供钨酸锂在制药中的应用，特别是应用在神经退行性疾病、糖尿病引起的神经病变、脑缺血(包括脑功能障碍)及其相关疾病的治疗药物的制备中。

钨酸钠(sodium tungstate)的分子式为Na₂WO₄，其阳离子钠并无活性；而氯化锂(lithium chloride)的分子式为LiCl，其阴离子的活性也非常有限；钨酸锂(lithiumtungstate)的分子式为Li₂WO₄，阴、阳离子都有活性，二者发挥协同作用，更好地抑制GSK-3的活性。通过抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；通过抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。由此预见，钨酸锂将成为一个非常有前途的治疗神经退行性疾病、治疗糖尿病引起的神经病变、治疗脑缺血(包括脑功能障碍)及其相关疾病的药物。

通过药效学试验证明，本发明提供的钨酸锂能明显改善神经退行性疾病、糖尿病引起的神经病变、脑缺血(包括脑功能障碍)等所引起的症状，且无明显毒副作用。通过抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；通过抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。

本发明与以往技术相比，具有如下优点：由于钨酸锂阴、阳离子均有活性，二者发挥协同作用，可以更好地抑制GSK-3的活性，降低Aβ的生成，以减少SP；抑制tau蛋白的过度磷酸化，以减少NFT。

具体实施方式

实施例1：钨酸锂促进新生小鼠大脑皮层神经元突起生长的作用

如表1-2所示，低浓度钨酸锂组与溶媒对照组相比，突起总数、突起长度、有突起的神经元数目均无显著性差异；中浓度钨酸锂组和高浓度钨酸锂组与溶媒对照组相比，突起总数、突起长度、有突起的神经元数目均有显著性增加，而以高浓度钨酸锂组的作用显著。且效果优于氯化锂组、钨酸钠组和氯化锂+钨酸钠组。

表1钨酸锂对培养48h大脑皮层神经元的影响(x±s，n＝10)

与溶媒对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

表2钨酸锂对不同培养期大脑皮层神经元存活数的影响(x±s，n＝10)

与溶媒对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例2：钨酸锂降低M146L细胞分泌的Aβ₄₂含量

M146L细胞株为转染了人类AD患者APP及突变型PS-1基因的CHO细胞。应用ELISA法定量检测Aβ₄₂的产量。如表3所示：低剂量的钨酸锂对Aβ42的生成没有影响，中、高剂量的钨酸锂可以明显降低Aβ42的产量，特别是高剂量组抑制率超过70％，呈现良好的量效关系。且效果优于氯化锂组、钨酸钠组和氯化锂+钨酸钠组。

表3钨酸锂对M146L细胞分泌的Aβ42的影响(x±s，n＝8)

与溶媒对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例3：钨酸锂降低侧脑室注射链脲霉素模型鼠的Aβ_1-40、Aβ_1-42含量

链脲霉素(streptozotocin，STZ)是一种亚硝基脲衍生物，在外周可以选择性破坏胰岛细胞，引起葡萄糖代谢紊乱，导致糖尿病；在中枢可以阻断胰岛素受体自身磷酸化和内在的酪氨酸激酶活性，导致胰岛素信号传导障碍。

选取成年SD大鼠20只，随即分为5组：正常对照组、溶剂对照组、钨酸锂低、中、高剂量组。溶剂对照组和钨酸锂低、中、高剂量组采用脑立体定位仪于双侧侧脑室各注射STZ10μl(3mg/kg)，第3天重复注射。正常对照组按上述方法以等量生理盐水替代STZ。造模1周后，钨酸锂低、中、高剂量组采用脑立体定位仪于双侧侧脑室各注射钨酸锂2μl，4μl，8μl(浓度为1mmol/L)。

免疫组化结果表明：溶剂对照组与钨酸锂低剂量组海马及皮层均可见大量棕褐色Aβ_{1- 40}、Aβ_1-42阳性细胞，胞质及轴突、树突均清晰着色。正常对照组与钨酸锂高剂量组阳性细胞数很少。而钨酸锂中剂量组介于二者之间。

实施例4：钨酸锂降低了注射链脲霉素造成2型糖尿病鼠的tau蛋白磷酸化程度

选取成年SD雄性大鼠20只，其中16只高脂高糖高蛋白饮食，4只正常饮食为对照组。8周后，随机从高脂高糖高蛋白饮食组中取8只，按照20～25mg/kg剂量腹腔一次性注射链脲霉素，造成2型糖尿病模型(T2DM组)。余8只高脂高糖高蛋白饮食大鼠为肥胖模型(OB组)按照上述方法腹腔注射柠檬酸缓冲液。1周后，T2DM组和OB组各随机取4只，采用脑立体定位仪于海马背侧分别注射钨酸锂2μl(浓度为4mmol/L)。蛋白质印迹检测结果表明，糖尿病模型组及肥胖模型组中tau蛋白在位点Ser199、Thr212、Thr217及Ser396上的磷酸化程度显著高于对照组；而钨酸锂组则与对照组无明显差异。

实施例5：钨酸锂促进新生小鼠大脑皮层神经元脑源性神经营养因子表达

应用ELISA法定量检测BDNF的产量。如表4所示：低剂量的钨酸锂对BDNF的生成没有影响，中、高剂量的钨酸锂可以明显提高BDNF的产量，呈现良好的量效关系。

表4钨酸锂对皮层神经元分泌的BDNF的影响(x±s，n＝8)

与溶媒对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

Claims (3)

1、钨酸锂在制备治疗阿尔茨海默氏病的药物中的应用。

2、钨酸锂在制备治疗糖尿病引起的神经病变的药物中的应用。

3、钨酸锂在制备治疗脑缺血的药物中的应用。