CN100515423C - 维力波糖在制备治疗或预防糖尿病微血管病变药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了维力波糖在制备治疗糖尿病微血管病变药物中的应用，本发明还公开了维力波糖在制备预防糖尿病微血管病变药物中的应用。维力波糖能改善糖尿病微血管病变的症状，诸如糖尿病肾病变等，有利于延缓糖尿病微血管病变的发生和发展，可用于糖尿病微血管病变的预防和治疗。

Description

维力波糖在制备治疗或预防糖尿病微血管病变药物中的应用

技术领域

本发明涉及维力波糖的应用，具体地说涉及维力波糖在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

本发明还涉及维力波糖在制备预防糖尿病并发症药物中的应用。

背景技术

维力波糖(valibose)(化学名：(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇)在美国专利US 4,701,559中已被公开，其结构式[I]为：

维力波糖是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，口服后能竞争拮抗性地抑制肠道内双糖类水解酶(α-葡萄糖苷酶)，从而延缓了糖类的消化和吸收，进而改善餐后高血糖。餐后高血糖会使胰岛素的分泌和胰岛素的作用出现障碍，使糖代谢进一步恶化，因此纠正餐后高血糖对于防止糖尿病及其并发症的发展是非常重要的。

糖尿病微血管病变是糖尿病(Diabetes mellitus)的特征性病理改变，是糖尿病慢性并发症的共同危险因素，是导致糖尿病成为致盲、晚期肾脏病变的主要原因，也因此成为临床和基础研究的热点之一。糖尿病的发病率逐年增高，已经成为人类健康的主要威胁，预计到2010年将由2000年的1.5亿患者增加到2.2亿，由其引起的糖尿病特征性微血管病变，如糖尿病性肾病变、视网膜病变等的发病率也逐年攀升。

糖尿病微血管病变常伴有微循环异常，为并发许多脏器病变的病理基础。病变分布非常广泛，尤以肾小球、眼底、神经、心肌、肌肉等微血管为主，引起肾脏病变、视网膜病变、神经病变、心肌及肌肉病变。其中糖尿病肾病和糖尿病视网膜微血管病变是糖尿病最主要和最严重的两种微血管并发症。

在糖尿病肾病的病程演变过程中，早期糖尿病肾病期，又称“持续微量白蛋白尿期”是一个很重要的转折时期，因此微量白蛋白尿就成为临床诊断糖尿病肾病的早期主要线索。不仅如此，微量白蛋白尿的出现还与糖尿病的多种并发症有关，所以它还能够反映糖尿病患者的微血管病变。

王晓东等人(中华医学杂志，1988年，第68卷第4期，215～217)对91例糖尿病病人的尿NAG酶(N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶)的变化作了临床研究。结果显示25例胰岛素依赖型糖尿病和66例非胰岛素依赖型糖尿病病人尿NAG酶排出量均高于正常对照组(P＜0.01)，尿NAG酶水平与尿白蛋白排量和视网膜微血管病变程度关系密切，是一项识别早期糖尿病肾病的有用指标。

很多临床研究资料表明，高血糖与I型和II型糖尿病并发微血管病变有很大的关系，积极的血糖控制不能够预防但可以延缓糖尿病微血管并发症的发生和发展，但是尽管如此，糖尿病并发肾、眼等微血管病变的发生率仍然很高。目前尚无有效的药物能够早期预防与控制糖尿病微血管病变的发生与发展。

发明内容

本发明的目的在于提供维力波糖在制备治疗糖尿病微血管病变药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供维力波糖在制备预防糖尿病微血管病变药物中的应用。

根据本发明的一方面，本发明所述的维力波糖可以改善糖尿病引起的糖代谢异常，缓解和改善长期高血糖引起的糖尿病微血管病变的症状，诸如NAG酶活性增高、血清尿素氮含量增大、心脏指数和肾脏指数升高、肾脏肥大以及肾小管上皮细胞糖原沉积等，且具有很好的用药安全性，从而可以用于治疗糖尿病微血管病变。

根据本发明的另一方面，本发明所述的维力波糖可以改善糖尿病引起的糖代谢异常，降低血清NAG酶活性和血清尿素氮含量，降低心脏指数和肾脏指数、防止肾脏病变，且具有很好的用药安全性，从而可以用于预防糖尿病进一步转化成糖尿病微血管病变。

本发明所述的糖尿病微血管病变包括多脏器病变，诸如肾脏病变、视网膜病变、神经病变、心肌及肌肉病变等，尤其是指糖尿病肾病或糖尿病视网膜病变。

以维力波糖为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料并通过本领域的常规方法可以制备用于本发明的药物制剂。本药物制剂的剂型可以是：口服给药的剂型诸如片剂、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊和微囊)、粉剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型诸如注射剂、栓剂、丸剂、凝胶剂和贴剂。除这些常规剂型外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)用于本发明，通过常规方法也可以制备这些制剂。本发明中的制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。本发明特别优选的是将维力波糖用于口服给药的剂型。

本发明中的药用辅料包括用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、发泡剂、包衣剂等，或用于半固体制剂、液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、润肤剂、乳化剂等，此外，也可以根据需要使用其它药用添加剂诸如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和调味剂等。

根据所治疗的对象、剂型、给药方法等可以对本发明药物制剂的剂量进行合适的选择。对于人的口服给药来说，将剂量进行这样一种选择使得维力波糖的有效量通常为1mg～500mg/60kg体重/天，优选5mg～30mg/60kg体重/天，特别优选7.5mg～15mg/60kg体重/天。就口服缓释剂型而言，应以活性组分的量/天在上述剂量范围内的方式给药。就非口服给药而言，其给药剂量取决于剂型。总之，所述的剂量要足以使所述剂型表现出与口服制剂相同功效的药物有效量。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图的简要说明

图1为维力波糖对STZ糖尿病大鼠尿糖的影响

Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠对照组，维力波糖(0.4mg)、维力波糖(0.9mg)、维力波糖(1.6mg)为维力波糖给药组，剂量分别为0.4mg/kg体重、0.9mg/kg体重和1.6mg/kg体重；与对照组Con比较，^*P＜0.05，^***P＜0.001；n＝8-10

图2为维力波糖对STZ糖尿病大鼠肾脏、心脏指数的影响

Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠对照组，维力波糖(0.4mg)、维力波糖(0.9mg)、维力波糖(1.6mg)为维力波糖给药组，剂量分别为0.4mg/kg体重、0.9mg/kg体重和1.6mg/kg体重；与对照组Con比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；n＝8-10

图3为正常大鼠组大鼠肾脏病理切片光镜照片

光镜照片表明，正常大鼠组大鼠肾脏结构正常，未见病变。

图4为STZ糖尿病大鼠对照组大鼠肾脏病理切片光镜照片

光镜照片表明，高血糖对照组大鼠大部分肾小球囊纤维样渗出，近曲管直部上皮细胞浆溶解或空泡变性。

图5为维力波糖0.4mg/kg体重给药组大鼠肾脏病理切片光镜照片

光镜照片表明，维力波糖0.4mg/kg体重给药组大鼠少部分肾小球囊纤维样渗出，近曲管直部上皮细胞浆溶解或空泡变性。

图6为维力波糖0.9mg/kg体重给药组大鼠肾脏病理切片光镜照片

光镜照片表明，维力波糖0.9mg/kg体重给药组大鼠肾小球未见明显变化，上皮细胞空泡变性情况减少。

图7为维力波糖1.6mg/kg体重给药组大鼠肾脏病理切片光镜照片

光镜照片表明，维力波糖1.6mg/kg体重给药组大鼠肾小球未见明显变化，上皮细胞空泡变性情况减少。

图8为经口灌胃维力波糖对雄性小鼠体重变化曲线

图9为经口灌胃维力波糖对雌性小鼠体重变化曲线

图10为经口灌胃维力波糖对雄性大鼠体重变化曲线

图11为经口灌胃维力波糖对雌性大鼠体重变化曲线

图12为腹腔注射维力波糖对雄性小鼠体重变化曲线

图13为腹腔注射维力波糖对雌性小鼠体重变化曲线

图14为腹腔注射维力波糖对雄性大鼠体重变化曲线

图15为腹腔注射维力波糖对雌性大鼠体重变化曲线

具体实施方式

在以下药效学试验和急性毒性试验中所使用的维力波糖均为由深圳太太药业有限公司提供的结晶形态维力波糖，其具体制备方法及物理性质的测定结果如下：

I、制备方法

1、原料Validamine的制备

原料Validamine可以由现有技术文献中公开的方法制备，例如：.J.Antibiotics24：57-58，1971和Chem.Lctt.，1989，725-728(Harii，s.j.T.Iwasa & Y.Kameda)中描述的方法，本发明的制备工艺中，原料Validamine的制备是通过由井岗霉素A(购自浙江钱江生物化学有限公司，含量60％)经水解得到validoxylamineA，再由validoxylamineA与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应，得到validamine。

反应式如下：

将反应产物用CG-50NH₄ ⁺弱酸型阳离子树脂柱，0.1N氨水洗脱分离得到纯的Validamine和Valienamine。

2、结晶形态维力波糖的制备

反应式如下：

在2600毫升无水甲醇(分析纯)中，加入Validamine104克(587毫摩尔)、1，3二羟基丙酮82.3克(FRUKA 97％，886毫摩尔)、冰醋酸10.4毫升、氰基硼氢化钠76.5克(营口三征化工有限公司97％，1.18摩尔)，回流反应6小时。反应结束后，蒸除甲醇，加水500毫升，用2N HCl酸化至pH1.5，再用NaOH中和至pH6。分别经过PURLITE C100H⁺型强酸型阳离子树脂柱(水/0.5N氨水)、YD CG-50NH₄ ⁺弱酸型阳离子树脂柱(0.1N氨水)、HZ-202OH^-强碱型阴离子树脂柱(H₂O)，TLC跟踪检测(展开剂：正丁醇∶甲醇∶氯仿∶氨水＝5∶4∶2∶5；显色剂：0.2％茚三酮乙醇溶液；Rf＝0.46(validamine)；Rf＝0.52(valibose))。合并茚三酮呈阳性与Valibose对照品Rf值相同的组分，减压浓缩至干，用乙醇溶解，加晶种析晶，得93克。收率：63.1％，mp：88-89℃。

II、结晶形态维力波糖物理性质测定

通过对上述制备方法获得的结晶形态维力波糖进行核磁共振分析和元素分析发现，所获得的结晶形态维力波糖与无定形维力波糖粉末得到了完全相同的结果，表明本试验获得的维力波糖与美国专利US 4,701,559中已被公开的维力波糖具有完全相同的化学结构，结构式均为(+)-(1S，2S，3S，4R，5R)-1-氨基-5-羟甲基-N-2-(1，3-二羟丙基)-2，3，4-环己三醇)。

1、核磁共振分析

仪器：Varian 500

结果：¹H-NMR(D₂O，500MHZ)δ

1.32(1H，ddt，J＝3，1.5，15)，1.80-1.87(1H，m)，1.92(1H，dt，J＝3，15)，2.78(1H，m，J＝5.5)，3.15(1H，dd，J＝3.5)，3.25(1H，dd，J＝10.5).3.50-3.55(2H，m)，3.57(2H，t，J＝4.5)，3.62(2H，t，J＝5.5)，3.65(1H，dd，J＝5，11.5)，3.72(1H，dd，J＝3.5，11)；

¹³C-NMR(D₂O，75MHZ)δ

28.61，38.97，55.63，59.28，61.31，62.70，63.19，73.91，74.21，75.34

2、元素分析(C₁₀H₂₁NO₆)

仪器：德国ELEMENTAR公司vario EL元素分析仪

计算值：(％)C，47.80；H，8.42；N，5.57

实测值(两次)：(％)C，47.90/47.84；H，8.56/8.57；N，5.41/5.45

药效学试验

【实施例1】

以维力波糖为试验药物，考察了维力波糖对链脲霉素糖尿病大鼠一般状况、血糖、果糖胺、尿糖、血NAG酶活性、血清尿素氮和肌酐含量以及肾脏病理变化的影响。采用NAG酶(N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶)作为反映糖尿病微血管病变的敏感指标，NAG酶是广泛存在于肾实质的一种溶酶体酶，与尿液白蛋白排量和视网膜微血管病变程度关系密切，随着微血管病变加重，NAG酶活性增加；进一步的，采用血中尿素氮和肌酐含量、肾脏指数以及肾脏病理变化作为反映肾功能的变化的指标。

在链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠喂食高糖饲料的长期实验中(5周)，维力波糖使糖尿病动物的三多症状明显缓解，禁食血糖、非禁食血糖、血清果糖胺、尿糖明显降低，说明维力波糖改善了高血糖动物糖代谢；并且维力波糖使血清NAG酶活性、血清尿素氮含量、肾脏肥大以及肾小管上皮细胞糖原沉积等糖尿病早期肾病变的特征有明显改善，提示维力波糖可能有利于糖尿病某些慢性并发症的预防和治疗。

一、试验材料

(一)试验药物

1、维力波糖

化学合成的化合物，由深圳太太药业有限公司提供(制备方法如上所述)。批号为20030801，分子量251，外观呈白色粉末，纯度为99.8％，实验时用去离子水配制成所需浓度。

(二)试验动物

1、链脲霉素(streptozotocin，简称STZ)糖尿病大鼠

正常SD大鼠腹腔注射链脲霉素58mg/kg(以pH 4.0柠檬酸缓冲液配制)，72小时后预测血糖，选用血糖在250-450mg/dl的大鼠进行实验分组。

2、正常大鼠

正常雄性SD大鼠，140-160g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2002-0003，饲养于中国医学科学院药物研究所二级动物房。

二、试验方法

根据α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机理特点，并结合维力波糖预试验研究结果，选取四组链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠，每组10只。对照组以高蔗糖饲料(蔗糖∶基础饲料＝1∶1)喂养，其余三组分别饲以含不同剂量维力波糖(0.4mg/kg体重、0.9mg/kg体重、1.6mg/kg体重，为实验结束后根据该组每天平均摄食量计算所得)的高蔗糖饲料(0.4mg/100g料、1mg/100g料、2.5mg/100g料)，同时设一组正常大鼠(n＝10)饲以正常饲料作为正常动物组，以上各组均自由摄食饮水，每天观察动物一般状况，记录摄食量和饮水量，一周后取血测血糖，三周后取血测果糖胺、血N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)活性、血清尿素氮及肌酐含量等生化指标，四周后用代谢笼收集尿液测6小时尿糖含量，实验结束时，断头处死动物，称体重、肾及心脏重量，肾脏用10％福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，苏木素伊红染色，光镜下观察肾脏病理变化。

三、试验结果

1、摄食量和饮水量的变化

结果见表1。结果表明，维力波糖给药组的糖尿病大鼠摄食量和饮水量多的症状均极显著的减轻。

表1  维力波糖对STZ糖尿病大鼠摄食量、饮水量的影响(X±SD)

与Con比较，^***p＜0.001；n＝9-10；Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠对照组，其他为维力波糖给药组

2、维力波糖对STZ糖尿病大鼠血糖的影响

结果见表2。结果表明，给药18天时，维力波糖给药组的未禁食血糖含量均极显著的低于对照组，禁食血糖含量也不同程度降低。

表2  维力波糖对STZ糖尿病大鼠血糖的影响(X±SD)

与Con比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；n＝9-10；Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠对照组，其他为维力波糖给药组

3、维力波糖对STZ糖尿病大鼠血清果糖胺的影响

果糖胺是血浆白蛋白与葡萄糖分子在非酶糖化过程中经过分子重排形成的醛酮缩合物。由于白蛋白浓度在体内的稳定性，故血清果糖胺水平亦比较稳定，不受摄食的影响，它反映1-2周内的血糖水平的变化。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

结果见表3。结果表明，维力波糖0.9mg/kg体重和1.6mg/kg体重给药组的血清果糖胺水平均显著低于对照组。

表3  维力波糖对STZ糖尿病大鼠果糖胺的影响(X±SD)

与Con比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；n＝9-10；Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠对照组，其他为维力波糖给药组

4、维力波糖对STZ糖尿病大鼠尿糖含量的影响

结果见图1。结果表明，维力波糖给药组的尿糖含量均极显著的低于对照组。

5、维力波糖对STZ糖尿病大鼠血清NAG酶活性的影响

NAG酶(N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶)是广泛存在于肾实质的一种溶酶体酶，与尿液白蛋白排量和视网膜微血管病变程度关系密切，是反映微血管病变的敏感指标。随着微血管病变加重，NAG酶活性增加(终点法测定)。

结果见表4。结果表明，维力波糖0.9mg/kg体重和1.6mg/kg体重给药组大鼠NAG酶活性降低，且NAG酶活性降低的程度随着给药量的增加而增大。

表4  维力波糖对STZ糖尿病大鼠血清NAG酶活性的影响(X±SD)

与Con比较，^*P＜0.05，^***P＜0.001；n＝9-10；Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠对照组，其他为维力波糖给药组

6、维力波糖对STZ糖尿病大鼠肾脏指数和心脏指数的影响

结果见图2。结果表明，维力波糖给药组的动物肾脏指数均极显著的降低，心脏指数也不同程度的低于对照组。

7、维力波糖对STZ糖尿病大鼠血清尿素氮和肌酐含量的影响

测定血中尿素氮和肌酐含量可以了解肾功能的变化。血清尿素氮、肌酐含量升高，则表示肾功能异常。测定按照北京中生生物工程技术公司的试剂盒方法进行。

结果见表5。结果表明，维力波糖给药组的动物血清尿素氮水平均不同程度减少。

表5  维力波糖对STZ糖尿病大鼠血清尿素氮和肌酐含量的影响(X±SD)

与对照组Con比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；n＝9-10；Nor为正常大鼠组，Con为STZ糖尿病大鼠组，其他为维力波糖给药组

8、维力波糖对STZ糖尿病大鼠肾脏病理变化的影响

实验各组大鼠肾脏用10％福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，苏木素伊红染色，光镜观察。

结果见图3～7。结果表明，正常大鼠肾脏结构正常，未见病变；高血糖对照组大鼠大部分肾小球囊纤维样渗出，近曲管直部上皮细胞浆溶解或空泡变性；维力波糖0.4mg/kg体重给药组大鼠少部分肾小球囊纤维样渗出，近曲管直部上皮细胞浆溶解或空泡变性；维力波糖0.9mg/kg体重和1.6mg/kg体重给药组肾小球未见明显变化，上皮细胞空泡变性情况减少。说明维力波糖对STZ诱发糖尿病大鼠肾脏病变具有一定的保护作用。

上述结果说明，STZ糖尿病大鼠长期(5周)服用维力波糖后，能明显改善多食多饮等一般状况；能使血糖、血清果糖胺明显下降；使血清NAG酶活性明显下降；减少血清尿素氮水平，降低肾脏指数和心脏指数；改善肾曲管病变。

四、试验结论：

STZ糖尿病大鼠长期实验(5周)结果表明，维力波糖使糖尿病大鼠三多症状明显减轻(表1)；禁食血糖、非禁食血糖、血清果糖胺水平及尿糖含量等均明显低于对照组(表2、3，图1)，说明维力波糖有利于高血糖动物糖代谢的改善。维力波糖0.9mg/kg体重和1.6mg/kg体重给药组的血清果糖胺浓度降低说明动物的血糖已得到较稳定的控制。STZ糖尿病大鼠喂食高糖饲料可加速糖尿病大鼠糖尿病微血管并发症的发生与发展，表现为对照组血清NAG酶活性增加，肾脏肥大以及肾小管上皮细胞糖原沉积等，而维力波糖给药组动物NAG酶活性降低(表4)，肾脏指数和心脏指数明显降低(图2)，血清尿素氮水平减少(表5)，肾小球病变及肾小管上皮细胞空泡变性改善(图3～7)，说明维力波糖在改善高血糖动物糖代谢异常的同时，有利于延缓糖尿病微血管病变及肾病变的发生和发展。

维力波糖的急性毒性试验

【实施例2】

以维力波糖为试验药物，进行了大、小鼠急性毒性试验。在试验中，观察了维力波糖单次给予大鼠、小鼠所产生的急性毒性反应和死亡情况，分别得出大鼠、小鼠经口灌胃给药和腹腔注射给药的最大耐受剂量。结果表明：健康清洁级SD大鼠和ICR小鼠分别单次经口灌胃(po)和腹腔注射(ip)给予维力波糖，大、小鼠在整个试验期间均无明显异常反应。经口灌胃(po)给予维力波糖的最大耐受剂量为：大鼠＞5g/kg；小鼠＞7.5g/kg。腹腔注射给予维力波糖的最大耐受剂量为：大鼠＞3g/kg；小鼠＞4.5g/kg。

一、试验材料

(一)试验药物

1、维力波糖，化学合成的化合物，白色结晶粉末，极易溶于水，极易吸潮，冰箱冷藏(外加干燥剂)。含量：99.5％，水分：1.34％，熔点：88～89℃，批号20030801，由深圳太太药业有限公司提供(制备方法如上所述)。

2、蒸馏水(自制)，供药物配制用。

(二)试验动物

健康SD大鼠，清洁级，80只，雌雄各半，体重130-150g；健康ICR小鼠，清洁级，80只，雌雄各半，体重19-21g；由浙江省试验动物中心供应，动物质量合格证：医动字第22-2001001号。饲养于全封闭清洁级动物房内，温度20-22℃，相对湿度50-60％，光照12小时暗，12小时明，中央空调集中通风8-15次/小时。喂饲全价营养颗粒饲料，由浙江省实验动物中心饲料生产基地供应。实验动物饲料合格证：医动字第22-2001001号。饮水为城市自来水用净水器过滤后装入消毒过的饮水瓶中自由饮用。

二、试验方案

1、剂量组别

经口灌胃      腹腔注射

大鼠5g/kg     大鼠3g/kg

小鼠7.5g/kg   小鼠4.5g/kg

以上剂量临用时用蒸馏水配成所需浓度的溶液，供大鼠、小鼠经口灌胃、腹腔注射用。

2、剂量确定依据

(1)经口灌胃：根据预试全活剂量，大鼠5g/kg、小鼠7.5g/kg；

(2)腹腔注射：根据预试全活剂量，大鼠3g/kg、小鼠4.5g/kg；

(3)根据国家新药临床前研究指导原则的有关规定确定。

3、给药途径

经口灌胃(po)、腹腔注射(ip)两个途径。

4、给药容量

小鼠po、ip：0.5ml/20g体重；大鼠po、ip：2.0ml/100g体重。

5、试验方法

根据国家食品药品监督管理局《药品非临床研究质量管理规范》和参考中华人民共和国卫生部药政局《新药(西药)临床前研究指导原则》“急性毒性试验”方法要求进行。

取上述符合试验要求的清洁级大鼠、小鼠各80只，雌雄各半，分别按体重随机分成四组，即经口灌胃(po)维力波糖给药组和溶剂对照组，腹腔注射维力波糖给药组和溶剂对照组。每组20只，雌雄各半。给药前不禁水12小时以上(前一天晚上十八点三十分始禁食，次日上午九点前给药)。给药容量为小鼠每20g体重0.5ml、大鼠每100g体重2.0ml。给药后即刻观察动物的反应情况，包括动物外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便及其颜色、皮毛、鼻、眼、口有无异常分泌物以及死亡情况，死亡动物及时尸检，若肉眼观察有病变脏器则进行病理组织学检查。给药第一天每隔30分钟到1小时观察1次，以后每天观察并称体重一次，连续观察10天，记录动物毒性反应及死亡分布情况。以体重变化、反应情况，综合评价试验结果，分别得出维力波糖对大鼠、小鼠单次经口灌胃和腹腔注射的最大耐受剂量。若出现死亡，则进行急性半数致死量(LD₅₀)的测定，列表表示。

三、试验结果

1、经口灌胃最大耐受剂量测定

雌雄小鼠单次经口灌胃(po)给予维力波糖7.5g/kg剂量，雌雄大鼠单次经口灌胃(po)给予维力波糖5g/kg剂量，给药后即刻和在整个试验期间观察均未出现任何异常反应，也未出现动物死亡。虽雌性小鼠在给药后第1、2、4天和雄性小鼠给药后第1、2天的平均体重轻于相应时间的对照组(p＜0.01、0.05)，但每鼠的活动正常，并且其它时间及雌雄大鼠整个试验期间的平均体重均随试验时间的延长而增加，与相应时间的对照组相同(p＞0.05)，详见表6、表7、表8、表9和图8、图9、图10、图11。

表6  小鼠经口灌胃给予维力波糖最大耐受量测定结果

表7  小鼠经口灌胃给予维力波糖最大耐受量测定体重(g)变化情况(X±SD)

与相应时间的对照组相比较：^*P＜0.01、△P＜0.05。

表8  大鼠经口灌胃给予维力波糖最大耐受量测定结果

表9  大鼠经口灌胃给予维力波糖最大耐受量测定体重(g)变化情况(X±SD)

2、腹腔注射最大耐受剂量测定

雌雄小鼠单次腹腔注射(ip)给予维力波糖4.5g/kg剂量，雌雄大鼠单次腹腔注射(ip)给予维力波糖3g/kg剂量，给药后即刻和在整个试验期间观察均未出现任何异常反应，也未出现动物死亡。虽雄性小鼠在给药后第9、10天的平均体重轻于相应时间的对照组(p＜0.01、0.05)，雌性小鼠在给药后第1、2天和雌性大鼠给药后第10天的平均体重轻于相应时间的对照组(p＜0.01、0.05)。但每鼠的活动正常，并且其它时间及雌雄大鼠整个试验期间的平均体重均随试验时间的延长而增加，与相应时间的对照组相同(p＞0.05)，详见表10、表11、表12、表13和图12、图13、图14、图15。

观察期结束后处死动物尸检肉眼观察，各剂量组动物均未见脏器异常变化。

表10  小鼠腹腔注射给予维力波糖最大耐受量测定结果

表11  小鼠腹腔注射给予维力波糖最大耐受量测定体重(g)变化情况(X±SD)

与相应时间的对照组相比较：^*P＜0.01、△P＜0.05。

表12  大鼠腹腔注射给予维力波糖最大耐受量测定结果

表13  大鼠腹腔注射给予维力波糖最大耐受量测定体重(g)变化情况(X±SD)

与相应时间的对照组相比较：^*P＜0.01。

四、试验结论

根据以上试验结果和表6～13的情况，在本试验剂量条件下，健康清洁级SD大鼠和ICR小鼠分别单次经口灌胃(po)和腹腔注射(ip)给予维力波糖，大、小鼠在整个试验期间均无明显异常反应。大鼠、小鼠分别单次经口灌胃(po)给予维力波糖的最大耐受剂量为：大鼠＞5g/kg，小鼠＞7.5g/kg。大鼠、小鼠分别单次腹腔注射(ip)给予维力波糖的最大耐受剂量为：大鼠＞3g/kg，小鼠＞4.5g/kg。

人体用药剂量确定的依据

本研究中，按照本领域技术人员所知的常规方法来确定用药剂量。首先用小鼠粗略地探索维力波糖的中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量作为应用剂量，由此确定小鼠的最小有效剂量约为2mg/kg；由上述急性毒性试验结果可知，大鼠、小鼠分别单次经口灌胃(po)给予维力波糖的最大耐受剂量为：大鼠＞5g/kg，小鼠＞7.5g/kg，大鼠、小鼠分别单次腹腔注射(ip)给予维力波糖的最大耐受剂量为：大鼠＞3g/kg，小鼠＞4.5g/kg，由此可推测出维力波糖用于人体的剂量范围会很宽，具有很高的用药安全性；又由上述药效学试验结果可知，在试验所采用的剂量范围(0.4～1.6mg/kg体重)内，维力波糖改善链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠糖尿病微血管病变的作用随剂量的加大而增强。

用药剂量的确定还考虑到维力波糖的药代试验结果，该药以AUC_0-t平均值计算，在1.0mg.kg^-1剂量下大鼠灌胃给药后的绝对生物利用度平均为15.26％；以AUC_0-t平均值计算，在0.297mg·kg^-1剂量下犬灌胃给药后的绝对生物利用度为26.27％，因此预计维力波糖在体内有20％左右的血浆结合和吸收，理论用量将增加20％左右。

综合考虑以上试验结果，并按人用药量：小白鼠、大白鼠用药量为1∶25-50的常用比例进行换算，确定维力波糖人体口服用药剂量范围时还考虑到患者临床用药时的顺应性。由此确定维力波糖人体口服用药剂量为1mg～500mg/60kg体重/天，优选5mg～30mg/60kg体重/天，特别优选7.5mg～15mg/60kg体重/天。就口服缓释剂型而言，应以活性组分的量/天在上述剂量范围内的方式给药。就非口服给药而言，其给药剂量取决于剂型。如以口服量为100时，皮下注射量30-50，肌肉注射量为25-30，静脉注射量为25。总之，所述的剂量要足以使所述剂型表现出与口服制剂相同功效的药物有效量。

口服药物制剂

【实施例3】

I处方                1000片的含量

维力波糖             2.5g

乳糖                 112.5g

羟丙基甲基纤维素     适量

交聚维酮             2.4g

硬脂酸镁             1.2g

欧巴代               适量

原料药维力波糖按照上面描述的方法制备，其他辅料为市售购买商品。

II制法

将各原辅料均过80目筛，按处方分别准确称量；用75％乙醇配制羟丙基甲基纤维素溶液作为粘合剂；将维力波糖与部分乳糖在适宜容器中按倍倍稀释法混合均匀，然后同剩余量乳糖、处方量交聚维酮混合，再加粘合剂混合后，过20目筛制湿颗粒；将湿颗粒放入热风循环烘箱中，温度控制在55-65℃，烘至含水分1.5-2.0％，用20目筛整粒；将制好的颗粒，加处方量硬脂酸镁混合后压片；用包衣材料欧巴代配制包衣液，将素片进行包衣。

以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1、维力波糖在制备治疗糖尿病微血管病变药物中的应用。

2、权利要求1所述的应用，其特征在于所述糖尿病微血管病变为糖尿病肾病。

3、权利要求1所述的应用，其特征在于所述糖尿病微血管病变为糖尿病视网膜病变。

4、权利要求1所述的应用，其特征在于所述维力波糖是口服给药剂型。

5、权利要求1所述的应用，其特征在于所述维力波糖的给药剂量范围为1mg～500mg/60kg体重/天。

6、权利要求5所述的应用，其特征在于所述维力波糖的给药剂量范围为5mg～30mg/60kg体重/天。

7、权利要求6所述的应用，其特征在于所述维力波糖的给药剂量范围为7.5mg～15mg/60kg体重/天。

8、维力波糖在制备预防糖尿病微血管病变药物中的应用。

9、权利要求8所述的应用，其特征在于所述糖尿病微血管病变为糖尿病肾病。

10、权利要求8所述的应用，其特征在于所述糖尿病微血管病变为糖尿病视网膜病变。

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