CN100510069C - 等温单向生长的基因合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的等温单向生长的基因合成方法。具体包括以下步骤：(1)根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链；(2)在多种酶的协同作用下进行等温生长，合成目标DNA长链；(3)以步骤(2)中所得的产物为模板进行PCR扩增，获取目标序列长度的PCR产物。本发明具有成功率高，出错率低，设计简单，适用面广，自动化高等特点，因而具有潜在的低成本优势，对于基因合成的推广，生物工程，生物医学和生物信息学等领域的发展存在潜在的应用价值。

Description

等温单向生长的基因合成方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，特别是一种等温单向生长的基因合成方法。

背景技术

随着生物技术及医学的发展，设计或改造基因正得到越来越多的关注。传统的基因扩增、克隆、重组和突变技术只能得到自然界已有或类似的DNA序列，要实现对基因的自由设计，必须对基因进行人工合成。基因的人工合成包括两个步骤：一是用酶法将化学合成的寡核苷酸链进行人工拼接，得到较长的序列；二是以较长序列为基础，进一步拼接得到更长的DNA序列，直至达到需要的长度。对于较短的DNA序列(<1kb)来说，一般无需步骤二。在基因人工合成中，步骤一是合成的关键步骤。目前主要有两种方法可以实现步骤一，分别是连接酶法和PCR法。

基因人工合成最初使用的是连接酶法(Khorana HG.Science.V203，614-625.1979)。在连接酶法中，引物序列之间存在互补的部分，可以相互杂交形成存在缺刻(nick)的长序列，这些缺刻可以在连接酶(T4 DNA ligase，Taqligase等)的作用下被去除，从而得到连续的长DNA序列。由于所有的连接酶都需要5’磷酸化的末端和3’羟基进行连接，所以在反应之前，用于连接的中间引物需要进行5’磷酸化处理，这就使得基因合成的成本大大增加。同时，为了保证合成的效率，单次连接酶反应合成较长序列的长度受到限制，通常不宜超过500bp.

基因人工合成的PCR法，又称PCA(Polymerase Cycling Assembly)法，1990年被Dillon等人首次用于合成一段303bp的HIV-2 rev基因(Dillon，P.J.&Rosen，C.A.(1990)BioTechniques 9，298-300.)，随后逐渐被推广应用。在引物设计方面，PCR法类似于连接酶法，引物之间需要一定程度的互补，互补的两条引物可以互为引物互为模板，经聚合酶的延伸，得到稍长的双链DNA，这些稍长的DNA之间也存在互补，从而可以继续延伸，这种过程在不同水平重复多次之后，便可以得到完整的双链。PCR法不需要对短序列进行任何修饰，因此合成成本较连接酶法大大降低。但由于是多种短序列间的并行反应，要合成的序列越长，则发生错误延伸的可能性就越大。一般来说，当序列大于500bp时，合成将变得难以进行。

PCR法通常还被用于更长序列的合成，如Smith等人(Hamilton 0.Smith，Clyde A.Hutchi son III，Cynthia Pfannkoch et al.PNAS.V100，15440-15445.2003)用Taq ligase对引物进行连接之后，再对连接产物进行PCR法合成，得到了全长的5,386bp的ΦX174 bacteriophage基因组。

经对现有技术文献检索发现，基因合成技术方面的专利大都涉及连接酶法的合成，例如US Patent 6,110,668描述了一种依赖于模板的基因合成方法，在这个方法中，合成的寡核苷酸可以杂交到模板上，而又与模板之间存在一些不匹配位点，用连接酶将这些寡核苷酸连接后，就可以得到一条与模板相似而又引入目标突变的序列。这一方法不能用于合成任意的序列，而且首先需要得到相似的模板，因而应用上很受限制。US Patent 6,521,427介绍了一种逐步连接的方法，在这个方法中，合成用的短寡核苷酸链逐个加入并杂交连接，或进行分组连接，组内连接之后进行组间连接；US Patent 6,670,127介绍了一种基于连接酶的类似方法。这些方法的优点是可以降低引物之间的错误杂交，缺点是操作复杂，而且也不能省去序列5’磷酸化的必要修饰，成本昂贵。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种等温单向生长的基因合成方法。使其成功率高、出错率低、设计简单、适用面广，将有利于降低成本和合成周期。

本发明是通过以下技术方案来实现的，本发明通过特殊的寡核苷酸序列设计方法，得到一系列用于延伸的包含发夹结构和酶切位点的寡核苷酸链，这些寡核苷酸链在多种酶的协同作用下进行等温生长，合成目标DNA长链。

具体包括以下步骤：

1、根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链；

2、在多种酶的协同作用下进行等温生长，合成目标DNA长链，

3、以2步中所得的产物为模板进行PCR扩增，获取目标序列长度的PCR产物。

PCR产物可以用于再次拼接、克隆或其它用途。

所述的设计并合成用于延伸的寡核苷酸链构成方法如下：

(1)将目标DNA序列称为正链的互补链称为负链分段成多个首尾相接的短序列，这些短序列的长度在15碱基到60碱基之间；

(2)在每个短序列的5’端首先加一个限制性内切酶识别位点，然后再加一段序列，这段序列与相应原短序列中的一段序列互补，从而使得整段序列能够形成一个发夹结构；

(3)在每个短序列的3’端添加一段序列为交叠片断，每个交叠片断与其左边相邻的短序列的5’端序列相同；

(4)设计一条位于目标DNA正链上的寡核苷酸链，使得其3’端与最左端负链寡核苷酸链的交叠片断互补，作为延伸的起始点。

所述的分段所得的短序列其长度20碱基到40碱基。

所述的左边相邻的短序列是指紧接相应短序列3’端的那条短序列。

所述的最左端负链寡核苷酸链是指所有负链寡核苷酸链中最靠近目标DNA负链3’端的负链寡核苷酸链。

如上所述的寡核苷酸链设计好后，可利用普通的寡核苷酸链自动合成仪合成。

所述的纯化是指中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(中性PAGE)纯化。

所述的等温生长，包括以下步骤：

(1)将负链寡核苷酸链和正链寡核苷酸链混合在反应体系中，并加入具有聚合酶、外切酶和限制性内切酶三种活性的混合酶；

(2)延伸反应的pH值为7-9.5；延伸反应的温度为20-40℃。

所述的反应体系是指可以有效发挥上述三种酶相应活性的体系，通过调节阳离子的浓度和种类，调节体系的pH值等得到。

所述的聚合酶可以是DNA聚合酶，也可以是RNA聚合酶；可以是耐热的，也可以是不耐热的；优选无3‘—5’外切酶活性的聚合酶，如Klenow exo-，反转录酶等。

所述的限制性内切酶是指type II型的，优选切割后的序列是3’悬挂的限制性内切酶，比如BtsI，Mva1269I等。

所述的外切酶是指具有双链特异性的5’-3’外切酶，优选lambda外切酶。

所述的延伸，在3个步骤的循环间进行：

(1)聚合酶延伸使得发夹结构打开，限制性内切酶位点成为双链；

(2)限制性内切酶对已经成为双链的位点进行切割；

(3)外切酶对切割后的负链进行消化，外切酶消化后，产生一段3’悬挂的单链区，这一段单链区包含一段交叠片断，因而可以与下一个负链寡核苷酸链杂交，进行下一轮的聚合酶延伸。

这三个步骤都在同一个温度下进行，温浴时间越长，序列的平均长度越长，直到目标DNA序列产生。

所述的PCR扩增，是指当目标DNA序列比较长时，延伸产生的目标DNA序列在产量上可能无法直接用于下游操作，如克隆，连接反应等，进行PCR扩增是需要的。PCR所用的引物可以是正链寡核苷酸链和最右端寡核苷酸链，也可以是重新设计的引物。

本发明具有成功率高、出错率低、设计简单、适用面广、操作简单、自动化高等特点，因而具有潜在的低成本优势，对于基因合成的推广，生物工程，生物医学和生物信息学等领域的发展存在潜在的应用价值。

附图说明

图1.本发明的基因合成过程流程示意图

图2.用于基因合成的寡核苷酸链构成示意图

图3.等温延伸反应示意图

图4.实施例1中PCR产物电泳图

具体实施方式

如图1、2、3所示，本发明根据图1.基因合成过程流程、用于基因合成的寡核苷酸链构成、等温延伸反应进行具体实施：

实施例1  Lambda外切酶基因中一段300碱基序列的合成

目标合成产物为一段来自lambda外切酶编码基因的长为300碱基的DNA序列，如下：

5’-ATGACACCGGACATTATCCTGCAGCGTACCGGGATCGATGTGAGAGCTGTCGAACAGGGGGATGATGCGTGGCACAAATTACGGCTCGGCGTCATCACCGCTTCAGAAGTTCACAACGTGATAGCAAAACCCCGCTCCGGAAAGAAGTGGCCTGACATGAAAATGTCCTACTTCCACACCCTGCTTGCTGAGGTTTGCACCGGTGTGGCTCCGGAAGTTAACGCTAAAGCACTGGCCTGGGGAAAACAGTACGAGAACGACGCCAGAACCCTGTTTGAATTCACTTCCGGCGTGAATGTT-3’

所用的聚合酶是Klenow exo-，外切酶是lambda外切酶，限制性内切酶是BtsI，这三种酶全部购自NEB公司。

基因合成过程如下：

(1)、根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链

寡核苷酸链设计的顺序是：

1.将300bp的DNA序列分段成首尾相连的9段短序列，每段长度在30~40碱基之间。如下：

 

名称	序列(5’-3’)
		SEG1.	ATGACACCGGACATTATCCTGCAGCGTACCGGGATCGATG
SEG2.	TGAGAGCTGTCGAACAGGGGGATGATGCGTG
		SEG3.	GCACAAATTACGGCTCGGCGTCATCACCGCTT
SEG4.	CAGAAGTTCACAACGTGATAGCAAAACCCCG
		SEQ5	CTCCGGAAAGAAGTGGCCTGACATGAAAATGTC
SEQ6.	CTACTTCCACACCCTGCTTGCTGAGGTTTGCACCG
		SEQ7.	GTGTGGCTCCGGAAGTTAACGCTAAAGCACT
SEQ8.	GGCCTGGGGAAAACAGTACGAGAACGACGCCAG
		SEQ9.	AACCCTGTTTGAATTCACTTCCGGCGTGAATGTT

2.在短序列的5’端添加BtsI识别序列，BtsI的识别序列和酶切方式为[GCAGTG(2/0)]，因而在每段序列的5’端添加6个碱基”GCAGTG”，除了第1段和第9段，在这两段序列的5’端添加的是HindIII(A＾AGCTT)和XbaI(T＾CTAGA)识别位点。

3.在识别位点的5’端再添加一段7~8个碱基的序列，使之与相应短序列的3’端互补。

4.在短序列的3’端再添加一段10~11个碱基的交叠片断。

最后设计好的序列通过Mfold webserver(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)软件检验，所有的寡核苷酸链都达到预期的二级结构。这些序列如下：

 

名称	序列(5’-3’)	长度/mer
			Seq.1	GTACGCTG AAGCTT ATGACACCGGACATTATCCTGCAGCGTACC GGGATCGATG	54
Seq.2	GAGAGCT GCAGTG CACGCATCATCCCCCTGTTCGACAGCTCTCA CATCGATCCC	54
			Seq.3	CACAAATT GCAGTG AAGCGGTGATGACGCCGAGCCGTAATTTGTGC CACGCATCAT	56
Seq.4	AGAAGTTC GCAGTG CGGGGTTTTGCTATCACGTTGTGAACTTCTG AAGCGGTGAT	55
			Seq.5	TCCGGAAA GCAGTG GGACATTTTCATGTCAGGCCACTTCTTTCCGGAG CGGGGTTTTG	58
Seq.6	TACTTCCA GCAGTG cgGTGCAAACCTCAGCAAGCAGGGTGTGGAAGTA GGACATTTTCA	59
			Seq.7	TGTGGCTC GCAGTG CAGTGCTTTAGCGTTAACTTCCGGAGCCACAC CGGTGCAAAC	56
Seq.8	GCCTGGGG GCAGTG CTGGCGTCGTTCTCGTACTGTTTTCCCCAGGC CAGTGCTTTAG	57
			Seq.9	ACCCTGTT TCTAGA AACATTCACGCCGGAAGTGAATTCAAACAGGGTT CTGGCGTCGT	58

寡核苷酸链由Sangon(上海)公司合成，PAGE纯化。

(2)、在多种酶的协同作用下进行等温生长，合成目标DNA长链

基因合成的体系是10mM Tris-HCl，pH9.0，50mM KCl，0.1％TritonX100，100uM each dNTP Mix，除了seq2浓度为0.03uM，其它寡核苷酸链的浓度皆为0.1uM，0.05U/ul Klenow exo-，0.05U/ul lambda外切酶，0.2U/ul BtsI。37℃温育1h。

(3)、以步骤(2)中所得的产物为模板进行PCR扩增，获取目标序列长度的PCR产物

取0.5ul步骤(2)中的温育结果，加入到10ul PCR体系中，以Seq.1和Seq.9对延伸产物进行PCR扩增。PCR体系的组成是10mM Tris-HCl，pH9.0，50mM KCl，0.1％TritonX100，200uM each dNTP Mix，两条引物各1uM及0.05U/ul Taq聚合酶(Sangon)，PCR程序为为94℃，10s，然后是30循环的94℃，20s，72℃，30s.最后在72℃延伸5min，得到一段328bp的序列。PCR产物的凝胶电泳结果见附图4。图中泳道1和6为100bp ladder(广州东盛生物科技有限公司)，其长度标于图中。泳道2～5，7～10分别为以Seq.1和Seq.2～Seq.9为引物的PCR产物。电泳所用的凝胶是8％中性聚丙烯酰胺，染色条件为0.02％亚甲基蓝染色3min，去离子水脱色30min。

克隆测序

将步骤(2)中得到的PCR产物与T载体(Promega公司)连接后，转入大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，挑选6个白斑菌株进行测序，发现所有的序列结果都显示目标长度的片断已成功合成，其中2个菌株含有完全正确的序列，而其它菌株则含有1～2个突变点，这些突变点大部分都是单碱基缺失。

实施例2Lambda外切酶基因中一段254碱基序列的合成

合成一段来自lambda外切酶编码基因的长为254碱基的DNA序列，序列如下：

5’-CAGTACGAGAACGACGCCAGAACCCTGTTTGAATTCACTTCCGGCGTGAATGTTACTGAATCCCCGATCATCTATCGCGACGAAAGTATGCGTACCGCCTGCTCTCCCGATGGTTTATGCGGTGACGGCAACGGCCTTGAACTGAAATGCCCGTTTACCTCCCGGGATTTCATGAAGTTCCGGCTCGGTGGTTTCGAGGCCATAAAGTCAGCTTACATGGCCCAGGTGCAGTACAGCATGTGGGTGACGCGAAA-3’

所用的聚合酶是Klenow exo-，外切酶是lambda外切酶，限制性内切酶是BtsI，这三种酶全部来自于NEB。

基因合成过程如下：

(1)、根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链

寡核苷酸链设计

寡核苷酸链的设计与实施例1相同，除了用于起始延伸的正链序列.所有寡核苷酸链如下：

分段后的短序列

 

名称	序列
		SEQi0	AACCCTGTTTGAATTCACTTCCGGC
SEQ11	GTGAATGTTACTGAATCCCCGATCATC
		SEQ12	TATCGCGACGAAAGTATGCGTACCGCCTGCT
SEQ13	CTCCCGATGGTTTATGCGGTGACGGCAACGGC
		SEQ14	CTTGAACTGAAATGCCCGTTTACCTCCCGG
SEQ15	GATTTCATGAAGTTCCGGCTCGGTGGTTTCGAGGC
		SEQ16	CATAAAGTCAGCTTACATGGCCCAGG
SEQ17	TGCAGTACAGCATGTGGGTGACGCGAAA

合成的寡核苷酸序列(St2为起始延伸的正链序列)

 

名称	序列(5’-3’)	长度/mer
			St2	CAGTACGAGAACGACGCCAG	20
Seq.10	AACCCTGT GCAGTG GCCGGAAGTGAATTCAAACAGGGTTCTGGCGTCGT	49
			Seq.11	GTGAATGTTA GCAGTG GATGATCGGGGATTCAGTAACATTCACGCCGGAAGT	52
Seq.12	TATCGCGA GCAGTG AGCAGGCGGTACGCATACTTTCGTCGCGATAGATGATCGGG	55
			Seq.13	CTCCCGAT GCAGTG GCCGTTGCCGTCACCGCATAAACCATCGGGAGAGCAGGCG	54

 

Seq.14	CTTGAACTG GCAGTG CCGGGAGGTAAACGGGCATTTCAGTTCAAGGCCGTTGC	53
			Seq.15	GATTTCATGA GCAGTG GCCTCGAAACCACCGAGCCGGAACTTCATGAAATCCCGGGAGG	59
Seq.16	CATAAAGTCA GCAGTG CCTGGGCCATGTAAGCTGACTTTATGGCCTCGAAAC	52
			Seq.17	TGCAGTACA TCTAGA TTTCGCGTCACCCACATGCTGTACTGCACCTGGGCC	51

引物由Invitrogen公司(上海)合成，PAGE纯化。

(2)、在多种酶的协同作用下进行等温生长，合成目标DNA长链

拼接过程与实施例1一致。

(3)、以步骤(2)中所得的产物为模板进行PCR扩增，获取目标序列长度的PCR产物

PCR过程与实施例一致，其中PCR所用的引物为St2和Seq.17。测序结果显示目标序列成功合成。

Claims (8)

1、一种等温单向生长的基因合成方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)、根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链，具体是指：

①将目标DNA序列中的一条称为正链，该正链的互补链称为负链，将正链分段成多个首尾相接的短序列，这些短序列的长度在15碱基到60碱基之间；

②在每个短序列的5’端首先加一个限制性内切酶识别位点，然后再加一段序列，这段序列与相应原短序列中的一段序列互补，从而使得整段序列能够形成一个发夹结构；

③在每个短序列的3’端添加一段序列为交叠片断，每个交叠片断与其左边相邻的短序列的5’端序列相同；

④设计一条位于目标DNA正链上的寡核苷酸链，使得其3’端与最左端负链寡核苷酸链的交叠片断互补，作为延伸的起始点。

(2)、在多种酶的协同作用下进行等温生长，合成目标DNA长链，具体是指：

①将负链寡核苷酸链和正链寡核苷酸链混合在反应体系中，并加入具有聚合酶、外切酶和限制性内切酶三种活性的混合酶；

②延伸反应的pH值为7-9.5；延伸反应的温度为20-40℃；

(3)、以步骤(2)中所得的产物为模板进行PCR扩增，获取目标序列长度的PCR产物。

2、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的分段所得的短序列其长度20碱基到40碱基。

3、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的左边相邻的短序列是指紧接相应短序列3’端的那条短序列。

4、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的最左端负链寡核苷酸链是指所有负链寡核苷酸链中最靠近目标DNA负链3’端的负链寡核苷酸链。

5、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的纯化是指中性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

6、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的聚合酶为DNA聚合酶，或者为RNA聚合酶，或者为无3’—5’外切酶活性的聚合酶。

7、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的外切酶是指具有双链特异性的5’-3’外切酶。

8、根据权利要求1所述的等温单向生长的基因合成方法，其特征是，所述的延伸，在3个步骤的循环间进行：

(1)聚合酶延伸使得发夹结构打开，限制性内切酶位点成为双链；

(2)限制性内切酶对已经成为双链的位点进行切割；

(3)外切酶对切割后的负链进行消化，外切酶消化后，产生一段3’悬挂的单链区，这一段单链区包含一段交叠片断，因而可与下一个负链寡核苷酸链杂交，进行下一轮的聚合酶延伸。

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