具体实施方案
以往的植化研究发现蒲公英植物中含有三萜类、香豆素类、酚酸类(包括含酚羟基的黄酮类)、倍半萜类、植物甾醇类、胡萝卜素类和长链脂肪酸类化合物。本发明人对该植物提取物的大吸性部位,通过多种正、反相层析手段得到该有效抑制金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌活性的两个活性化合物,并经红外、质谱、紫外和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构为前人未报道过的两个黄酮苷化合物。
本发明中的药材可以是任意一种中国产的蒲公英属植物任一部位,即可以是蒲公英(又称蒙古蒲公英)(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz)、碱地蒲公英(又称华蒲公英)(Taraxacum sinicum Kitag)、热河蒲公英(又称白缘蒲公英)(Taraxacum platypecidumDiels)、东北蒲公英(Taraxacum ohwianumKitag)、、反苞蒲公英(Taraxacum grypodon Dahlst)、兴安蒲公英(Taraxacum falcilobumKitag)等中国药品市场上常见的蒲公英药材,可以是干品或鲜品,可以是蒲公英药材植物的根、茎、叶、花、种子、皮、果实,也可以是它们的混合物,本发明之说明书中均简称蒲公英。优选全草。更优选蒲公英(又称蒙古蒲公英)(Taraxacummongolicum Hand-Mazz)和/或碱地蒲公英(又称华蒲公英)(Taraxacum sinicumKitag)的全草部分。
本发明得到的两个新颖黄酮苷类成分具有抑制金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌生找的功能;可以用于预防和治疗由金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌引起的疖子、脓疱、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、心内膜炎、脑膜炎、乳腺炎、膀胱炎、盆腔炎、泌尿道炎症、前列腺炎、菌血症、中毒性休克综合症、淋巴结炎、关节炎、咽炎、子宫颈炎,以及肌肉、皮肤、尿殖道、中枢神经系统的脓肿及与上述症状或疾病有关的医药或保健品用途;从而可能开发出抗感染类药物组合物。这种药物组合物可以用制药领域中的常规技术制成各种剂型,如片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等。
下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行和简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1 蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B的分离:
1.1 仪器与试剂
熔点用显微熔点仪(北京泰克公司生产)测定,温度未校正;旋光在日本产Polax-2L型自动旋光义上测定;红外光谱(IR)由Bruker Vector-22红外光谱仪测定,经KBr压片;紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定;核磁共振氢谱(1H-NMR),核磁共振碳谱(13C-NMR)和二维核磁共振波谱(2D NMR)由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN INOVA-400 MHz)测定(四甲基硅醚TMS为内标);电喷雾质谱(ESI-MS)由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定,柱层析用硅胶(100-200目,200-300目和300-400目)薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均由青岛海洋化工厂生产;所用试剂均为分析纯,其中石油醚沸程为60-90℃;薄层制备层析(PTLC)用Merck公司的颧箔硅胶板;柱色谱用酰胺(14-30目和100-200目)采用浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂产品;葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)采用瑞典AmershamPharmacia Biotech AB公司产品;反相硅胶RP-18采用日本Fuji Silysia Chemical公司的Chromatorex产品:MCI为日本三菱化工公司产品,薄板(TLC)紫外检测用波长为254nm和365nm的紫外灯;显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇、2%三氯化铁-甲醇、磷钼酸以及溴甲酚绿溶液。
液相:Waters系列高效液相色谱仪,包括2695分离系统(四元泵、柱温箱及自动进样器),2996紫外二极管矩阵检测器,Empower色谱操作软件。色谱柱:Waters
RP18(3.9×150mm,5μm)。
1.2 植物来源与鉴定
供提取用蒲公英药材于2001年8月购于安徽毫州,由浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定为蒙古蒲公英(Taraxacum mongloicum Han.-Mazz.)的全草。供比较含量用蒲公英(蒙古蒲公英)(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz)、碱地蒲公英(华蒲公英)(Taraxacum sinicumKitag)、热河蒲公英(白缘蒲公英)(TaraxacumplatypecidumDiels)、东北蒲公英(Taraxacum ohwianumKitag)、反包蒲公英(Taraxacum grypodon Dahlst)、兴安蒲公英(Taraxacum falcilobum Kitag)干品各20克由中科院昆明植物所彭华教授于2003年8月~2004年7月协助采集并鉴定。供干鲜品含量比较之蒲公英(蒙古蒲公英)(Taraxacum mongolicumHand.-Mazz)和碱地蒲公英(华蒲公英) (Taraxacum sinicum Kitag)鲜品各100克采集自浙江省天目山,由浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定。
1.3 提取与分离
样品晒干粉碎(干重5.0公斤)后用75%工业酒精沸水下热提两次,提取液冷却后合并,经减压浓缩得462克棕褐色粘稠状粗提物。将相提物用甲醇溶解,D-101大孔树脂拌样,在旋转蒸发仪上减压除去甲醇,以变色硅胶为干燥剂,40℃真空干燥过夜,加样到水平衡好的D-101柱中,收集50%甲醇-水洗脱部位,将洗脱液浓缩至干,再用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。各有机层减压蒸干后分别得3克,32克,127克浸膏,余为水部位。
1.4 水部位的分离纯化
取水部位浸膏50克用反相硅胶(RP-18)柱(100克),以水-甲醇(1:0→0:1)为洗脱剂梯度洗脱,其中10%甲醇洗脱部位(1.4克)用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(100毫升)柱层析,以水-甲醇(1:0→0:1)洗脱,经重结晶得到蒙古蒲公英苷A(11.0毫克),50%甲醇洗脱部位(500毫克)再过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱,用甲醇洗脱,经薄层层析检查,含有相同组分者合并,并经水一醇重结晶得到蒙古蒲公英苷B(16.1毫克)。
1.5 结构鉴定
蒙古蒲公英苷A的结构鉴定:蒙古蒲公英苷A为黄色粉末状固体,微溶于甲醇,易溶于水。254nm下有紫外吸收,与10%硫酸-乙醇溶液反应显黄色,盐酸-镁粉反应阳性,莫利氏(Molish)反应阳性;紫外UV光谱:λmax 259,357nm。以上特征可初步判断此化合物可能为黄酮苷类化合物。蒙古蒲公英苷A之1H-NMR和13C-NMR低场区信号与化合物Isoetine非常相似[B Voirin等,Isoetine,a new flavoneisolated from Isoetes delilei and Isoetes durieui,Phytochemistry,1975,14,257-259;K Gluchoff-Fiasson等,Glycosides and acylated glycosides ofisoetin from European species of Hypochoeris,Phytochemistry,1991,30,1673-1675],高场区为典型的糖信号峰,根据以上信息可判断蒙古蒲公英苷A为化合物Isoetine的糖苷类衍生物。氢谱中δ 5.08(1H,双峰,J=8.0Hz)及δ 4.87(1H,双峰,J=6.0Hz)的两个氢为典型的黄酮苷糖端基质子,在高场区δ 3.2-3.6范围内共有11个质子,且从13C-NMR谱的高场部分来看,有9个碳集中在δ 60-78的范围内,因此可判断此黄酮苷为双糖氧苷。13C-NMR谱低场区δ 163.1(s),161.8(s),161.4(s),157.3(s),150.4(s),150.4(s),140.6(s)为蒙古蒲公英苷A中7个连氧芳香季碳。其中δ 182.4(s)为5位羰基信号,以上信号与黄酮苷的碳谱特征相吻合。低场区δ 7.31(1H,s)以及6.77(1H,s)的一组单峰信号峰显示化合物B环上有1,2,4,5-四取代。δ 6.44(1H,s)以及δ 6.72(1H,s)表明A环上有两个处于间位的质子,δ 7.16(1H,s)为C环上3位质子信号。以上谱图特征表明蒙古蒲公英苷A的黄酮苷元部分为化合物Isoetine。将13C-NMR谱中糖碳的δ值与糖的标准谱图以及文献对照,发现这两个糖的碳信号分别与葡萄糖和阿拉伯糖的碳信号一致[K R Markham等,Luteolin 7-0-[6-0-α-L-arabiofuranosyl]β-D-glucopyranoside and other new flavonoid glycosidesfrom New Zealand Dacrydium species,Journal of Natural Products,1987,50,660-663]。且在薄层酸水解实验中,通过与标准吕对照,证实蒙古蒲公英苷A的苷元为化合物Isoetine,两个单糖分别为葡萄糖和阿拉伯糖。13C-NMR谱中,δ 163.1,150.4分别为苷元7和2’位碳的信号,此信号公别向高场位移,以上信息初步判断苷元7位和2’位与糖结合成苷[J B Harborne,Revised structures for threeisoetin glycosides,yellow flower pigments in Heywoodiella oligocephala.Phytochemistry,1991,30,1677-1688]。
蒙古蒲公英苷A甲醇溶液的UV谱中,带I最大吸收波长λmax为357nm;加入诊断试剂三氯化铝(AlCl3)溶液后,带I红移至最大吸收波长λmax 425nm;而当再加入少量的盐酸后,带I紫移到最大吸收波长λmax 394nm,因此可以确定蒙古蒲公英苷A的A环中存在5-OH且B环中具有邻位的酚羟基,即7位和2’位羟基糖基化。
初步确定了蒙古蒲公英苷A的结构类型后,进一步通过二维核磁共振波谱技术2D-NMR来确定各取代基的连接位置。在1H-1H COSY试验结果中,δ 6.72(s)与δ6.44(s)有相关效应,进一步证明蒙古蒲公英苷A的A环为5,7-二取代;而δ 5.08(1H,双峰,J=8.0Hz)及δ 4.87(1H,双峰,J=6.0Hz)与糖质子有相关进一步证明了这两个信号为糖上端基质子信号。
利用HMBC和HSQC技术,首先从δ 7.31(1H,s)与δ 6.77(1H,s)的两个质子信号出发,对黄酮母核上的质子和碳进行了准确归属。然后根据HMBC谱中δ5.08(1H,双峰,J=8.0Hz,H-1″)的质子与δ 163.1(s,C-7),77.3(d,C-5″)和76.6(d,C-3″)有相关效应,δ 4.87(1H,双峰,J=6.0Hz)的质子与δ 150.4(s,C-2’),70.7(d,C-3″’)和65.4(t,C-5″’)有相关效应,确定两个糖分子以氧苷键的方式分别连接在isoetine的C-7及C-2’上,且C-7位连的糖基为葡萄糖而C-2’位为阿拉伯糖。综上所述和根据生物合成考虑,蒙古蒲公英苷A的结构被鉴定为Isoetine-7-O-β-glucopyranosyl-2’-O-α-abinopyranoside 即Isoetine-7-氧-β-吡喃型葡萄糖基-2’-氧-α-吡喃型阿拉伯糖苷。
(箭头所示为蒙古蒲公英苷A的HMBC谱图)
蒙古蒲公英苷A:黄色无定型粉末;C26H28O16;熔点:232-233℃;紫外吸收UVλmax nm∶258,357(甲醇);272,326,425(三氯化铝);268,318,394(三氯化铝+盐酸);电喷雾质谱ESI-MS m/z:597[M+H]+;氢谱1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 13.11(1H,宽单峰,5-OH),7.31(1H,单峰,H-6’),7.16(1H,单峰,H-3),6.77(1H,单峰,H-3’),6.72(1H,单峰,H-8),6.44(1H,单峰,H-6),5.08(1H,双峰,J=8.0Hz,H-1”),4.87(1H,双峰,J=6.0Hz,H-1”’),3.20-3.60(6H,多重峰,H-2”~H-6”),3.20-3.60(5H,多重峰,H-2”’~H-5”’);碳谱13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ 182.4(s,C-4),163.1(s,C-7),161.8(s,C-2),161.4(s,C-5),157.9(s,C-9),150.4(s,C-4’),150.4(s,C-2’),140.6(s,C5’),114.8(d,C-6’),110.6(s,C-1’),108.9(d,C-3),105.4(d,C-10),104.4(s,C-3’),101.8(d,C-1”’),100.0(d,C-1”),99.5(d,C-6),94.7(d,C-8),77.3(d,C-5”),76.6(d,C-3”),73.3(d,C-2”),72.5(d,C-2”’),70.7(d,C-3”’),69.7(d,C-4”),67.3(d,C-4”’),65.4(t,C-5”’),60.8(t,C-6”)。
蒙古蒲公英苷B的结构鉴定:蒙古蒲公英苷B为浅黄色粉末状固体,与10%硫酸-乙醇溶液反应显黄色,盐酸-镁粉反应阳性,喷三氯化铝乙醇液显黄色荧光,莫利氏(Molish)反应呈阳性,紫外光谱UV:最大吸收波长λmax 259,357nm。以上信息均提示蒙古蒲公英苷B也为黄酮苷类化合物。核磁共振氢谱1H-NMR谱中,δ6.73(1G,单峰,H-6)和δ 6.45(1H,单峰,H-8)的信号峰说明A环为5,7-二取代;δ 7.11(1H,单峰,H-3)说明此化合物为黄酮苷类而非酮醇苷类化合物;δ 7.31(1H,单峰,H-6’)和δ 6.80(1H,单峰,H-3’)的信号峰示B环为1,2,4,5-四取代。以上信息与化合物Isoetine的非常相似,同时与蒙古蒲公英苷A的黄酮苷元部分相似。此外,核磁共振氢谱1H-NMR谱中δ 5.08(1H,双峰,J=8.0Hz,H-1″)和δ 4.91(1H,宽单峰,H-1″’)的信号峰说明该化合物中存在两个糖基,薄层层析TLC酸水解只检出葡萄糖,可说明化合物中两个糖基均为葡萄糖。因些可推出化合物蒙古蒲公英苷B为isoetine的二氧葡萄糖苷。通过端基氢的偶合常数以及与文献对比[V U Ahmad等Santoflavone,a 5-deoxylflavonoid from Achillea santalinaPhytochemistry,1995,38,1305-1309],确定二个葡萄糖中一个为β-葡萄糖,另一个为α-葡萄糖。
比较化合物蒙古蒲公英苷B和化合物蒙古蒲公英苷A的核磁共振碳谱13C-NMR谱数据(表1)可以发现:两化合物低场区的黄酮苷元信号峰基本重合,只有糖部位稍有区别。与此相似的是δ 163.0,150.4分别为苷元7和2’位碳的信号,此信号也分别向高场位移,且通过加入诊断试剂也确证蒙古蒙古蒲公英苷B的B环上具有邻二酚羟基的结构单元,因些提示化合物蒙古蒲公英苷B亦是7位和2’位与糖结合成苷。比较化合物蒙古蒲公英苷B和化合物蒲公英苷A的高场部分,化合物蒙古蒲公英苷A的糖信号区为一葡萄糖和一阿拉伯糖,而化合物蒙古蒲公英苷B为两分子的葡萄糖,剔除7位β-葡萄糖基的信号峰剩下的即为2’位α-葡萄糖基的信号峰。因此,确定化合物蒙古蒲公英苷B的结构为Isoetine-7-O-β-glucopyranosyl-4’-O-α-glucopyranoside。
蒙古蒲公英苷B:黄色无定型粉末;C27H30O17;熔点:223-224℃;紫外吸收UVλmax nm:257,356(甲醇);270,326,426(三氯化铝);267,319,393(三氯化铝+盐酸);电喷雾质谱ESI-MSm/z:627[M+H]+;氢谱1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 13.07(1H,单峰,5-OH),7.31(1H,单峰,H-6’),7.11(1H,单峰,H-3),6.80(1H,单峰,H-3’),6.73(1H,单峰,H-8),6.45(1H,单峰,H-6),5.08(1H,双峰,J=8.0Hz,H-1”),4.91(1H,宽单峰,H-1”’),3.20-3.6(6H,多重峰H-2”~H-6”),3.20-3.60(6H,多重峰,H-2”’~H-6”’);碳谱13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ 182.2(s,C-4),163.0(s,C-7),161.8(s,C-2),161.3(s,C-5),157.2(s,C-9),150.4(s,C-4’),150.4(s,C-2’),140.5(s,C-5’),114.7(d,C-6’),110.4(s,C1’),108.9(d,C-3),105.4(d,C-10),104.7(s,C-3’),101.3(d,C-1”’),100.1(d,C-1”),99.5(d,C-6),94.7(d,C-8),77.3(d,C-5”),77.3(d,C-5”’),76.9(d,C-3”’),76.5(d,C-3”),73.5(d,C-2”’),73.3(d,C-2”),69.7(d,C-4”’),69.7(d,C-4”),60.8(t,C-6”’),60.8(t,C-6”).
表1 蒙古蒲公英A(化合物1)和蒙古蒲公英苷B(化合物2)的1H-NMR和13C-NMR数据比较a
a氢谱1H NMR(400MHz),碳谱13C NMR and DEPT(100MHz)在DMSO-D6中测定.耦合常数用赫兹表示。
实施例2:黄酮苷类化合物1和2抑制格兰氏阳性菌能力检测
2.1 原理:
采用“管碟法”研究试验药物的体外抗菌活性,是利用加在牛津杯中的试验药物扩散到接种的试验菌的培养基中,从而抑制细菌的生长,通过检测在牛津杯周围形成的抑菌圈的直径大小来确定试验药物的抗菌活性。
2.2 检测菌:
金黄色葡萄球菌26003-23,购自中国药品生物制品检定所。
乙型溶血性链球菌32210,购自中国药品生物制品检定所。
2.3 试验药物:
DMSO:DMSO溶剂对照;
诺氟沙星:1.25mg/ml;
蒙古蒲公英苷A(化合物1):5.0mg/ml;蒙古蒲公英苷B(化合物2):5.0mg/ml;
样品均用DMSO溶解。
2.4 方法与步骤:
2.4.1、M-H琼脂、M-H肉汤及试验菌液的制备。
2.4.2、双碟的制备:
(1)、M-H琼脂底层:取灭菌M-H琼脂液体自然冷却凝固。
(2)、M-H琼脂菌层:取菌液150μl与30mlM-H琼脂混匀。取约5ml含菌液琼脂,均匀摊布在具有M-H琼脂底层的平皿内。
2.4.3、待培养基凝固后,在每个平皿中均匀放立加满试验药液牛津杯。
2.4.4、置37℃培养24小时。
2.4.5、用游标卡尺测量抑菌圈直径。
表2 蒙古蒲公英苷A(化合物1)和蒙古蒲英苷B(化合物2)对标准致病菌的抑菌圈直径(mm)
2.5 实验结论:
通过采用“微量稀释法”研究化合物1和2对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的体外抗菌活性。结果表明:化合物1和2对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌有较好的抗菌活性。说明其为潜在的抑制格兰氏阳性菌活性物质,具有进一步开发价值。
本发明所述的新颖黄酮苷(蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B)可以与药学上常用的辐料或载体结合,制备得到具有预防和治疗由金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌引起的感染之药物及药物组合物或保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽体、软膏剂等剂型药物。
本发明的新颖黄酮苷蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B还可以与现已上市的金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌抑制剂和/或其他治疗类似格兰氏阳性菌感染相关病症的治疗药物及其原料药如头孢类、大环内酯类、以及磺胺类如沙星等药物品种联合使用,制备得到具有治疗格兰氏阳性菌感染相关病症功效的组合物或复方制剂,可预期成为治疗格兰氏阳性菌感染疾病药品或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型药物,包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。
实施例3:五种蒲公英属植物根茎与地上部分茎叶中化合物1和2的比较
蒲公英(蒙古蒲公英)(Taraxacum mongolicumHand-Mazz)、碱地蒲公英(华蒲公英)(Taraxacum sinicum Kitag)、热河蒲公英(白缘蒲公英)(Taraxacumplatypecidum Diels)、东北蒲公英(Taraxacum ohwianumKitag)、反苞蒲公英(Taraxacum grypodon Dahlst)、兴安蒲公英(Taraxacum falcilobum Kitag)干品各20克由中科院昆明植物所彭华教授采集并鉴定。
用沃特斯高效液相色谱(Waters HPLC,2695分离系统包括四元泵、柱温箱自动进样器;2996紫外二极管矩阵检测器,Empower色谱操作软件和Waters
RP-184.6mm×25mm,5μm层析柱)对公合物1和2进行了含量检测。
供试样品处理:阴干粉碎后的样品各称取0.5克(±0.1毫克),置25毫升容量瓶,加20毫升甲醇,25~30℃下超声60分钟,加甲醇至刻度,用0.45μm滤膜滤过。
标准溶液的制备:准确称取化合物1和2各10.0毫克,分别加入8毫升甲醇超声溶解,再各自加入甲醇配成0.5毫克/毫升的标准储备液。用甲醇按照1:1,1:10,1:50,1:100配制成标准溶液,冷藏备用。同法各自制备出化合物1和2的标准溶液。试剂:甲醇为HPLC级(Merk生产),水为二次蒸馏水。色谱条件:使用RP-C18色谱柱(4.6mm×250mm),5μm,柱温30℃,检测波长:254nm,流速:0.8毫升/分钟,进样量:20μl。流动相组成如下表所示:
表3 测定蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B的高效液相色谱条件
时间(分钟) | 甲醇(%) | 0.1%醋酸(%) |
0 | 22 | 78 |
30 | 22 | 78 |
31 | 35 | 65 |
55 | 35 | 65 |
56 | 40 | 60 |
80 | 40 | 60 |
含量测试:将提取溶媒、标准品溶液、供试样品分别进样,记录色谱图。以峰面积对应标准溶液浓度绘制曲线,计算线性范围,相关系数≥0.998。从标准曲线分别计算出化合物1和2的含量。
发现含量如下表所示:
表4 常见蒲公英中蒙古蒲公英苷A(化合物1)和蒙古蒲公英苷B(化合物2)的含量
| 化合物1含量(%) | 化合物2含量(%) |
蒙古蒲公英(蒲公英)根茎部分 | 0.56 | 0.58 |
蒙古蒲公英(蒲公英)地上部分茎叶 | 0.53 | 0.59 |
碱地蒲公英(华蒲公英)全草 | 0.43 | 0.35 |
热河蒲公英(白缘蒲公英)全草 | 0.73 | 0.55 |
东北蒲公英全草 | 0.61 | 0.67 |
反苞蒲公英全草 | 0.29 | 0.86 |
兴安蒲公英全草 | 0.62 | 0.93 |
结果表明:蒙古蒲公英根茎和地上部分都含有本发明所述的化合物,并且碱地蒲公英、热河蒲公英、东北蒲公英、反苞蒲公英、兴安蒲公英中都含有不同含量的化合物1和2,说明蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B是菊科蒲公英属植物中的特征性成分,所以运用本属植物包括并不限于蒙古蒲公英、碱地蒲公英、热河蒲公英、东北蒲公英、反苞蒲公英、兴安蒲公英等都可以制备本发明所要求的含有蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B的抗格兰氏阳性菌药物。
实施例4:两种蒲公英属植物茎叶(鲜品和干品中)化合物1和2的比较
蒲公英(蒙古蒲公英)(Taraxacum mongolicumHand-Mazz)、碱地蒲公英(华蒲公英)(Taraxacum sinicum Kitag)鲜品各100克由浙江大学陈柳蓉教授鉴定。
用沃特斯高效液相色谱(Waters HPLC,2695分离系统包括四元泵、柱温箱自动进样器;2996紫外二吸管矩阵检测器,Empower色谱操作链软件和Waters
RP-184.6mm×250mm,5μm层析柱)对化合物1和2进行了含量检测。
含量测试:将提取溶媒、标准品溶液、供试样品分别进样,记录色谱图。以峰面积对应标准溶液浓度绘制曲线,计算线性范围,相关系数≥0.998。从标准曲线分别计算出化合物1和2的含量。具体操作同实施例3。
表5 两种蒲公英干品与与鲜品中蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B含量对比
| 化合物1含量(%) | 化合物2含量(%) |
蒙古蒲公英(蒲公英)鲜品 | 0.57 | 0.61 |
蒙古蒲公英(蒲公英)干品 | 0.53 | 0.59 |
碱地蒲公英(华蒲公英)鲜品 | 0.47 | 0.43 |
碱地蒲公英(华蒲公英)干品 | 0.49 | 0.41 |
结果表明:蒙古蒲公英和碱地蒲公英的干品和鲜品中都含有不同含量的化合物1和2,含量并无太大的差异。说明蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B在菊科蒲公英属植物中存在和含量较为稳定,所以运用本属植物的干品和鲜品都可以制备本发明所要求的含有蒙古蒲公英苷A和蒙古蒲公英苷B的抗格兰氏阳性菌药物。