CN100457917C - 制备作为动物饲料添加剂的d-泛酸和/或其盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。
Description
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的改进方法以及所述物质作为动物饲料添加剂的用途。
作为生物合成辅酶A的原料,D-泛酸盐广泛分布于植物界和动物界中。与通过膳食消耗足量泛酸的人类不同,D-泛酸盐缺乏症状常常不仅见于植物,而且也见于动物。因此,D-泛酸盐的可利用性具有重大经济价值,特别是在动物饲料工业中。
传统上,D-泛酸盐通过化学合成由D-泛内酯和β-丙氨酸钙来制备(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(Ullmann工业化学大全),第六版,1999,电子版,“维生素”一章)。D-泛内酯的制备需要经由非对映盐的复杂且经典的外消旋体拆分。由该化学合成得到的工业产物通常是D-泛酸的钙盐,即D-泛酸钙。
与化学合成相比,使用微生物的生物技术生产方法的优点在于选择性(对映体纯)生产可用于高级生物的D型泛酸。因此,如化学合成中所需的复杂的外消旋体拆分就不必要了。
已知有大量使用微生物来制备D-泛酸的发酵方法,包括EP-0 590 857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1 001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193中所述的方法。
因此,EP 1 006 189和EP 1 001 027描述了制备泛酸盐的方法,其中在发酵溶液中得到的最大D-泛酸含量为1g/l。然而,对于经济地制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂,发酵溶液中这样低的泛酸含量(即以固含量计不到10重量%)是不适用的。迄今所述方法的另一缺点在于产物从发酵培养基中的分离需要许多复杂的后处理步骤。尚不知在工业规模上经济的制备方法。
德国公开申请DE 100 16 321描述了一种制备含有D-泛酸的动物饲料添加剂的发酵方法。然而,与上述制备D-泛酸的发酵方法一样,该方法的一个重大缺点在于必须将该泛酸的前体-β-丙氨酸经由发酵培养基供入微生物中以得到所需产物的经济产率。
另外,US 6,013,492和WO 96/332839描述了通过从培养基中滤除不溶性成分(例如细胞物质),将滤液吸附到活性炭上,随后用有机溶剂、优选甲醇洗脱D-泛酸,用氢氧化钙中和以及随后将D-泛酸钙结晶而从发酵溶液中对D-泛酸进行后处理。其重大缺点在于结晶过程中损失有价值的产物以及使用从产物中难以除去且需要复杂的溶剂回收步骤的有机溶剂。
EP 0 590 857描述了一种制备D-泛酸的发酵方法,其中培养微生物需要供入β-丙氨酸。将该发酵溶液过滤以分离除去生物质,然后使其通过阳离子交换剂并然后通过阴离子交换剂,之后用氢氧化钙中和,蒸发浓缩,加入活性炭,再次过滤以及加入甲醇和氯化钙以结晶。所得含有泛酸钙的产物除了含有钙盐形式的D-泛酸外,还含有摩尔比为1∶1的氯化钙。降低氯化钙含量需要电渗析和随后的喷雾干燥。该方法的缺点在于:由于大量复杂的工艺步骤和有机溶剂的使用使得既不经济又不生态。
本发明的目的是提供一种含有D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂以及通过没有上述缺点的制备D-泛酸和/或其盐的改进方法来制备它的方法。出于经济上的原因,此处理想的方法是,其中β-丙氨酸的供入大大降低或根本不需要。另外,制备其二价盐形式且尤其是碱土金属盐形式的D-泛酸是所需的,因为该泛酸的二价盐与其一价盐相比具有更低的吸湿性,因而对于进一步应用例如用作动物饲料添加剂具有不太显著的团聚趋势。
我们发现该目的通过本发明有利地实现。
本发明涉及一种制备D-泛酸和/或其盐的方法,其包括如下步骤:
a)使用至少一种生物,该生物产生D-泛酸,在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成,并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐,其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐,
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阴离子交换剂,
c)使用含有无机或有机钙盐和/或镁盐的溶液将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根以D-泛酸钙和/或D-泛酸镁形式洗脱,或者使用HCl溶液将结合的D-泛酸根以游离D-泛酸形式洗脱,
d)任选加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的溶液的pH设定为3-10,得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液,以及
e)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的洗脱液或溶液进行干燥和/或配制。
在本发明方法的变体中,本发明方法的特征在于:在步骤d)或步骤e)中,得到或加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
步骤a)中的发酵使用本身已知的程序以分批、补料分批或反复的补料分批方式或连续方式进行。在这种情况下使用常规缓冲体系如含有NaOH、KOH或氨的磷酸盐缓冲液将所得泛酸中和。
在本发明方法的另一变体中,在步骤a)中,通过发酵在培养基中生成至少10g/l、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l D-泛酸盐。
对本发明而言,词语“产生”指所述生物可合成比其自身代谢需要所需量要大的D-泛酸和/或其盐。在本发明的有利变体中,所合成的D-泛酸和/或其盐的量不存在于细胞内部,但理想的是通过生物全部释放到培养基中。该释放通过本身公知的机理可以是主动的或被动的。
根据本发明,所用产生D-泛酸的生物是微生物。这些微生物根据本发明包括真菌、酵母和/或细菌。根据本发明,优选使用真菌如毛霉菌属(Mucor)或酵母如酵母属(Saccharomyces)或德巴利酵母属(Debaromyces),在这当中优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根据本发明,有利地使用棒状杆菌(coryneform bacteria)或芽孢杆菌科(Bacillaceae)。在本发明范围内优选的例如是棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Bevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、不动杆菌属(Acinetobacter)或根瘤菌属(Rhizobium)的细菌。此处特别优选的例如是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、短杆菌(Brevibacterium breve)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和一组以其16sRNA表征的其它芽孢杆菌种,或Actinum mycetalis。该列举目的在于解释,决不是对本发明的限制。
此外,本发明还包括使用基因修饰生物以用于本发明制备含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂。这类基因修饰生物例如可通过化学诱变和随后使用合适的“筛选法”筛选来分离。根据本发明,称作“生产菌株”的也包括在内,它们适于制备本发明产物且在D-泛酸方向的代谢通量方面具有基因修饰,其中在D-泛酸和/或其盐经由细胞膜排出方面的修饰也包括在内。这例如可通过对所用生物的相关代谢生物合成途径中的关键位置的修饰来实现。
也可使用由必需的或可能需要的同源和/或异源核苷酸序列转移得到的转基因生物来合成所需产物。在这种情况下,单独和/或组合位于基因组中的和/或位于载体上的一个或多个基因可能超表达和/或去调节。
这类转基因生物可有利地含有额外的拷贝和/或基因修饰的基因,所述基因选自panB、panC、panD、panE和/或其组合和/或甚至是象panBCD操纵子那样的组织单元。另外,如EP 1 006 189、EP 1 006 192、EP 1 006 193或EP 1 001 027所述,可有利地在生物中操作其它代谢途径,例如异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径。结果,泛酸生物合成的支化链前体物质越发可利用。合适的话,将用于该生物合成途径的基因,即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD有利地超表达。
另外,本发明还包括在所用的产生D-泛酸的生物中对天冬氨酸α-脱羧酶(panD)例如通过超表达和/或去调节进行基因修饰。
对本发明而言,词语“去调节”指在生物合成代谢途径中改变或修饰至少一个编码一种酶的基因,使得改变或修饰该酶在该微生物中的活性。优选改变至少一个编码一种生物合成代谢途径的酶的基因,使得该基因产物以更大程度形成,或者具有增加的活性。术语“去调节的代谢途径”也包括其中改变或修饰一个以上编码一种以上酶的基因以改变或修饰该一种以上酶的活性的生物合成代谢途径。
改变或修饰可包括但不限于:除去内源启动子或调节成分;同时引入强启动子、诱导型启动子或多个启动子;除去调节序列以改变该基因产物的表达;改变该基因的染色体位置;改变在该基因附近或该基因内的DNA序列,例如核糖体结合位点(RBS);增加该基因组中该基因的拷贝数或引入数目不等的质粒拷贝;修饰蛋白(例如调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活因子等),它们在基因转录和/或在翻译得到基因产物中起着作用。这也包括所有属于现有技术的其它去调节基因的表达的可能方式,例如使用反义寡核苷酸或阻断阻抑蛋白。
去调节也可包括对例如导致除去基因产物中的反馈调节或导致基因产物的更大或更小比活性的基因的编码区的改变。
此外,对酶的基因修饰根据本发明是有利的,这些修饰影响泛酸前体的流出和/或泛酸流出产生辅酶A。编码这些酶的基因的实例是:alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX等。该列举目的在于解释,决不是对本发明的限制。
另外,基因修饰是有利的,这些修饰保证辅因子(例如亚甲四氢叶酸、氧化还原等同物等)以对于泛酸产生而言最优的量的细胞生产。
因此,β-丙氨酸有利地已经以与相应的非基因修饰生物相比增加的浓度存在于细胞中,因而不必将其作为前体加入培养基中,例如EP-A 0590857中所要求的。其中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或天冬氨酸α-脱羧酶(panD)的生物合成的微生物是有利的。而且,微生物中酮泛解酸还原酶(panE)的额外超表达是有利的。
根据本发明,合适的话,若合成辅酶A所需的coaA基因的活性降低或者该基因被彻底切断(例如在芽孢杆菌属种中),则将额外有利。这是因为芽孢杆菌属除含有coaA外还含有其它提供这种酶催功能的基因(=coaX)。该coaX基因或相应酶的活性也可改变,优选降低,或者甚至消除,条件是coaA本身仍旧具有足够的酶活性,即使是降低的酶活性,也就是说coaA的酶活性没有彻底丧失。除各种基因的超表达之外,这些基因的启动区的基因操作也是有利的,条件是该操作导致该基因产物的超表达。
在本发明实施方案中,使用根据附件(PCT/US 0025993)描述的细菌菌株,例如枯草芽孢杆菌PA 824和/或其衍生物。在另一实施方案中,根据本发明在本发明方法中使用如附件(US 60/262,995)中所述的微生物枯草芽孢杆菌PA 668。这些枯草芽孢杆菌PA 824和PA 668菌株按如下方式生产:
从具有基因型trpC2(Trp-)的枯草芽孢杆菌168菌株(Marburg菌株ATCC 6051)开始,通过Trp+标记(来自枯草芽孢杆菌野生型W23)转导生产PY79菌株。经典的基因工程方法(例如Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编辑)在Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢杆菌属的分子生物学方法)(1990)(John Wiley & Sons,Ltd.,Chichester,英国)中所述)将ΔpanB和ΔpanE1突变引入PY79菌株中。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD,trpC2(Trp-))的基因组DNA和枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的基因组DNA将所得菌株转化。所得菌株PA327具有基因型P26panBCD、P26panE1,且为色氨酸营养缺陷体(Trp-)。使用枯草芽孢杆菌菌株PA327,在10ml含有SVY培养基(将25g/l Difco Veal肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、2.7g/l硫酸铵加入740ml水中,将该混合物高压灭菌,然后加入200ml1M磷酸钾(pH7.0)和60ml 50%无菌的葡萄糖溶液)的培养物中,得到不超过3.0g/l(24h)的泛酸滴定度,其中所述培养基中补加有5g/l β-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD,trpC2(Trp-))的生产描述在下列部分:
借助E.Coli的panBCD操纵子的序列信息(见Merkel等人,FEMSMicrobiol。Lett.,143,1996:247-252),从枯草芽孢杆菌GP275质粒文库开始,使用经典的基因工程方法来克隆芽孢杆菌属的panBCD操纵子。为了进行克隆,使用E.coli菌株BM4062(birts)和该芽孢杆菌属操纵子靠近birA基因的信息。将该panBCD操纵子引入可在E.coli中复制的质粒中。为了改善该panBCD操纵子的表达,使用枯草芽孢杆菌噬菌体SP01(P26)的强组成型启动子,并将panB基因前面的核糖体结合位点(=RBS)用人工RBS替换。在芽孢杆菌属中紧邻天然panB基因上游的DNA片段连接在质粒上的P26panBCD盒前面。将该质粒转化成枯草芽孢杆菌菌株RL-1(通过经典的诱变得到的枯草芽孢杆菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC6051),基因型trpC2(Trp-)),并且通过同源重组,用P26panBCD操纵子代替天然panBCD操纵子。所得菌株称作PA221,并且具有基因型P26panBCD,trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA221,在10ml含有SVY培养基的培养物中,得到不超过0.92g/l(24h)的泛酸滴定度,其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
枯草芽孢杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的生产描述在下列部分:
利用E.Coli panE基因序列,通过类似方法克隆芽孢杆菌属panE序列。发现在枯草芽孢杆菌中存在两种同源E.Coli panE基因,称作panE1和panE2。缺失分析发现panE1基因负责90%的泛酸生产,而缺失panE2基因对泛酸产生并无重大影响。此处与克隆panBCD操纵子相似,用强组成型启动子P26代替该启动子,并用人工结合位点代替panE1基因前面的核糖体结合位点。将P26panE1片段克隆到载体中,该载体的构建使得该P26panE1片段能整合至枯草芽孢杆菌基因组中的原始panE1基因座。转化和同源重组之后所得的菌株称作PA303,并且具有基因型P26panE1。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA303,在10ml含有SVY培养基的培养物中,得到不超过1.66g/l(24h)的泛酸滴定度,其中所述培养基中补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸。
通过用含有P26ilvBNC操纵子和壮观霉素的标记基因的质粒将PA 327转化而进一步构建所述菌株。该P26ilvBNC操纵子整合入amyE基因座中,这通过PCR来显示。将一种转化体称作PA340(基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、specR、trpC2(Trp-))。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA340,在10ml含有仅补加有5g/lβ-丙氨酸的SVY培养基的培养物中,得到不超过3.6g/l(24h)的泛酸滴定度;在10ml含有补加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中,得到不超过4.1g/l(24h)的泛酸滴定度。
另外,将去调节的ilvD盒引入菌株PA340中。为此,将含有ilvD基因的质粒在控制含有人工RBS2的P26启动子的情况下转化入PA340。通过同源重组将P26ilvD基因整合入原始ilvD基因座中。所得菌株PA374具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA374,在10ml含有SVY培养基的培养物中,得到不超过2.99g/l(24h)的泛酸滴定度,其中所述培养基中仅补加有5g/lβ-丙氨酸。
为了在不供入β-丙氨酸的情况下使用菌株PA374来产生泛酸,将编码天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD的附加拷贝引入菌株PA374中。为此,将菌株PA401的染色体DNA转化入PA374。通过在四环素上的选择得到菌株PA377。
所得菌株PA377具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和trpC2(Trp-)。
在不供入前体的情况下,使用枯草芽孢杆菌菌株PA377,在10ml含有SVY培养基的培养物中,得到不超过1.31g/l(24h)的泛酸滴定度。
枯草芽孢杆菌菌株PA401(基因型P26panD)的制备描述在下列部分:
由panBCD操纵子将枯草芽孢杆菌panD基因克隆入带有四环素标记基因的载体。将启动子P26和上述人工RBS克隆在panD基因前面。限制酶切消化产生含有四环素标记基因和panD基因的片段。将该片段重新连接,并转化到上述菌株PA221。将该片段整合入菌株PA211的基因组中。所得菌株PA401具有基因型P26panBCD、P26panD、tetR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA401,在10ml含有已补加有5g/lα-酮异戊酸的SVY培养基的培养物中,得到不超过0.3g/l(24h)的泛酸滴定度。在10ml含有已补加有5g/lD-泛解酸和10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中,得到不超过2.2g/l(24h)的泛酸滴定度。
从菌株PA377开始,用菌株PY79的染色体DNA的转化来产生色氨酸-原养菌株。菌株PA824具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和Trp+。
在不供入前体的情况下,使用枯草芽孢杆菌菌株PA824,在10ml含有SVY培养基的培养物中,得到不超过4.9g/l(48h)的泛酸滴定度(对照PA377:不超过3.6g/l(48h))。
PA668的制备描述在下列部分:
由野生型panBCD操纵子将芽孢杆菌属panB基因克隆并插入除含有氯霉素抗性基因外还含有vpr基因座的枯草芽孢杆菌序列的载体中。
在panD基因5’端之前引入强组成型启动子P26。通过限制酶切消化得到一个含有P26panB基因、氯霉素抗性的标记基因以及枯草芽孢杆菌vpr序列的片段。将分离出来的片段重新连接并用于转化菌株PA824。所得菌株称作PA668。PA668的基因型为:P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmR和Trp+。
分离PA668的两种菌落并分别称作PA668-2A和PA668-24。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-2A,在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中,在48h内得到1.5g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l天冬氨酸的SVY培养基的培养物中,得到不超过5g/l的滴定度。
使用枯草芽孢杆菌菌株PA668-24,在10ml含有没有供入前体的SVY培养基的培养物中,在48h内得到1.8g/l的泛酸滴定度。在10ml含有补加有10g/l L-天冬氨酸的SVY培养基的培养物中,得到不超过4.9g/l的滴定度。
所述菌株的确切构建参见PCT/US 0025993和US 60/262,995的附件。
使用上述菌株PA377,在SVY培养基(25g/l Difco Veal肉浸汁,5g/lDifco酵母提取物,5g/l色氨酸,5g/l谷氨酸钠,2g/l(NH4)2SO4,10g/lKH2PO4,20g/l K2HPO4,0.1g/l CaCl2,1g/l MgSO4,1g/l柠檬酸钠,0.01g/lFeSO4·7H2O和1ml/l组成如下的痕量盐溶液:0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中,在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为18-19(22-25g/l)。
在PA824(PA377的色氨酸-原养衍生物)的葡萄糖限制发酵的情况下,在酵母提取物培养基(10g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸钠、8g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液)中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下,在36h、48h和72h内在发酵液中得到的泛酸浓度分别为20g/l、28g/l和36g/l。
通过培养基的进一步优化,使用菌株PA824,在由10g/l Difco酵母提取物、10g/l NZ胺A(Quest International GmbH,Erftstadt)、10g/l谷氨酸钠、4g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/lMgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量盐溶液组成的培养基中以10升规模在连续供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制发酵中,在36h(48h)内在发酵液中得到的泛酸浓度为37g/l(48g/l)。
通过培养基的进一步优化、通过增加发酵时间、通过工艺和菌株改进以及通过各步骤的组合可以进一步提高发酵液中泛酸的浓度。因此,通过将为上述PA824的衍生物的菌株发酵也可得到上述泛酸浓度。衍生物可通过经典的菌株发育和通过其它基因工程操作来制备。通过培养基、菌株和发酵方法的发展,可将发酵液中泛酸滴定度增加到大于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和>90g/l。
本发明方法的本质优点在于发酵在培养基中进行,该培养基除含有至少一种碳源和氮源之外就不再含有其它作为起始化合物的前体。也就是说,D-泛酸的生物合成与其它前体的供入没有关系。对本发明而言,这些前体是诸如β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-缬氨酸和/或α-酮异戊酸和/或其混合物的物质。
在本发明方法的优选变体中,产生D-泛酸的生物的发酵在培养基中进行,该培养基含有碳源和氮源,但在发酵过程中不向其中加入或供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。也就是说,为了产生至少10g/l培养基、优选至少20g/l、特别优选至少40g/l、非常特别优选至少60g/l、尤其至少70g/l的D-泛酸,根据本发明不需要供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
与前体的供入无关这一点尤其是本发明方法与已知方法相比的重大经济优点,因为许多前体是非常昂贵的。
然而,本发明不排除加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐,因此使得通过加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐可进一步提高D-泛酸的产率。若例如假定泛酸所有的所需前体都以足量存在,则只有panD基因的活性限制泛酸产生的进一步增加,因此例如可通过加入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐将泛酸的产率再提高50%。
在本发明的有利变体中,可向培养基中加入不超过20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐,以将泛酸的产率额外提高50%以上。优选向培养基中加入约15g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
根据本发明,适合用于培养基中以将上述生物发酵的碳源的实例是糖类如淀粉水解产物(单-、二-、低聚糖),优选葡萄糖或蔗糖,以及甜菜或甘蔗糖蜜,蛋白质,蛋白质水解产物,大豆粉,玉米浆,脂肪,游离脂肪酸,从前面的发酵再循环的细胞或其水解产物,以及酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外,本发明方法有利的特征在于到发酵结束时总的糖含量降至最低,因为否则的话这将由于粘连使随后发酵溶液的干燥和/或配制变得困难。根据本发明,这可通过在碳源被消耗后(在分批培养的情况下)或在碳进料被中断(在以补料分批或反复的补料分批方式的工艺工序的情况下)和/或被调节以使该碳源的浓度基本为零(在补料分批、反复的补料分批或连续工艺工序的情况下)之后继续发酵一段时间而实现。
根据本发明,这通过在中断加入碳源(例如糖溶液)之后,继续发酵直到在该发酵溶液中溶解氧浓度(pO2)为其饱和值的至少80%,优选90%,特别优选95%而到达。
根据本发明,合适的氮源的实例是氨、硫酸铵、尿素、蛋白质、蛋白质水解产物或酵母提取物。该列举不是对本发明的限制。
另外,发酵培养基含有无机盐和/或微量元素,例如氨基酸和维生素。合适的发酵培养基的确切组成大量公知,并且对本领域熟练技术人员而言是可得的。
在用适合的产生D-泛酸的生物对发酵培养基进行接种(以本领域熟练技术人员公知的细胞密度)之后,合适的话加入消泡剂,培育该生物。培养基pH的任何必要调节都可使用各种无机或有机碱或酸如NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质来实现。
考虑到发酵过程中所用的缓冲体系(该缓冲体系如上所述例如可以是NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、盐酸、甲酸、琥珀酸、柠檬酸或类似物质),所生成的D-泛酸取决于所用的缓冲体系而以各自的盐的形式存在于发酵溶液中。由于这种情况下,尤其是D-泛酸的一价阳离子形式的盐是不利的,因此,根据本发明,使用阴离子交换剂来制备发酵溶液。
本发明此处包括所有市购阴离子交换剂。这些交换剂包括所有强或弱碱性树脂;优选强碱性树脂。根据本发明,有利地使用下列阴离子交换剂,该列举目的仅在于说明本发明,而不是对本发明的限制:Bayer的LewatitM500、MP 500;Rohm & Haas的Amberlite IRA 402、IRA 410、IRA 900;Dow Chemicals的Dowex 1×2、1×8;Mitsubishi Chemicals Corporation的Diaion PA306、PA 316、PA 406、PA 412或PA418;以及Bayer的LewatitMP 62;Dow Chemicals的MWA-1;Rohm & Haas的Amberlite IRA 67、IRA 96SB、IRA 96RF、Duolite A561或A7;Reilly Industries的Reillex 402;Mitsubishi Chemicals Corporation的Diaion WA 21或WA 30。
使用阴离子交换剂,发酵溶液中的D-泛酸根和其它阴离子结合于该阴离子交换剂上,而剩余化合物,尤其是一价阳离子如铵离子、钾离子或钠离子通过该阴离子交换剂,并随后排放掉。这样,不需要的阳离子有利地基本完全从发酵溶液中除去。
然后,通过含有无机或有机钙盐和/或镁盐的溶液将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根以D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的形式洗脱,或者通过HCl溶液以游离D-泛酸形式洗脱。根据本发明,这些盐可以是酸性和/或碱性无机和/或有机钙盐和/或镁盐。例如,在本发明方法的变体中,可通过含有酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐的溶液将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根洗脱。同样,其中步骤c)中的洗脱溶液含有无机和/或有机钙碱和/或镁碱的变体也是可行的。碱性钙盐和/或镁盐可以单独存在,或与酸性钙盐/或镁盐共存。在本发明的另一变体中,本发明方法步骤c)中的洗脱溶液可以含有无机钙盐和/或镁盐、酸性有机钙盐和/或镁盐、无机钙碱和/或镁碱和/或有机钙碱和/或镁碱及其相应混合物。
对本发明而言,有利的是无机钙盐和/或镁盐是相应卤化物。根据本发明,优选这些盐是CaCl2和/或MgCl2。无机钙碱和/或镁碱的实例是氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁或碳酸镁。对本发明而言,该有机钙盐和/或镁盐例如是高度水可溶的有机阴离子的盐。优选这些盐例如是甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁和/或乳酸钙和/或镁。
在本发明的变体中,将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根用5-10%浓度的CaCl2溶液、MgCl2溶液或HCl水溶液洗脱,其中洗脱液含有D-泛酸钙或镁形式的D-泛酸盐,或者为游离D-泛酸。
若洗脱用HCl水溶液进行,则通过加入钙碱和/或镁碱将含有游离D-泛酸的洗脱液的pH调节至3-10。pH为5-10是有利的。优选将该溶液的pH调节为5-9,特别优选6-9,非常特别优选6-8。这样得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液。
根据本发明,在添加钙碱和/镁碱将含有游离D-泛酸的洗脱液的pH调节以后,也可得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
为了中和,优选将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入含有游离D-泛酸的洗脱液中。
根据本发明,在这种情况下优选用钙碱和/或镁碱的水悬浮液中和含有游离D-泛酸的洗脱液。与使用相应固体的情形相比,作为使用水悬液的结果,该中和进行得更迅速,并且没有较大的pH波动。
根据本发明,本发明方法的特点在于将包含2-55重量%、优选10-50重量%、特别优选20-40重量%的氢氧化钙的水悬浮液任选加入步骤d)的洗脱液中。
本发明另外还包括一种其中将包含2-65重量%、优选10-50重量%、特别优选20-40重量%的碳酸钙的水悬浮液任选加入步骤d)的洗脱液中的方法。在本发明的另一实施方案中,将包含2-60重量%、优选10-50重量%、特别优选20-40重量%的氢氧化镁的水悬浮液任选加入本发明方法步骤d)的洗脱液中。本发明还包括一种其中将包含2-25重量%、优选10-20重量%的碱式碳酸镁的水悬浮液任选加入步骤d)的洗脱液中的方法。
在通过使用阴离子交换剂以上述方式从本发明方法步骤c)或d)得到的含有D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的洗脱液或溶液或悬浮液中,一价阳离子,优选铵离子、钾离子和/或钠离子的含量降至≤1g/kg洗脱液/溶液的浓度。
使用本身已知的方法,例如喷雾干燥、喷雾粒化、流化床干燥、流化床粒化、转鼓式干燥或旋转急骤干燥(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry,第六版,1999,电子版,“固体材料的干燥”一章)将含有泛酸钙和/或泛酸镁的洗脱液或溶液或悬浮液干燥和/或配制。对流干燥中气体入口温度为100-280℃,优选120-210℃。气体出口温度为50-180℃,优选60-150℃。为了建立所需粒度分布和有关的产物性能,可分离出细颗粒并再循环。另外,可将粗材料在磨中研磨,并且同样再循环。
根据本发明,在上述方法中,在产生具有高生物价值的所需产物的同时,减少复杂的后处理步骤是有利的,尤其是避免使用有机溶剂。另外,根据本发明,所产生的废水量显著减少。因此这导致进一步节省复杂的后处理和处理车间。因此,本发明方法的优点在于与传统方法相比它更简单、不易出错、耗时更少、显著便宜并因而更经济。
然而,这并不排除可对本发明方法进行改变。本文开头提及的本发明的工艺步骤a)-d)可通过一个或多个本领域熟练技术人员熟悉的下列工艺步骤来补充。在这种情况下,本发明涵盖额外工艺步骤与(必需)工艺步骤a)-e)的所有可能组合。
因此,例如可通过加热(灭菌)或其它方法如巴氏消毒法或过滤除菌将来自工艺步骤a)-d)的溶液或悬浮液消毒。
在本发明方法的其它变体中,在干燥和/或配制所述溶液或悬浮液之前,可进行至少一个下列步骤和/或这些步骤的组合:生物质的溶菌和/或灭菌和/或从发酵溶液中分离除去该生物质和/或加入其它添加剂和/或优选通过除去水将该发酵溶液浓缩。
因此,本发明还涉及一种其中在发酵溶液中仍旧进行生物质的溶菌和/或灭菌或直到从该发酵溶液中分离除去该生物质之后才进行前述步骤的方法。这例如可通过优选80-200℃下的温度处理和/或优选用硫酸或盐酸的酸处理和/或优选用溶菌酶的酶催方式来进行。
在本发明的另一实施方案中,可通过过滤、分离(例如离心分离)和/或倾析从本发明方法步骤a)、c)或d)的溶液或悬浮液中除去发酵微生物的细胞。也可使步骤a)的溶液不经分离除去所存在的生物而直接通过阴离子交换剂。
若在本发明方法的经由阴离子交换剂的后处理步骤(步骤b))之前没有分离除去生物质,则也可使该含有生物质的发酵溶液有利地由底部往顶部(即以与重力相反的方向)通过离子交换床。
从经由阴离子交换剂的后处理中得到的溶液可任选在中和之后通过合适的蒸发器如降膜式蒸发器、薄膜式蒸发器或旋转式蒸发器浓缩。这些蒸发器例如由GIG(4800Attnang Puchheim,奥地利)、GEA Canzier(52303Düren,德国)、Diessel(31103 Hildesheim,德国)和Pitton(35274 Kirchhain,德国)制造。
为了改善终产物的颜色性能,可进行其中将少量活性炭加入该工艺过程中所得的溶液或悬浮液中的额外过滤步骤,并然后将所得悬浮液过滤。或者,可使发酵过程中所得的溶液通过小活性炭床。为此所需的活性炭用量为发酵溶液重量的百分之几,并且该量凭借本领域熟练技术人员的知识和经验是已知的。
这些过滤可通过在过滤之前向各溶液或悬浮液中加入工业助凝剂而得以简化(例如Sedipur CF 902或Sedipur CL 930,产自BASF AG,Ludwigshafen)。
在本发明的有利实施方案中,发酵排出物(发酵液)通过加热来灭菌,然后通过离心分离、过滤或倾析除去细胞物质。在基于发酵排出物加入50-1000mg/kg、优选100-200mg/kg工业上传统的助凝剂之后,将该混合物过滤通过活性炭与砂子的短床以得到具有高D-泛酸含量的不含生物质的溶液。然后使该处理后的溶液通过离子交换床。
若在本发明的经由阴离子交换剂的后处理步骤之前没有分离除去生物质,则也可有利地使该含有生物质的发酵溶液由底部往顶部(即以与重力相反的方向)通过离子交换床。若悬浮物质存在于待提纯的溶液或悬浮液中,则该程序通常是有利的。
然后,例如可通过喷雾干燥将该溶液或悬浮液干燥。这可以并流、逆流或混合流进行。为了雾化,可使用所有已知的雾化器,尤其是离心雾化器(雾化盘)、单流喷嘴或双流喷嘴。优选的干燥温度条件是150-250℃的塔入口温度和70-130℃的塔出口温度。然而,干燥也可在更高或更低的温度水平下进行。为了得到非常低的残留湿气,可以在流化床下游提供另一干燥步骤。
喷雾干燥也可在FSD或SBD干燥器中进行(FSD:流化床喷雾干燥器;SBD:喷雾床干燥器),如由Niro(丹麦哥本哈根)和APV-Anhydro(丹麦哥本哈根)制造的,它们是喷雾干燥器与流化床的组合。
在喷雾干燥过程中,可添加防结块剂。这可减少干燥器壁上的沉积并改善流动特性,确切地在细粒粉末的情况下。可使用的防结块剂尤其是硅酸盐、硬脂酸盐、磷酸盐和玉米淀粉。
原则上,干燥也可在喷雾的流化床中进行,在这种情况下这不仅可连续进行,还可分批进行。可将溶液或悬浮液不仅从顶部(顶部喷雾)和从底部(底部喷雾)喷雾,而且还可从侧面(侧面喷雾)进行喷雾。
本发明还涉及一种用作动物饲料添加剂和/或动物饲料添加物的组合物,这种情况下它可通过如下步骤制备:
a)使用至少一种生物,该生物产生D-泛酸,在该生物中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成,并且该生物通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐,其中该培养基中供入有0-20g/l、优选0g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐,
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阴离子交换剂,
c)使用含有无机或有机钙盐和/或镁盐的溶液将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根以D-泛酸钙和/或D-泛酸镁形式洗脱,或者使用HCl溶液将结合的D-泛酸根以游离D-泛酸形式洗脱,
d)任选加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的洗脱液的pH设定为3-10,得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液,以及
e)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的洗脱液或溶液进行干燥和/或配制。
在本发明的有利变体中,在步骤c)中,可使用含有酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐和/或碱性无机和/或有机钙盐和/或镁盐的洗脱溶液。
在本发明的另一变体中,在步骤d)或在步骤e)中,可得到或存在含有泛酸钙和/或泛酸镁且在进一步加工之后产生本发明组合物的悬浮液。
根据本发明,该组合物的特征在于它包含浓度为至少1-100重量%、优选至少20-100重量%、特别优选至少50重量%的D-泛酸盐。本发明涉及一种包含D-泛酸的二价阳离子形式的盐,优选D-泛酸钙和/或D-泛酸镁的组合物。根据本发明,优选特征在于D-泛酸的一价阳离子形式的盐的含量≤1g/kg的组合物。
根据本发明,通过上述方法,得到满足饲料添加剂要求的D-泛酸钙和/或D-泛酸镁。这些要求例如是较高含量的D-泛酸盐和与目标生物的高相容性以及高的表示本发明产物的“维生素活性”的生物价值。
本发明将通过下列实施例更详细地描述,然而这些实施例不是对本发明的限制。
实施例1:
在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基:
原料 | 浓度[g/l] |
酵母提取物 | 10 |
谷氨酸钠 | 5 |
硫酸铵 | 8 |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 6.7 |
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 9.8 |
灭菌后,额外加入下列无菌培养基成分:
原料 | 浓度[g/l] |
葡萄糖 | 2.5 |
硫酸钙 | 0.1 |
硫酸镁 | 1 |
柠檬酸钠 | 1 |
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
痕量盐溶液 | 1ml |
所述痕量盐溶液具有下列组成:
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为6升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中,加入60ml枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD=10),并将该悬浮液于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993的附件进行描述。
在47h内,加入6.5升无菌水溶液,其组成如下:
原料 | 浓度[g/l] |
葡萄糖 | 550 |
硫酸钙 | 0.7 |
痕量盐溶液 | 6ml |
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中,通过加入25%浓度的氨溶液或20%浓度的磷酸将pH调节为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速,以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30%。在停止加入碳源之后,继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95%。然后结束发酵,并将该生物加热破坏。为此,将该发酵溶液灭菌45分钟。通过沉积出来表明已成功破坏。
然后通过离心分离将细胞分离除去。在细胞分离之后,D-泛酸盐的浓度在48h后为22.8g/l。
按相似方法,也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和>90g/l的发酵液。
将1000ml发酵液由底部往顶部泵送通过其中装有约100ml强碱性离子交换剂Lewatit MP 500(OH-形式)的250ml玻璃柱。流速为约20ml/min。然后用约1000ml去离子水以相同的泵送速率将该柱子洗涤。该溶液含有NH4 +、Ca2+、K+、Mg2+和Na+阳离子。然后使用约1000ml 10%浓度的氯化钙溶液将结合于所述离子交换剂上的D-泛酸洗脱。洗脱液含有D-泛酸钙形式的泛酸、硫酸根离子和不同价态的磷酸根离子。
然后,将75ml所得D-泛酸钙溶液的样品通过在旋转式蒸发器上蒸除水而干燥,得到4.8g D-泛酸钙含量为35%的浅棕色D-泛酸钙粉末。该粉末不易相互粘连在一起且具有良好的产物性能。
实施例2:
在容量为14升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基:
原料 | 浓度[g/l] |
酵母提取物 | 10 |
谷氨酸钠 | 5 |
硫酸铵 | 8 |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 8.4 |
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 15 |
灭菌后,额外加入下列无菌培养基成分:
原料 | 浓度[g/l] |
葡萄糖 | 2.5 |
氯化钙 | 0.1 |
氯化镁 | 1 |
柠檬酸钠 | 1 |
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
痕量盐溶液 | 1ml |
所述痕量盐溶液具有下列组成:
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为5.5升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中,加入55ml枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD=10),并将该悬浮液于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993的附件进行描述。
在48h内,加入6升无菌水溶液,其组成如下:
原料 | 浓度[g/l] |
葡萄糖 | 550 |
氯化钙 | 0.6 |
痕量盐溶液 | 6ml |
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中,通过加入25%浓度的氨溶液或20%浓度的磷酸将pH调节为约7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速,以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的30%。在停止加入碳源之后,继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95%。然后结束发酵,并将该生物加热破坏。为此,将该发酵溶液灭菌30分钟。通过沉积出来表明已成功破坏。
然后通过离心分离将细胞分离除去。在细胞分离之后,D-泛酸盐的浓度在48h后停止时为24.1g/l。
按相似方法,也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和>90g/l的发酵液。
将1300ml发酵罐排出物输送通过离子交换剂Lewatit MP 500(Cl-形式)的床(体积约1升),并用约1升水洗涤出来。流速调节为约20ml/min。
以相同流速,将2升5%浓度的石灰乳悬浮液泵送通过离子交换剂。将D-泛酸钙含量为28g/l的溶液洗脱。没有检测到铵离子、钾离子、镁离子或钠离子。与离子交换剂之前的起始溶液相比,磷酸根离子浓度降低了20%。
将该D-泛酸钙水溶液在Niro Minor喷雾干燥器中干燥。塔入口温度为约200℃。塔出口温度为85-90℃。使用双流喷嘴在4巴压力下进行雾化。不添加隔离剂。
所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量%表示):
水含量:2g/100g
D-泛酸钙:56.3g/100g
铵离子:<0.01g/100g
钾离子:<0.01g/100g
钠离子:<0.01g/100g
镁离子:<0.01g/100g
实施例3:
在容量为300升的装有搅拌器和气体引入装置的实验室发酵罐中加入具有下列组成的含水发酵培养基:
原料 | 浓度[g/l] |
大豆粉 | 40 |
酵母提取物 | 5 |
谷氨酸钠 | 5 |
硫酸铵 | 8 |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 10 |
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 20 |
灭菌后,额外加入下列无菌培养基成分:
原料 | 浓度[g/l] |
葡萄糖 | 2.5 |
硫酸钙 | 0.1 |
硫酸镁 | 1 |
柠檬酸钠 | 1 |
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
痕量盐溶液 | 1ml |
所述痕量盐溶液具有下列组成:
0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升。该痕量盐溶液通过无菌过滤加入。初始液体体积为100升。上面所给含量以该值为基础。
向该溶液中,加入4升枯草芽孢杆菌PA824的接种培养物(OD=120),并将该悬浮液于43℃和剧烈搅拌下在1.8m3/h的气体引入速率下发酵。该菌株按照PCT/US 0025993的附件进行描述。
在43h内,加入113升无菌水溶液,其组成如下:
原料 | 浓度[g/l] |
葡萄糖 | 550 |
氯化钙 | 0.6 |
柠檬酸钠 | 2 |
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.02 |
谷氨酸钠 | 5 |
痕量盐溶液 | 1ml |
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中,通过加入25%浓度的氨溶液或20%浓度的磷酸将pH调节为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速,以将溶解的氧气含量保持为其饱和度的30%。在停止加入碳源之后,继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95%。43h后,结束发酵。通过在碟式分离机中分离将细胞除去。然后将该不含细胞的发酵溶液灭菌60分钟。通过沉积出来表明已成功破坏。
在细胞分离和灭菌之后,D-泛酸盐的浓度为21g/l。按相似方法,也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和>90g/l的发酵液。将该发酵溶液过滤。
使1800ml所得滤液通过离子交换剂Lewatit MP 500(OH-形式)的床(1升)。用水洗涤离子交换剂。流速为约20ml/min。
以相同流速,使约2升的8%浓度的盐酸溶液通过离子交换剂。收集洗脱液,并用20%的石灰乳(氢氧化钙在水中的浆液)将pH设定为约7。将该洗脱液通过纸滤器再次过滤,所得滤液是2174g D-泛酸钙含量为21g/l的D-泛酸钙水溶液。
喷雾干燥在Niro Minor实验室喷雾干燥器中进行。塔入口温度平均为约185℃,塔出口温度为约95℃。使用双流喷嘴在2巴压力下进行雾化。得到具有下列技术指标的粉末产物(数据以重量%表示):
水含量:1.4g/100g
D-泛酸钙:52.2g/100g
铵离子:<0.01g/100g
钾离子:<0.01g/100g
钠离子:<0.01g/100g
镁离子:<0.01g/100g
实施例4:
在容量为20升的装有搅拌器和气体引入装置的发酵罐中,将200g大豆粉、50g 50%浓度的酵母提取物、25g谷氨酸钠、40g硫酸铵和5ml消泡剂Tego KS911与3.9升去离子水混合,并将这些内容物在121℃下灭菌30分钟。
然后加入溶液1、2、3和4。
溶液1按如下制成:将87.5g葡萄糖、0.5g CaCl2·2H2O和5gMgCl2·6H2O溶解在500ml去离子水中,并灭菌。
溶液2按如下制成:将25ml柠檬酸亚铁溶液(200g/l柠檬酸钠、2g/lFeSO4·7H2O,无菌过滤)与5ml痕量盐溶液(0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5gH3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O与水共同构成1升,无菌过滤)混合。
溶液3按如下制成:将12.5g葡萄糖与水共同构成100ml,并灭菌。
溶液4按如下制成:将25g KH2PO4、50g K2HPO4、25g NaH2PO4和50g Na2HPO4与水共同构成500ml,并灭菌。
向混合培养基(加入所有溶液之后的体积:5升)中,加入100ml枯草芽孢杆菌PA668-2A的接种培养物(在SVY培养基(SVY培养基:将25gDifco Veal肉浸汁、5g Difco酵母提取物、5g谷氨酸钠、2.7g(NH4)2SO4溶解在740ml水中,并灭菌;加入200ml无菌的1M K2HPO4(pH7)和60ml无菌的50%葡萄糖溶液(终体积1升))中),并将该培养物于43℃和剧烈搅拌下在12L/min的气体引入速率下发酵。该菌株按照US 60/262,995的附件进行描述。
在48h内,加入约4.3升无菌的葡萄糖水溶液。该水溶液按如下制成:将5kg葡萄糖·H2O和3.3g CaCl2·2H2O与2.1kg去离子水混合,并灭菌30分钟。然后,加入11ml痕量盐溶液(组成见上)和55ml柠檬酸亚铁溶液(组成见上)。然后加入73ml无菌过滤的375g/l谷氨酸钠溶液。
发酵在葡萄糖限制的条件下进行。在发酵过程中,通过加入25%浓度的氨溶液或20%浓度的磷酸将pH保持为7.2。氨同时还起发酵用氮源的作用。控制搅拌器元件的转速,以将溶解的氧气含量保持为其饱和值的20%。通过随时加入消泡剂Tego KS 911以控制起泡。在停止加入碳源之后,继续发酵直到溶解的氧气含量(pO2)达到其饱和值的95%。然后结束发酵。通过离心分离将细胞除去。上清液中残留细胞通过加热灭菌而破坏。通过沉积出来表明已破坏。在分离和灭菌之后,D-泛酸盐的浓度为29.6g/l。按相似方法,也可生产未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和>90g/l的发酵液。
实施例5:
将700ml来自实施例4的发酵液由底部往顶部泵送通过其中装有约1升强碱性离子交换剂Lewatit MP 500(OH-形式)的1.4升玻璃柱。流速为20ml/min。然后用约2000ml去离子水以相同的泵送速率将该柱子洗涤。该溶液含有NH4 +、Ca2+、K+、Mg2+和Na+阳离子。然后使用约2000ml 5%浓度的氯化钙溶液将结合于所述离子交换剂上的D-泛酸洗脱。洗脱液含有D-泛酸钙形式的泛酸、氯离子、硫酸根离子和不同价态的磷酸根离子。
将该D-泛酸钙水溶液在Niro Minor实验室喷雾干燥器中干燥。塔入口温度为约200℃,塔出口温度为85-90℃。使用双流喷嘴在4巴压力下进行雾化。不添加隔离剂。所得粉末产物具有下列技术指标(数据以重量%表示):
水含量:2%
D-泛酸盐:24%
铵离子:0.05%
钾离子:0.09%
钠离子:0.02%
镁离子:<0.01%
实施例6:
将1000ml来自实施例4的发酵排出物泵送通过离子交换剂LewatitMP 500(Cl-形式)的床(体积约1升),并用约2升水洗涤。流速控制为约20ml/min。
以相同流速,将2升10%浓度的氯化钙溶液泵送通过离子交换剂。将D-泛酸盐含量为11g/l的溶液洗脱。没有检测到铵离子、钾离子、镁离子或钠离子。与离子交换剂之前的起始溶液相比,磷酸根离子的浓度降至7.7%。
然后,将75ml所得D-泛酸钙溶液的样品通过在旋转式蒸发器上蒸除水而干燥,得到3.3g D-泛酸盐含量为25%的浅棕色D-泛酸钙粉末。该粉末不易相互粘连在一起且具有良好的产物性能。
实施例7:
使1500ml从实施例4得到的滤液通过离子交换剂Lewatit MP500(OH-形式)的床(1升)。用水洗涤该离子交换剂。流速为约20ml/min。以相同流速,使约2升的约5%浓度的盐酸溶液通过该离子交换剂。
收集洗脱液,并用20%浓度的石灰乳(氢氧化钙在水中的浆液)将pH调节为约7。然后将该洗脱液通过纸滤器再次过滤,得到2174g作为滤液的D-泛酸盐含量为19g/l的D-泛酸钙水溶液。
然后,将75ml所得D-泛酸钙溶液的样品通过在旋转式蒸发器上蒸除水而干燥,得到5.7g D-泛酸盐含量为25%的棕色D-泛酸钙粉末。该粉末不易相互粘连在一起且具有良好的产物性能。
实施例8:
使1500ml从实施例4得到的滤液通过离子交换剂Lewatit MP500(OH-形式)的床(1升)。用水洗涤该离子交换剂。流速为约20ml/min。
以相同流速,使约2升的约4%浓度的氢氧化钙悬浮液通过该离子交换剂。收集洗脱液,并将其pH调节为约7。该D-泛酸钙水溶液的D-泛酸盐含量为21g/l。
然后,将75ml所得D-泛酸钙溶液的样品通过在旋转式蒸发器上蒸除水而干燥,得到5.6g D-泛酸盐含量为28%的棕色D-泛酸钙粉末。该粉末不易相互粘连在一起且具有良好的产物性能。
Claims (34)
1.一种制备D-泛酸和/或其盐的方法,其包括如下步骤:
a)使用至少一种枯草芽孢杆菌,该枯草芽孢杆菌产生D-泛酸,在该枯草芽孢杆菌中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成,并且该枯草芽孢杆菌通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐,其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐,
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阴离子交换剂,
c)使用含有无机或有机钙盐和/或镁盐的溶液将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根以D-泛酸钙和/或D-泛酸镁形式洗脱,或者使用HCl溶液将结合的D-泛酸根以游离D-泛酸形式洗脱,
d)任选加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的洗脱液的pH设定为3-10,得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液,以及
e)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的洗脱液或溶液进行干燥和/或配制。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述培养基中没有供入游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐。
3.如权利要求1所述的方法,其中在步骤a)中,生成D-泛酸和/或其盐,含量为至少10g/l培养基。
4.如权利要求2所述的方法,其中在步骤a)中,生成D-泛酸和/或其盐,含量为至少10g/l培养基。
5.如权利要求3或4所述的方法,其中在步骤a)中生成的D-泛酸和/或其盐的含量为至少20g/l培养基。
6.如权利要求3或4所述的方法,其中在步骤a)中生成的D-泛酸和/或其盐的含量为至少40g/l培养基。
7.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中在步骤b)中,将一价阳离子的含量降至≤1g/kg溶液的浓度。
8.如权利要求7所述的方法,其中一价阳离子为铵离子、钾离子和/或钠离子。
9.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中步骤c)中的洗脱溶液包含酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐,和/或碱性无机和/或有机钙盐和/或镁盐。
10.如权利要求9所述的方法,其中在步骤c)中,所述无机盐是钙和/或镁的卤化物。
11.如权利要求9所述的方法,其中在步骤c)中,所述无机盐是CaCl2和/或MgCl2。
12.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中步骤c)中的洗脱溶液包含氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁或碳酸镁。
13.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中在步骤c)中,所述有机盐是甲酸钙和/或镁、乙酸钙和/或镁、丙酸钙和/或镁、氨基乙酸钙和/或镁或乳酸钙和/或镁。
14.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中在步骤d)中,将溶液的pH设定为5-10。
15.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中在步骤d)中,将溶液的pH设定为5-9。
16.如权利要求15所述的方法,其中在步骤d)中,将溶液的pH设定为6-9。
17.如权利要求16所述的方法,其中在步骤d)中,将溶液的pH设定为6-8。
18.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中为了中和,将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入步骤d)的溶液中。
19.如权利要求15所述的方法,其中为了中和,将氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化镁和/或碱式碳酸镁以固体和/或水悬浮液形式加入步骤d)的溶液中。
20.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中将包含2-55重量%的氢氧化钙的水悬浮液加入步骤d)的溶液中。
21.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中将包含2-65重量%的碳酸钙的水悬浮液加入步骤d)的溶液中。
22.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中将包含2-60重量%的氢氧化镁的水悬浮液加入步骤d)的溶液中。
23.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中将包含2-25重量%的碱式碳酸镁的水悬浮液加入步骤d)的溶液中。
24.如权利要求1-4任一项所述的方法,其中在步骤d)或步骤e)中,得到或加入含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
25.一种用作动物饲料添加剂和/或动物饲料添加物的组合物,其中它可通过如下步骤制备:
a)使用至少一种枯草芽孢杆菌,该枯草芽孢杆菌产生D-泛酸,在该枯草芽孢杆菌中去调节泛酸(pan)和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)的生物合成,并且该枯草芽孢杆菌通过在培养基中发酵生成至少2g/l D-泛酸盐,其中该培养基中供入有0-20g/l游离β-丙氨酸和/或β-丙氨酸盐,
b)使该含有D-泛酸盐的发酵溶液通过阴离子交换剂,
c)使用含有无机或有机钙盐和/或镁盐的溶液将结合于所述阴离子交换剂上的D-泛酸根以D-泛酸钙和/或D-泛酸镁形式洗脱,或者使用HCl溶液以游离D-泛酸形式洗脱,
d)任选加入钙碱和/或镁碱以将该含有游离D-泛酸的洗脱液的pH设定为至3-10,得到含有泛酸钙和/或泛酸镁的溶液,以及
e)将该含有泛酸钙和/或泛酸镁的洗脱液或溶液进行干燥和/或配制。
26.如权利要求25所述的组合物,其中在步骤c)中,使用包含酸性无机和/或有机钙盐和/或镁盐,和/或碱性无机和/或有机钙盐和/或镁盐的洗脱溶液。
27.如权利要求25所述的组合物,其中在步骤d)或步骤e)中,得到或存在含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
28.如权利要求26所述的组合物,其中在步骤d)或步骤e)中,得到或存在含有泛酸钙和/或泛酸镁的悬浮液。
29.如权利要求25-28任一项所述的组合物,包含二价阳离子形式的D-泛酸盐。
30.如权利要求25-28任一项所述的组合物,包含D-泛酸钙和/或D-泛酸镁。
31.如权利要求25-28任一项所述的组合物,包含浓度为至少1-100重量%的D-泛酸盐。
32.如权利要求25-28任一项所述的组合物,包含浓度为至少20-100重量%的D-泛酸盐。
33.如权利要求25-28任一项所述的组合物,包含浓度为至少50重量%的D-泛酸盐。
34.如权利要求25-28任一项所述的组合物,其中一价阳离子形式的D-泛酸盐的含量≤1g/kg。
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