CN100451005C - 脱氧新羟曲霉酸及制备及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种如下式1所示的新结构化合物,脱氧新羟曲霉酸。本发明还涉及一种产生所述脱氧新羟曲霉酸的微生物,以及利用所述微生物制备脱氧新羟曲霉酸的方法。本发明还涉及脱氧新羟曲霉酸用于具有制备通过上调高密度脂蛋白受体表达活性作用及抑制巨噬细胞泡沫化作用等防治动脉粥样硬化作用药物的用途。
Description
发明领域
本发明涉及一种如下式1所示的新结构化合物,脱氧新羟曲霉酸。本发明还涉及一种产生所述脱氧新羟曲霉酸的微生物,以及利用所述微生物制备脱氧新羟曲霉酸的方法。本发明还涉及脱氧新羟曲霉酸用于制备防治动脉粥样硬化作用的药物用途,包括具有上调高密度脂蛋白受体表达活性的作用的药物或制备具有抑制巨噬细胞泡沫化作用的药物的用途。
式1
发明背景
迄今已发现来源于微生物的生物活性物质已达16000多种,其中包括目前在临床应用的用于治疗动脉粥样硬化相关疾病的他汀类药物。所述药物具有良好的抗动脉粥样硬化作用,但是,仍存在着因作用广泛而选择性差,易导致转氨酶活性增高和可能溶解横纹肌等毒副作用。
为了获得更好的治疗动脉粥样硬化相关疾病的药物,长期以来各国科学家一直致力于筛选选择性更高、调脂效果更好的药物。
长期的病理学研究表明,高水平的血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)具有预防动脉粥样硬化样心血管疾病作用。因此维持高密度脂蛋白胆固醇动态平衡的调节和开发直接有利于高密度脂蛋白胆固醇代谢的药物是人们所期望的新一代调脂药。
血浆HDL-C水平由各种脂质、循环载脂蛋白和脂质转运蛋白、细胞外脂肪酶、细胞表面受体和质膜蛋白转运子等组成一个复杂的网络来调节。B类I型清道夫受体(SR-BI)是一种细胞膜表面高密度脂蛋白受体,能选择性地介导HDL胆固醇的摄取,在高密度脂蛋白(HDL)的代谢中通过调节HDL-C水平和HDL颗粒大小和组成而具有突出的调节血脂作用。
另外,HDL受体又是胆固醇逆转运过程的重要的介导蛋白,实验表明它介导外周细胞游离胆固醇的流出,同时在肝脏的HDL受体能主动调节胆固醇酯的主动摄取。
总之,HDL受体表达上调剂可以通过增强胆固醇的逆转运过程,有可能使泡沫细胞中过量的胆固醇外流,并通过逆转运机制转运到肝脏细胞被利用,从而使已形成的动脉粥样硬化脂质斑块发生逆转。换言之,高密度脂蛋白受体表达的上调剂可以增强SR-BI对于HDL代谢的调节作用,尤其是可能使动脉血管壁业已形成的由大量胆固醇及胆固醇酯蓄积沉积而成的脂质斑块逐渐消退,从而起到预防和治疗动脉粥样硬化及其引起的冠心病的作用。
本发明人借助高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型,经过大量实验,从多种不同微生物发酵产物中筛选到来自曲霉属发酵培养液的高密度脂蛋白受体表达的上调剂-脱氧新羟曲霉酸,其具有较强的高密度脂蛋白受体表达的上调作用以及抑制巨噬细胞泡沫化的活性。
发明内容
本发明一个方面涉及一种如式1所示的脱氧新羟曲霉酸:
式1
借助于高密度脂蛋白受体表述上调剂筛选模型,本发明人发现曲霉属菌株2101的培养液具有高密度脂蛋白受体表达的上调活性。经X-5大孔吸附树脂吸附、乙酸乙酯萃取、HP-20大孔吸附树脂柱层析和高效液相色谱制备等一系列分离纯化步骤,得到具有上调高密度脂蛋白受体表达活性的化合物2101C。
基于光谱分析确定2101C的结构为脱氧新羟曲霉酸,具有如式1所示结构。
脱氧新羟曲霉酸具有如表1所示的理化性质和如表2所示的核磁共振光谱数据:
表1脱氧新羟曲霉酸的理化性质
表2脱氧新羟曲霉酸的1H-NMRa、13C-NMRb、1H-1H COSYa和HMBC
a:500MHz in CDCl3 b:125MHz in CDCl3
本发明的另一方面涉及一种产生本发明所述脱氧新羟曲霉酸的微生物,曲霉属菌株2101,其已于2004年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),北京,中关村北一条,保藏号为CGMCC 1125。
本发明另一方面涉及制备本发明所述脱氧新羟曲霉酸的方法,包括:1)利用曲霉属菌株2101(CGMCC 1125)在适于所述脱氧新羟曲霉酸产生的条件下培养所述微生物;
2)在适当条件下从微生物培养液中回收所产生的脱氧新羟曲霉酸。
在本发明中,可以采用例如下述方法培养所述微生物获得含有所述脱氧新羟曲霉酸的微生物培养液:
1)将曲霉属菌株2101在YM斜面培养基上,27℃培养7天;
2)将菌种斜面接种到种子培养基,27℃培养48小时;
3)将种子培养基接种到发酵培养基,27℃下培养96小时,收获培养液。
在本发明中,可以采用如下方法从培养液中收获所得的脱氧新羟曲霉酸:
1)如上述方法所得微生物培养液经离心分离,分别得到培养液上清液和菌丝体沉淀;
2)菌丝体用丙酮浸泡过夜,过滤后除去菌丝体得到丙酮滤液,滤液减压浓缩后除去丙酮,与步骤1)中所得上清液合并后一起通入X-5大孔吸附树脂进行吸附;
3)分别用水,30%,50%,80%浓度的丙酮水溶液解吸附,收集80%丙酮洗脱液,减压浓缩除去丙酮,所得水液用乙酸乙酯萃取;
4)萃取液蒸去乙酸乙酯后,所得样品再进行HP-20大孔吸附树脂柱层析,分别利用30%,50%,80%的丙酮水溶液洗脱,收集80%丙酮洗脱液,减压浓缩除去丙酮,水液冷冻干燥;
5)步骤4)所得冷干品经制备型高效液相色谱制备,甲醇∶水(60∶40)做流动相,分部收集洗脱液,减压浓缩除去甲醇,冷冻干燥后得到脱氧新羟曲霉酸精制品。
如上述获得的本发明脱氧新羟曲霉酸在人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型中,显示出对高密度脂蛋白表达较强的上调活性。细胞实验结果表明,脱氧新羟曲霉酸也具有较强的巨噬细胞泡沫化抑制活性。
本发明所述的人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型是基于基因重组技术的报告基因筛选方法。具体的,所述模型包括利用含有所选报告基因(如荧光酶基因)的重组载体,其中所述重组载体中还含有人高密度脂蛋白受体基因CLA-1(CD36和LIMPII类似物-1)上游的表达调控序列,其位于报告基因(荧光素酶基因)的上游。通过荧光测定检测报告基因的表达量,显示待测化合物是否具有上调人高密度脂蛋白受体表达的活性。
本发明再一方面涉及脱氧新羟曲霉酸用于制备具有上调高密度脂蛋白受体表达活性的作用或具有抑制巨噬细胞泡沫化作用的药物的用途。
附图说明
图1脱氧新羟曲霉酸(2101C)抑制巨噬细胞泡沫化的镜检结果(油红O染色法)。
图2脱氧新羟曲霉酸的紫外光谱。
图3脱氧新羟曲霉酸的红外光谱。
图4脱氧新羟曲霉酸的SI-MS。
图5脱氧新羟曲霉酸的1H-NMR谱。
图6脱氧新羟曲霉酸的13C-NMR谱。
图7脱氧新羟曲霉酸的DEPT谱。
图8脱氧新羟曲霉酸的1H-1H COSY谱。
图9脱氧新羟曲霉酸的HSQC谱。
图10脱氧新羟曲霉酸的HMBC谱。
实施例
实施例1.脱氧新羟曲霉酸的制备
1.曲霉属菌株2101的发酵培养
1)将曲霉属菌株2101在YM斜面培养基上,27℃培养7天;YM斜面培养基的组成为:酵母浸膏粉0.4%,麦芽浸膏粉1.0%,葡萄糖0.4%,琼脂1.2%,调pH为7.3;
2)将菌种斜面接种到500毫升种子培养基中,27℃摇床培养48小时;种子培养基的组成为:黄豆粉0.3%,玉米浆1.0%,葡萄糖2.0%,糊精1.0%,鱼蛋白栋0.50%,硫酸铵0.20%,调pH为6;
3)将种子培养基以10%接种量接种到1000毫升发酵培养基,27℃下摇床培养96小时,收获培养液;发酵培养基的组成同种子培养基。
2.脱氧新羟曲霉酸的分离纯化
在本发明中,可以采用例如下述方法从培养液中收获所得的脱氧新羟曲霉酸:
1)如上述方法所得10升曲霉菌2101培养液经离心分离,分别得到培养液上清液和菌丝体沉淀;
2)菌丝体用5升80%丙酮水溶液浸泡过夜,过滤后除去菌丝体得到丙酮滤液,滤液减压浓缩后除去丙酮得到水液2升,与步骤1)中所得上清液合并后一起通入φ6×50厘米的X-5大孔吸附树脂柱进行吸附,流速15毫升/分钟;
3)分别用水,30%,50%,80%浓度的丙酮水溶液各3升进行洗脱,分部收集洗脱液每份100毫升,合并80%丙酮洗脱液,40℃水浴减压浓缩除去丙酮,所得水液每次用500毫升乙酸乙酯萃取,共萃取三次,合并乙酸乙酯萃取液;
4)萃取液蒸去乙酸乙酯后,得到粗品5.1克,分两次上样于φ2.5×40厘米的HP-20大孔吸附树脂柱,分别用30%,50%,80%的丙酮水溶液洗脱,流速5毫升/分钟,分部收集,每份50毫升,收集80%丙酮洗脱液,40℃水浴减压浓缩除去丙酮,水液冷冻干燥,得到冷干品1.6克;
5)步骤4)所得冷干品200毫克,经岛津LC-10Avp高效液相色谱制备,制备柱为岛津Shim-pack PREP-ODS,φ2.0×25厘米,甲醇∶水(60∶40)做流动相,流速5毫升/分钟,检测波长323nm,分部收集脱氧新羟曲霉酸洗脱液,减压浓缩除去甲醇,冷冻干燥后得到脱氧新羟曲霉酸精制品6.3毫克。
实施例2.脱氧新羟曲霉酸的表征脱氧新羟曲霉酸的结构解析:
式1脱氧新羟曲霉酸的结构式
具体地,本发明所述脱氧新羟曲霉酸的高分辨SI-MS测得[M+H]+为225.1597720,计算值225.1597426。元素分析结果:C 62.52%,H8.80%,N 11.30%,O 17.38%。综合质谱和元素分析结果,得到所述化合物的分子式为C12H20N2O2,分子量为224,不饱和度为4。
碳谱和DEPT谱共出现12个碳的信号,包括4个甲基,1个亚甲基,4个次甲基和3个位于低场区的季碳。由1H-1H COSY可以得到3-和6-两个异丁基侧链各自的相关信号,其中CH-7(δ4.31,d,J=6)由于与羟基和芳环相连其化学位移处于较低场。CH-8为前手性基团,受7位手性碳的影响,CH3-9和CH3-10两个甲基所处的化学环境不同,其氢谱的化学位移分别为δ0.90和δ0.99,碳谱的化学位移分别为δ18.9和δ17.7。CH-8(δ1.96,dqq,J=6,6.5,6.5)则分别与CH-7、CH-9和CH3-10耦合产生八重峰。同样,7位手性碳的影响经吡嗪环共轭体系传递至3-侧链,使CH2-11上的两个氢产生同碳耦合(J=14Hz),并分别再与CH-12耦合形成双四量峰。CH3-13和CH3-14在氢谱中的化学位移相同,仅在碳谱中表现出微小的差异,其碳谱化学位移分别为δ22.59和δ22.64。CH-12(δ2.21,tqq,J=7,7,7)则分别与CH2-11和CH3-13、CH3-14相耦合产生九重峰。
紫外光谱中228nm和323nm的最大吸收为典型的吡嗪类化合物吸收峰。由于吡嗪环上没有与CH-7(δ7.31,s)相耦合的质子,因此CH-7呈现单峰。在HMBC中可以找到CH-7、CH-8对C-6和CH-7对C-5的远程相关峰,以及CH2-11、CH-12对C-3和CH2-11对C-2的远程相关峰,因此分别确定了3-和6-两个侧链的连接位置,并可以将C-3(δ158.5)和C-2(δ157.4)两个化学位移较近的季碳区分开来。同时CH-5对δ158.5的远程相关信号远强于对δ157.4相关峰的事实,也说明δ157.4的羰基碳与CH-5的距离较远。红外光谱中1651cm-1的强吸收峰为酰胺羰基的vC=O。
据文献报道,曲霉酸类化合物可以产生两种互变异构体,如式2所示。也应该存在类似的互变异构现象,但由于烯醇式芳杂环不能稳定存在,故吡嗪酮式应该是比较稳定的结构。由C-6的化学位移为δ138.4(C=C),而不是完全芳构化后类似于3位C=N的δ158.5,也可以证明上述推论。
式2
综上所述,该化合物的结构确定为脱氧新羟曲霉酸(desoxyneohydroxyaspergillic acid),化学命名为6-(1-羟基-2-甲基丙基)-3-(2-甲基丙基)-2(1H)-吡嗪酮。
实施例3.高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型测定脱氧新羟曲霉酸上调受体表达活性
A)重组表达质粒pGL3-CLAP的构建
菌株和细胞株
E.coli DH5α用于质粒DNA的遗传操作。肝癌BEL-7402细胞株(购自上海午立生物技术有限公司)用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的构建。
质粒
pGEM-T(购自Promega公司)用于PCR产物的克隆。pGL3-Basic(购自Promega公司)为报告基因载体,含有无启动子的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码基因,用于人高密度脂蛋白受体调控序列的克隆。
pGL3-control(购自Promega公司)含有SV40启动子和增强子序列,用于荧光素酶表达的阳性对照。pRL-TK(购自Promega公司)包含编码海肾(Renilla reniformis)荧光素酶的cDNA,与实验载体共转染哺乳动物细胞,用于双荧光素酶报告基因体系的内对照。
高密度脂蛋白受体基因调控序列的获得
根据文献报道的CLA-1基因序列,利用软件Primer Premier 5.0设计PCR引物P1(5’-CCTCGAG TGG AGC CAT TGT GTG CAA AG-3’)(SEQID NO:2)和P2(5’-CAAGCTT CGG CGA CAG AGA CGA CAC AG-3’)(SEQID NO:3),用于扩增人SR-BI基因上游1055bp 62bp(以SR-BI基因起始密码子ATG的A为+1)长度为996bp的片段,其中P1引入了XhoI酶切位点,P2引入了HindIII酶切位点。
以人肝癌细胞BEL-7402总DNA为模板设立25μlPCR反应体系:1×PCR缓冲液,0.5μmol/L P1和P2,2.5μmol/L dNTPs,0.5U TaqDNA聚合酶。反应条件为94℃变性5min;94℃变性40s,54℃退火40s,72℃延伸1min 20s(30个循环);72℃延伸10min。PCR扩增的目的片段用pGEM-T载体克隆后酶切鉴定并测定所得调控序列的序列,如SEQ ID NO:1所示。
依据分子克隆:实验室指南中所述的方法,将PCR产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α受体菌,用蓝白斑法挑选转化子。对转化子进行快速质粒提取后进行酶切鉴定,用XhoI,HindIII双切后含目的片段的转化子为克隆有目的片段的重组子,命名为pGEM-CLAP。
重组质粒pGL3-CLAP的构建
用XhoI,HindIII双切重组质粒pGEM-CLAP得到目的片段后,将目的片段与经过相同双酶切的pGL3-basic质粒相连,从而将人SR-BI基因上游调控序列定向插入到pGL3-basic的荧光素酶基因上游,构建成重组质粒pGL3-CLAP。
B)人高密度脂蛋白受体SR-BI上调剂的筛选
细胞培养与转染
RPMI-1640 Medium(Hyclone)(含10%标准胎牛血清(Hyclone),100U/毫升青霉素,100μg/毫升链霉素)用于肝癌细胞BEL-7402的培养。转染用质粒DNA的提取采用WizardR PureFection Plasmid DNAPuriffcation System试剂盒(Promega)。采用LipofectAMINETM 2000Reagent(Invitrogen)转染试剂盒进行细胞转染。
荧光素酶表达活性的测定
细胞荧光素酶表达活性的测定采用荧光检测试剂盒LuciferaseAssay System和Dual-Luciferase Assay System(Promega)。用BMGPolarstar Galaxy紫外-可见-荧光台式培养板用分光光度计检测荧光素酶活性。
筛选样品的准备
待筛化合物溶于DMSO。微生物发酵液用等体积丙酮或乙酸乙酯提取后干燥,溶于DMSO。
转染条件的确定
以pGL3-basic为阴性对照质粒,pGL3-control为阳性对照质粒,与构建的质粒pGL3-CLAP同时分别瞬时转染肝癌BEL-7402细胞,对转染条件进行优化,确定用96孔培养板初步筛选化合物和微生物次级代谢产物的条件如下:每孔接种5×104个细胞,200ng质粒DNA,0.5μl脂质体,转染时间为6小时,转染6小时后换为无血清无抗生素培养基。
加入待筛选的样品后继续温育18小时后,测定肝癌BEL-7402细胞中荧光素酶活性,结果见表3。
实验结果表明不同孔的变异系数(CV)不超过10%,孔间一致性较好,而pGL3-CLAP与pGL3-basic组间差别显著。
表396孔培养板读数的孔间差异(x±s,n=10)
DMSO对筛选结果的影响
待筛样品采用DMSO溶解,因此测定了不同浓度DMSO荧光素酶活性的影响,结果表明,在DMSO浓度为0.1%-0.01%时对荧光素酶活性影响较小,筛选时采用此范围浓度并设置溶媒对照孔。
待测样品对荧光素酶表达活性改变率的计算
用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率:
改变率(%)=(A-B)/B X 100
其中,A为加入待测样品后测定的荧光素酶表述活性(或相应的荧光单位),B为加入阴性对照样品(空白)后测定的荧光素酶表达活性。
对于改变率在+20%以上的待测样品可初步认定为具有人高密度脂蛋白受体上调剂。
筛选结果
应用上述确定的筛选条件测定本发明所述脱氧新羟曲霉酸,结果见表4,其中本发明所述脱氧新羟曲霉酸使得荧光素酶活性改变率大于+60%,显示为强人高密度脂蛋白受体上调剂。
表4.脱氧新羟曲霉酸(2101C)上调高密度脂蛋白活性结果(荧光报告基因法,荧光强度)
样品 | 荧光素酶活性(均值) | 增幅(%) |
空白 | 26335.3 | |
对照(0.1%DMSO) | 17949.1 | -7.6048381 |
2101C(5μg/ml) | 40685.3 | 126.67042 |
2101C(2.5μg/ml) | 38647.6 | 115.31776 |
2101C(1.25μg/ml) | 29757.6 | 65.788814 |
实施例4脱氧新羟曲霉酸抑制巨噬细胞泡沫化活性的测定
A)氧化的低密度脂蛋白(OX-LDL)的制备
将低密度脂蛋白(LDL)溶于0.15mol/L,pH7.4的NaCl溶液中,然后放入透析袋中置于含10μmol/L CuSO4的PBS中,37℃透析12小时后,在含0.1%EDTA的PBS中透析24小时,0.2μm微孔滤膜过滤除菌,备用。用硫代巴比妥酸反应物含量来鉴定LDL氧化程度。以四乙氧基丙烷为标准品,按丙二醛(MDA)测定试剂盒说明书操作,测定此批氧化后每毫克LDL的丙二醛含量。
B)将人类单核细胞株U937,置于37℃含0.5%CO2培养箱中,倍增时间为24~48小时,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中悬浮生长,培养液中加青霉素和链霉素各1.0×105IU/L。U937细胞实验前用100nmol/L的佛波酯(PMA)刺激72小时,使其由单核细胞分化为巨噬细胞。换无血清培养液并加到96孔培养板上,每孔150μl,细胞密度为1×106个/毫升左右,此时将U937细胞分为对照组、泡沫细胞组和加样组。对照组只加无血清培养液,泡沫细胞组另加OX-LDL至每孔终浓度为80mg/L,加样组在泡沫组的基础上,再加入待测样品(5μl微生物发酵液),培养48小时后,进行染色。
C)U937细胞油红O染色
①油红O染色液的配制方法:油红0.3克溶于30毫升异丙醇,搅拌下60℃保温过夜,然后再加20毫升蒸馏水搅拌过夜,过滤。使用时必须用新鲜过滤好的滤液。
②U937细胞中性脂质的油红O染色法:按步骤2)提到的方法,将加好样的96孔培养板从二氧化碳孵箱中取出,10%戊二醛固定液固定(15μl/孔),10分钟后弃去溶液,水洗两次,再加入60%异丙醇(150μl/孔)放置5分钟,弃去溶液,用油红O染色液(150μl/孔)染色1小时,弃去溶液用60%异丙醇(150μl/孔)洗孔,然后水(150μl/孔)洗两次,最后每孔加150μl水放到显微镜下观察。
D)镜检结果
经油红O染色后,镜下观察不加OX-LDL的对照组细胞内无明显红色油滴状颗粒,而泡沫细胞组的细胞可见到细胞浆内有较多的红色油滴颗粒,并且由于个别细胞吞噬的油滴过多使得这些细胞体积增大,样品组中若有对巨噬细胞泡沫化有抑制作用的样品,其细胞中几乎无红色油滴颗粒。由附图所示,本发明所述脱氧新羟曲霉酸的加入,使得能够有效抑制对巨噬细胞的泡沫化。
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Claims (4)
2.一种产生权利要求1所述脱氧新羟曲霉酸的曲霉属菌株2101,其保藏号为CGMCC 1125。
3.一种制备权利要求1所述脱氧新羟曲霉酸的方法,包括:
1)利用权利要求2所述曲霉属菌株2101在适于权利要求1所述脱氧新羟曲霉酸产生的条件下培养所述曲霉属菌株2101,包括如下步骤:
a)将权利要求2所述曲霉属菌株2101在YM斜面培养基上,27℃培养7天;
b)将菌种斜面接种到种子培养基,27℃培养48小时;
c)将种子培养基接种到发酵培养基,27℃下培养96小时,收获培养液;以及
2)从曲霉属菌株2101培养液中回收所产生的脱氧新羟曲霉酸,包括如下步骤:
d)将如上述所得曲霉属菌株2101培养液经离心分离,分别得到培养液上清液和菌丝体沉淀;
e)将菌丝体用丙酮浸泡过夜,过滤后除去菌丝体得到丙酮滤液,滤液减压浓缩后除去丙酮,与步骤d)中所得上清液合并后一起通入X-5大孔吸附树脂进行吸附;
f)分别用水,30%,50%,80%浓度的丙酮水溶液解吸附,收集80%丙酮洗脱液,减压浓缩除去丙酮,所得水液用乙酸乙酯萃取;
g)萃取液蒸去乙酸乙酯后,所得样品再进行HP-20大孔吸附树脂柱层析,分别利用30%,50%,80%的丙酮水溶液洗脱,收集80%丙酮洗脱液,减压浓缩除去丙酮,水液冷冻干燥;以及
h)步骤g)所得冷干品经制备型高效液相色谱制备,甲醇∶水按照60∶40做流动相,分部收集洗脱液,减压浓缩除去甲醇,冷冻干燥后得到脱氧新羟曲霉酸精制品。
4.权利要求1所示脱氧新羟曲霉酸用于制备具有上调高密度脂蛋白受体表达活性的作用或具有抑制巨噬细胞泡沫化作用的药物的用途。
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