CN100418587C - 一种仿生层状关节软骨/骨复合植入体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种仿生层状结构软骨/骨植入体的制备方法，属于生物医用材料或生物复合材料技术领域。工艺为：多孔同种异体骨或异种骨植入体的制备、人工软骨预制体的制备和层状软骨/骨复合体的制备。将人或动物关节处骨头临床要求的形状和尺寸，进行清洗和免疫处理后，置于特制模具底部；在加压和负压的条件下，依次将聚乙烯醇/生物活性分子预制体和聚乙烯醇/润滑分子预制体注入模具中，表面找平，加压压实。经反复冷冻一溶融成型，得到仿生层状结构软骨/骨植入体。优点在于：得到一种表层为耐磨润滑层，中间层为受力层，底层为生物活性软骨/骨结合层的仿生层状关节软骨/骨复合植入体；可满足软骨的生物力学性能和生理功能。

Description

一种仿生层状关节软骨/骨复合植入体的制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料或生物复合材料技术领域，特别是提供了一种仿生层状关节软骨/骨复合植入体的制备方法。
背景技术
软骨组织的修复和替代是临床外科的常见手术。目前临床上关节软骨的治疗主要采用自体或异体软骨移植和人工软骨置换。目前研究较多的人工软骨材料主要有金属-超高分子量聚乙烯对磨关节假体、硅橡胶、聚氨酯关节软垫材料、聚乙烯醇水凝胶等。这些软骨假体虽然在一定程度上能起到替代软骨的作用，但还存在易磨损松动、界面润滑性差、缺乏生物活性等等不足，替代软骨的生理功能还有待进一步提高。采用辐射交联和冷冻-熔融交联等方法得到高结晶度的聚乙烯醇水凝胶弹性体，具有优异的强度、弹性和延展性能，以及良好的生物相容性、高含水量、多微孔组织和水透过性，其理化性能和生物学性能比其它人工合成材料更接近生物组织，是一种较理想的软骨替代材料。但PVA水凝胶表面光滑，没有生物活性，作为软骨假体植入关节部位时与骨基底的结合性能差，影响了软骨的固定和修复功能。
为解决上述问题，发明了一种仿生多层结构软骨植入材料的制备方法(申请公开号200510012257.x，发明人：郑裕东等)，通过该方法可以获得一种表层为耐磨润滑层，中间层为受力层，底层为骨生物活性连接层的仿生多层结构复合水凝胶人工软骨植入材料，解决了现有水凝胶软骨材料难以同时满足润滑性、生物活性和生物力学性能的问题，使人工软骨材料在结构和功能上与天然软骨更接近。
尽管这种仿生多层结构软骨植入材料在结构和性能上大大提高，但对人体软骨植入修复时，还存在与软骨下骨固定的问题。现在临床上一般采用嵌入固定、螺丝固定、不锈钢网固定等，但各自均存在不同问题，如连接松动、固定效果差、人工软骨与底骨结合不牢固、手术难度和风险大等，影响了人工软骨的置换和替代效果。为进一步改善和提高植入软骨的生物力学性能和生理功能，本发明人提出在体外在同种异体骨、异体骨上仿生组装人工软骨，得到一种层状关节软骨/骨复合植入体，临床上可通过骨水泥粘结、硬组织上的螺丝固定等方法植入缺损部位，提高了软骨与骨的结合和固定效果，减小手术风险和难度。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种仿生层状关节软骨/骨复合植入体的制备方法，通过该方法可获得一种表面为耐磨润滑软骨、中间为受力层和钙化层、底部为多孔同种异体骨或异种骨的软骨/骨复合植入体。解决了临床人工软骨置换存在的连接松动、固定效果差、人工软骨与底骨结合不牢固、手术难度和风险大等问题，提高人工软骨的替代效果和生理功能。
本发明的制备工艺如下：
第一步：多孔同种异体骨或异种骨植入体的制备
取人或动物关节处骨头，清洗后加工为圆柱状、方柱状或球面状，根据临床要求尺寸可为截面积1.0～900mm2，厚度1.0～20.0mm。用高压水枪反复冲洗10～180分钟；在空气中干燥0.5～5天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理10～150分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原等有机质和骨屑等完全清洗干净，进行免疫处理后，冷冻保存(称为骨样)。使用前1小时在冰水中浸泡备用。
第二步：人工软骨预制体的制备
a、将分析纯聚乙烯醇(PVA)在85～95℃恒温水浴或110～150MPa压力锅中溶于的二次蒸馏水中，配制为重量百分比浓度为15～30％的均匀水溶液(溶液I)。
b、分别在PVA水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、壳聚糖、透明质酸或透明质酸钠(HA)，其中聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖加入量为PVA重量的5～40％，壳聚糖应在0.1～20％的稀酸溶液中溶解2～48小时后在加入PVA溶液中；HA先溶于生理盐水中配制为均匀溶液，再加入PVA水溶液中，HA在PVA溶液中的浓度为0.1～3％重量百分比。上述混合溶液在85～95℃下搅拌后，静置12～48小时或真空排气2～8小时，至气泡完全排除(预制体II)。
c、分别采用羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃和同种异体骨的颗粒与溶液I复合，可采用以下方法之一(1)分别将羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃等研磨至30μm以下，加入至85～95℃PVA水溶液中，生物活性成分的含量为PVA重量的5～20％，并用超声分散仪处理1～5小时以上，得到均匀悬浮溶液(预制体III)。(2)在剧烈搅拌下将重量百分比浓度为2％～20％的乙醇钙溶液加入PVA溶液中；按Ca/P比为1.0～3.0配制成浓度H3PO4无水乙醇溶液，振荡搅拌均匀后，缓慢滴加到上述PVA溶液中，充分搅拌反应后得到PVA/纳米羟基磷灰石、PVA/纳米磷酸三钙、PVA/生物活性玻璃复合溶液(预制体III)。
第三步：仿生层状软骨/骨复合体的制备
d、用不锈钢管或铝合金管加工为与骨样截面积相同，长度为2～30mm的模具，经水洗、超声波清洗后，将骨样置于模具下端。在加压或负压条件下，先将预制体IH注入模具中，厚度为0.1～10mm，施加0.1～10Mpa的负压使预制体与骨样完全接触；再注入预制体II，厚度为0.05～5mm，表面找平，加压压实。
e、将上述模具置入-10～-40℃的冰箱中，冷冻3～24小时，然后于15～40℃溶融2～10小时，经反复冷冻-熔融2～8次，即得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
采用本发明人提供的制备方法，可在体外条件下在同种异体骨、异体骨上仿生组装人工软骨，得到一种表层为耐磨润滑层，中间层为受力层，底层为生物活性软骨/骨结合层的仿生层状关节软骨/骨复合植入体。不仅解决了现有水凝胶软骨材料难以同时满足润滑性、生物活性和生物力学性能的问题，使人工软骨材料在结构和功能上与天然软骨更接近。而且这种软骨/骨复合植入体在临床上可通过骨水泥粘结或螺钉固定等方法植入缺损部位，提高了软骨与骨的结合和固定效果，减小手术风险和难度。此外采用本方法所得到的软骨/骨复合材料，层与层之间紧密结合，在本体材料破坏前，各层之间不会明显分界或剥离，具有很好的结构和性能稳定性，可满足软骨的生物力学性能和生理功能。
具体实施方式
实施例1
a、取猪关节处骨头，清洗后加工为圆柱状，直径为10.0mm，厚度5.0mm。用高压水枪反复冲洗90分钟；在空气中干燥2天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理45分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原等有机质和骨屑等完全清洗干净后，冷冻保存。使用前1小时在冰水中浸泡备用。
b、将分析纯聚乙烯醇(PVA)在90℃恒温水浴中，配制为重量百分比浓度为15％的均匀溶液(溶液I)。
c、润滑层制备：在PVA水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，加入量为PVA重量的10％，混合溶液在90℃下充分搅拌后，静置24小时，至气泡完全排除后得到预制体II。
d、生物活性层制备：将珊瑚羟基磷灰石研磨至30μm以下，加入至90℃PVA水溶液中，珊瑚羟基磷灰石的含量为PVA重量的10％，并用超声分散仪处理3小时，得到均匀预制体III。
e、用直径10mm，长度8mm的不锈钢管为模具，充分清洗后，将骨样置于模具下端。先将预制体III注入模具中，厚度为0.2mm，施加0.5MPa的负压使预制体与骨样充分接触；再注入预制体II，厚度为0.1mm，表面找平，加压压实。
f、将上述模具置入-20℃的冰箱中，冷冻6小时，然后于25℃溶融8小时，经反复冷冻-熔融4次，即得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。
实施例2
a、取猪关节处骨头，清洗后加工为方柱状，截面积8×8mm2，厚度10.0mm。用高压水枪反复冲洗30分钟；在空气中干燥1天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理30分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原等有机质和骨屑等完全清洗干净后，冷冻保存(称为骨样)。使用前1小时在冰水中浸泡备用。
b、将分析纯聚乙烯醇(PVA)在95℃恒温水浴中，配制为重量百分比浓度为30％的均匀水溶液(溶液I)。
c、将壳聚糖在0.5％的稀乙酸溶液中溶解24小时后，加入PVA溶液中，壳聚糖加入量为PVA重量的8％；将混合溶液在95℃下充分搅拌后，真空排气6小时，至气泡完全排除，得到预制体II。
d、将生物活性玻璃研磨至30μm以下，加入至95℃PVA水溶液中，其含量为PVA重量的15％，用超声分散仪处理5小时以上，得到均匀预制体III。
e、用不锈钢加工截面积为8×8mm2，长度为13mm的模具，清洗后，将骨样置于模具下端。在加压或负压条件下，先将预制体III注入模具中，厚度为1mm，施加1Mpa的负压使预制体与骨样充分接触；再注入预制体II，厚度为1.5mm，表面找平，加压压实。
f、将上述模具置入-30℃的冰箱中，冷冻4小时，然后于30℃溶融10小时，经反复冷冻-熔融6次，即得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。
实施例3
a、取猪关节处骨头，清洗后球面状，球面半径为10mm，厚度15.0mm。用高压水枪反复冲洗150分钟；在空气中干燥3天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理150分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原等有机质和骨屑等完全清洗干净后，冷冻保存。
b、将分析纯聚乙烯醇在125MPa压力锅中溶于的二次蒸馏水中，配制为重量百分比浓度为20％的均匀溶液(溶液I)。
c、将透明质酸(HA)溶于生理盐水中配制为均匀溶液-加入PVA水溶液中，HA在PVA溶液中的浓度为0.15％重量百分比。上述混合溶液在95℃下搅拌后静置48小时，至气泡完全排除后得到预制体II。
d、在剧烈搅拌下将重量百分比浓度为5％的乙醇钙溶液加入PVA溶液中；按Ca/P比为2.0配制成浓度H3PO4无水乙醇溶液，振荡搅拌均匀后，缓慢滴加到上述PVA溶液中，充分搅拌反应后得到PVA/纳米磷酸三钙复合溶液(预制体III)。
e、用铝合金管加工为直径21mm，长度20mm的模具，清洗后，将骨样置于模具下端。在加压条件之，先将预制体III注入模具中，厚度为5mm，施加3Mpa的压力使预制体与骨样完全接触；再注入预制体II，厚度为4mm，表面找平，加压压实。
f、将上述模具置入-20℃的冰箱中，冷冻10小时，然后于25℃溶融8小时，经反复冷冻-熔融8次，即得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。
实施例4
a、取牛关节处骨头，清洗后加工为圆柱状，直径为5mm，厚度为20.0mm。用高压水枪反复冲洗180分钟；在空气中干燥5天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理150分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原等有机质和骨屑等完全清洗干净后冷冻保存，使用前1小时在冰水中浸泡备用。
b、将分析纯聚乙烯醇在115 MPa压力锅中溶于的二次蒸馏水中，配制为重量百分比浓度为25％的均匀溶液(溶液I)。
c、将透明质酸钠(HA)溶于生理盐水中配制为均匀溶液，再加入PVA水溶液中，HA在PVA溶液中的浓度为2.5％重量百分比。上述混合溶液在90℃下充分搅拌后，真空排气8小时，至气泡完全排除得到预制体II。
d、将磷酸三钙研磨至30μm以下，加入至95℃PVA水溶液中，其含量为PVA重量的10％，用超声分散仪处理5小时以上，得到均匀预制体III。
e、用不锈钢管加工为直径为30mm，厚度为25mm的模具，清洗后，将骨样置于模具下端。先将预制体III注入模具中，厚度为8mm，施加9Mpa的压力使预制体与骨样完全接触；再注入预制体II，厚度为5mm，表面找平，加压压实。
f、将上述模具置入-35℃的冰箱中，冷冻20小时，然后于35℃溶融8小时，经反复冷冻-熔融6次，即得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。
实施例5
a、取牛关节处骨头，清洗后加工方柱状，截面积5×5mm2，厚度8.0mm。用高压水枪反复冲洗90分钟；在空气中干燥2天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理100分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原等有机质和骨屑等完全清洗干净后，冷冻保存。使用前1小时在冰水中浸泡备用。
b、将分析纯聚乙烯醇在95℃恒温水浴中，配制为重量百分比浓度为25％的均匀水溶液(溶液I)。
c、在PVA水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，加入量为PVA重量的20％，混合溶液在95℃下搅拌后，真空抽气6小时，至气泡完全排除后得到预制体II。
d、在剧烈搅拌下将重量百分比浓度为5％的乙醇钙溶液加入PVA溶液中；按Ca/P比为1.67配制成浓度H3PO4无水乙醇溶液，振荡搅拌均匀后，缓慢滴加到上述PVA溶液中，搅拌反应后得到PVA/纳米羟基磷灰石复合溶液(预制体IH)。
e、用不锈钢加工截面积为5×5mm2，长度为10mm的模具，清洗后，将骨样置于模具下端。先将预制体III注入模具中，厚度为1mm，施加2Mpa的压力使预制体与骨样完全接触；再注入预制体II，厚度为1mm，表面找平，加压压实。
f、将上述模具和样品置入-20℃的冰箱中，冷冻6小时，然后于30℃溶融8小时，经反复冷冻-熔融4次，即得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。

Claims (3)

1. 一种仿生层状关节软骨/骨复合植入体的制备方法，其特征在于，制备工艺为：
(1)多孔同种异体骨或异种骨植入体的制备
取人或动物关节处骨头，清洗后加工为圆柱状、方柱状或球面状，用高压水枪反复冲洗10～180分钟；在空气中干燥0.5～5天；用砂纸打磨骨植入体表面，并于室温下在超声清洗器中处理10～150分钟，直到骨块内的骨细胞、骨髓、胶原有机质和骨屑清洗干净，进行免疫处理后，冷冻保存，称为骨样；使用前1小时在冰水中浸泡备用；
(2)人工软骨预制体的制备
a、将分析纯聚乙烯醇在85～95℃恒温水浴或110～150MPa压力锅中溶于二次蒸馏水中，配制为重量百分比浓度为15～30％的均匀水溶液，为溶液I；
b、分别在聚乙烯醇水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、透明质酸或透明质酸钠，其中聚乙烯吡咯烷酮或壳聚糖加入量为聚乙烯醇重量的5～40％，壳聚糖应在0.1～20％的稀酸溶液中溶解2～48小时后在加入PVA溶液中；透明质酸钠先溶于生理盐水中配制为均匀溶液，再加入聚乙烯醇水溶液中，透明质酸钠在聚乙烯醇溶液中的浓度为0.1～3％重量百分比；上述混合溶液在85～95℃下搅拌后，静置12～48小时或真空排气2～8小时，至气泡完全排除，为预制体II；
c、分别采用羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃和同种异体骨的颗粒与溶液I复合，得到预制体III；
(3)仿生层状软骨/骨复合体的制备
用不锈钢管或铝合金管加工为与骨样截面积相同，长度为2～30mm的模具，经水洗、超声波清洗后，将骨样置于模具下端；在加压或负压条件下，先将预制体III注入模具中，厚度为0.1～10mm，施加0.1～10Mpa的负压使预制体III与骨样完全接触；再注入预制体II，厚度为0.05～5mm，表面找平，加压压实；将模具置入-10～-40℃的冰箱中，冷冻3～24小时，然后于15～40℃溶融2～10小时，经反复冷冻-熔融2～8次，得到一种仿生层状结构软骨/骨植入体。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，采用羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙或生物活性玻璃与溶液I复合的方法为：分别将羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙或生物活性玻璃研磨至30μm以下，加入至85～95℃聚乙烯醇水溶液中，羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙或生物活性玻璃的含量为聚乙烯醇重量的5～20％，并用超声分散仪处理1～5小时以上，得到预制体III。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，采用羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、β-磷酸三钙或生物活性玻璃与溶液I复合的方法为：在剧烈搅拌下将重量百分比浓度为2％～20％的乙醇钙溶液加入聚乙烯醇溶液中；按Ca/P比为1.0～3.0配制成浓度H3PO4无水乙醇溶液，振荡搅拌均匀后，缓慢滴加到上述聚乙烯醇溶液中，充分搅拌反应后得到聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石、聚乙烯醇/纳米磷酸三钙和聚乙烯醇/生物活性玻璃复合溶液，为预制体III。
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