CN100410663C - 蛋白质组的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质组的分析方法，包括以下步骤：(1)分析标本的选择与处理；(2)蛋白质芯片的制作；(3)芯片的阅读；(4)资料分析；(5)蛋白质组的鉴定，鉴定蛋白质的方法包括：①肽质量指纹图谱鉴定蛋白质；②一级质谱结合串联质谱肽鉴定蛋白质；鉴定蛋白质的数据库包括：①蛋白质数据库；②蛋白质组数据库；③蛋白质序列数据库；④其他蛋白质序列数据库；⑤蛋白质三维结构相关数据库；⑥在线蛋白工具软件。蛋白质的其他鉴定方法；质谱仪配套软件直接鉴定蛋白质：质谱数据直接搜寻基因组数据库、蛋白质质谱鉴定软件和算法、人工神经网络联合飞行质谱。

Description

蛋白质组的分析方法

本发明涉及蛋白质组学产前诊断方法，主要用于各医疗单位的产前诊断实验室。

为了提高出生人口素质，1994年10月27日中华人民共和国主席令公布：“自1995年6月1日起施行产前诊断的有关法规标准”。1999年国务院办公厅又转发了卫生部关于“产前诊断管理办法”的通知，各地前后成立了各级产前诊断实验中心和行政管理机构，使我国产前诊断工作逐渐走向规范化。产前诊断又称“出生前诊断”或“宫内诊断”，是指在妊娠期的特定阶段，在胎儿出生之前，应用影像学、生物化学、细胞遗传学以及分子生物学等技术，了解胎儿宫内的发育状态，对先天性疾病和遗传性疾病(包括出生后发病的遗传性疾病)等的出生缺陷病作出诊断。所谓的先天性疾病是指未出生之前或生下来就存在的疾病，其中大多数表现为身体外部形态及内脏器官发育不正常，常与遗传有关，可以是遗传病，如脑积水、无脑儿、脊柱裂、先天性无肛门等。但还包括母体环境因素引起的胎儿疾病，如怀孕头三个月母亲感染风疹病毒、巨细胞病毒、弓形体或接触致畸物质所引起的胎儿先天性心脏病、先天性白内障等各种先天畸形或出生缺陷，虽然是先天的，但是由环境因素造成的，这类疾病不会传给后代。遗传性疾病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病，为精子或卵子或精子和卵子结合时就带有的遗传信息，常为先天性的，也可后天发病。如先天愚型、多指(趾)、先天性聋哑、血友病等，这些遗传病完全由遗传因素决定发病，并且出生时就患病。但有些完全由遗传因素决定的遗传病也可能在出生一定时间后才发病，有时要经过几年、十几年甚至几十年后才能出现明显症状。如假肥大型肌营养不良要到儿童期才发病；慢性进行性舞蹈病一般要在中年时期才出现疾病的表现。有些遗传病需要遗传因素与环境因素共同作用才能发病，如哮喘病，遗传因素占80％，环境因素占20％；胃及十二指肠溃疡，遗传因素占30％-40％，环境因素占60％-70％。遗传病常在一个家族中有多人发病，为家族性的，但也有可能一个家系中仅有一个病人，为散发性的，如苯丙酮尿症，因其致病基因频率低，又是常染色体隐性遗传病，只有夫妇双方均带有一个导致该疾病的基因时，子女才会成为这种隐性致病基因的纯合子(同一基因座位上的两个基因都不正常)而得病。遗传病分为单基因病(包括常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病、X连锁显性遗传病、X连锁隐性遗传病、Y连锁遗传病和线粒体病)、多基因病(包括冠状动脉病、原发性高血压病、原发性糖尿病、先天性巨结肠、尿道下裂、室间隔缺损、腭裂、脊柱裂等)、染色体病(包指染色体易位、缺失、倒位、等臂、重复等的结构异常和21-三体、18-三体、13-三体等的数目异常)、体细胞遗传病(包括体细胞中遗传物质改变所致的各种肿瘤和一些先天畸形等)。产前诊断是预防有严重遗传性疾病或先天性缺陷胎儿出生的有效而可靠的措施，是优生和提高人口素质的重要保障。目前的产前诊断，基本上还只限于孕妇B超检查以诊断胎儿神经管缺陷和胎儿羊水细胞染色体检查以诊断各类染色体病(主要是表现为智力低下的21-三体综合症和18-三体综合症，其次是性染色体等其他染色体的结构或数目异常)。在羊水染色体检查中，需抽取孕5个月左右孕妇的羊水，然后进行羊水细胞培养、制片、显带、染色、染色体核型分析等步骤，该过程约需3周。可见羊水染色体检查有不足之处：抽取羊水为有创手术，有伤及胎儿、导致流产、穿刺羊水失败、致孕妇和胎儿发生手术并发症、实验失败、操作繁琐费时、难以全自动化、工作效率很低而难以满足每个孕妇均作羊水染色体检查的需求，作产前诊断的孕妇需多次往返医院就诊、取血作产前筛查、取报告单、预约、抽羊水、数周后取报告单就诊，给孕妇造成较长时间(数个月)的精神负担等负面影响。为此，为了避免胎儿正常可能性较大的孕妇冒羊水染色体检查的风险以及减轻羊水染色体检查工作负荷，国内没有采取国外有的国家每个孕妇均作羊水染色体检查的规定，而是根据国情，对羊水染色体检查作了限定，规定了羊水染色体检查高危人群的指征即孕妇35周岁以上、有反复流产史、曾有遗传性疾病(染色体病)的家族史、夫妇一方患有染色体病或已生育过染色体病儿者、胎儿发育迟缓者、血清学产前筛查为(NTD高风险者通过B超确诊)21-三体或18-三体高风险者、超声检查发现与染色体疾病有关的标记或畸形者。上述限定虽解决了产前诊断工作的一些问题，但其不良后果是，不具有上述指征的孕妇因未作羊水染色体检查，有可能生育染色体病患儿，造成漏诊，而且“血清学产前筛查为(NTD高风险者通过B超确诊)21-三体或18-三体高风险者”的指征，是一种已广泛应用于临床的产前筛查指标，即检测妊娠12周至18周的早、中期孕妇血清中甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、游离雌三醇(UE3：)、妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的含量来计算产筛高风险或低风险，怀21-三体综合征孕妇妊娠中期血清AFP浓度比正常低约25％、HCG浓度比正常至少高2倍，UE3水平低于正常约2％，妊娠早期PAPP-A降低，利用上述3个指标(AFP、HCG、UE3)结合孕妇年龄和遗传风险评估，在孕早、中期约有65％21-三体或18-三体综合征胎儿被检出，较多研究认为，用上述3个指标和2个指标(AFP和HCG)筛选出患病胎儿的比例无显著差异，目前常用AFP和HCG两联法，对妊娠15周-18周孕妇进行产前筛查，大约有12％-15％的孕妇，经筛查后会被归为怀21-三体综合征高风险孕妇，产前筛查不同于产前诊断，筛查的目的是用较经济、简便、对胎儿无创伤性的检查方法在表面上正常的孕妇中筛选出21-三体和18-三体综合征的高风险个体，供进一步作羊水染色体检查确诊，但筛查有假阳性或假阴性，对于一般的筛查方法而言，筛查结果为阴性(低风险)的孕妇仍有0.05％的可能性怀21-三体综合征患儿(群体总体发病率为0.1-0.15％)，筛查结果为阳性的孕妇怀21-三体综合征胎儿的可能性是1％，假阳性率99％，产筛只能防止约65％的21-三体综合征患儿出生，其灵敏度和特异性还不理想，从而导致较多的实际上属产前筛查结果为低风险而不需作羊水染色体确诊检查的孕妇却因产前筛查结果为“高风险”而做了羊水染色体检查，而实际上属产前筛查结果为高风险而应作羊水染色体确诊检查的孕妇却因产前筛查结果为“低风险”而未做羊水染色体检查，导致产前诊断误诊率增高。综上所述，目前的产前筛查方法、产前诊断指征的限定范围以及产前诊断方法，在灵敏度、特异性、风险性、操作简便性、报告时间、操作自动化程度、工作效率、项目种类等方面均不理想，且各种基因病等的产前诊断几乎没有开展，为了解决上述问题，就迫切需要寻找一种简便、快速、灵敏、准确、高效、自动化、无风险、无痛苦、早期诊断、诊断项目全面、使每个孕妇都享有优质产前诊断的更先进的产前诊断方法。

产前诊断的方法同样会在前人的基础上取得进步。1953年美国科学家詹姆斯·沃森和英国科学家弗朗西斯·克里克一起，在英国《自然》杂志上发表了一篇仅两页的论文，提出了“DNA的结构和自我复制机制”，获得诺贝尔奖。1985年美国科学家Mullis等根据前人发明的“DNA的结构和自我复制机制”，将其机制应用于体外试管中，只是模仿DNA的结构和体内自我复制机制，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断，此即为Mullis发明的PCR技术，获发明专利和1993年度的诺贝尔化学奖；PCR可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。其原理类同于1953年克里克和沃森发明的DNA的体内复制。PCR技术的发明，加速了人类基因组计划的实施和完成，至2002年，人类DNA框架基本明确，人类基因组计划宣告完成，使生命科学进入了后基因时代，在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of geneexpression，SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control)，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control)。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。自1995年Williams和Wilkins首次提出蛋白质组学(proteome)的概念以来，蛋白质组学的研究颇受重视，2001年，国际最权威的杂志《自然》和《科学》对此作了高度的评价，将蛋白质组命名为是一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质，把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。自此以后，蛋白组学成为生命科学研究的新领域和核心内容之一。国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility(APAF)。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。2002年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT”著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index的美国科学家Normsn G Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(Human Proteome Organization，HUPO)，随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，完成人类基因组计划(Human Proteome Project)。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基(20/4)，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段。它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。国外的主要趋势有第一维电泳采用窄pH梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳-质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物，上述方法仍存在重复性差、无法检出占很大比例的低丰度蛋白质和跨膜蛋白质、分离的蛋白质鉴定困难、耗时长等缺点，2002年，日本学者田中(Tanaka)因发明了表面增强激光解吸飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS技术，国内称飞行质谱)而获2002年度诺贝尔化学奖，从而基本上解决了上述问题。飞行质谱由蛋白质芯片、质谱仪和分析软件组成，蛋白质芯片是在载体表面制作成一个个点状芯池，每个芯池用探针修饰，这种探针包括结合特定蛋白质的抗体或受体、结合某些阳离子或阴离子的化学基团、吸水或疏水物质、酶、免疫复合物等。根据芯片表面的不同化学成分，可将其分为化学表面芯片和生物表面芯片。化学表面芯片包括：疏水表面芯片(hydrophobic surface，H4)、亲水表面(normal phase，NP)芯片、强阴离子交换表面(stronganion exchange，SAX)芯片、弱阳离子交换表面(weak cationexahange，WCX)芯片、金属离子螯合(inunobilized metalafinity capture，IMAC)表面芯片等五种，主要用于检测未知蛋白。生物化学表面芯片包括：受体一配体芯片、酶一底物芯片、抗原一抗体芯片及DNA一蛋白质芯片等，通过特异性结合机制检测样本中的靶蛋白，基于飞行质谱所开发的蛋白质芯片，可以非特异性的结合并测定被测样本中的各种蛋白质，有研究报道，公认的人体内重要蛋白质有8000-10000种，也有人估计约有12000-15000种甚至达10万种，目前能被检测者近2000种；芯片阅读仪是在一个相对简单的飞行质谱仪上装备一个脉冲uv氮激光，激光激惹样本后样本雾化，其中的蛋白质解析/电离，这种离子化的分子先在一个高压电场中被加速后进入一个真空无电场区(即飞行时间管，TOF管)飞向离子检测器，不同质荷比(m/z)的蛋白质依据其通过TOF管的时间长短被记录，记录结果被相关软件分析，最终找出不同病变样本差异表达的蛋白质；在这些分析软件中，蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，人工神经网络(artificial neural network.ANN)联合飞行质谱在蛋白组学研究中也被普遍应用。人工神经网络(ANN)是以计算机网络系统模拟生物神经网络的一种智能化信息处理系统，人的大脑是由神经元网络体系构成的，感觉神经元通过感受器接受周围环境的各种变化(即刺激)，并把刺激能量转化为神经冲动，经传入神经传至中枢，经过中枢的分析综合，然后将信息沿传出神经传至效应器，以支配和调节各器官的活动。一些神经元接受来自其它神经元的信号输入而产生兴奋或抑制，当兴奋达到一定的阈值时，神经元就产生冲动，而且这一过程本身可以重复。正因为如此，一个神经元的输出总是与其输入是一对一的关系。同样，人类的适应和学习过程也是如此，必须通过神经元之间联系强度的改变来诱导。一个神经元使另一神经元兴奋的能力不是恒定的，可以随“经验”而变化，在一个神经元网络中，其输出仍然可以通过输入的相关函数来计算。由于网络中的关联强度是可变的，网络的输出与其输入的相关性可以随“经验”而改变，这就是Hebb[海布]最早提出的生物神经细胞之间的作用规律。神经网络有许多类型，在医学上，最常见的是多层前向感知器(Multilayerfeedforward perceptron)(MLP或MU、F)，这种类型的网络体现了大多数网络的一般原理。一旦设计出了ANN软件，就必须对其进行训练和有效化。ANN的工作原理实际是一种有效的学习算法，根据ANN类型及其应用目的，有多种学习算法可以采用，而最常用的学习算法是反向传播(Back-Propagation。BP算法)，BP算法属于一种监督式的学习算法，其主要思想为：对于q个输入学习样本：P1，P2，......，Pq，已知与其对应的输出样本为：T1，T2，......，Pt，学习的目的是用网络的实际输出A1，A2，......，Aq与其目标矢量T1，T2，......，Pt之间的误差来修改其权值，使(n＝1，2，......，q)与期望的1rn尽可能接近，即：使网络输出层的误差平方和达到最小。它是通过连续不断地在相对于误差函数斜率下降的方向上计算网络权值和偏差的变化而逐渐逼近目标的。每一次权值和偏差的变化都与网络误差的影响成正比，并以反向传播的方式传递到每一层。神经元的第一层代表预选输入参数，中层称之为隐含层，因为它们不直接与数据接触，而只是输入与输出神经元之间的通路。BP算法包括信息的正向传递与误差的反向传播。在正向传播过程中，输入信息从输入经隐含层逐层计算传向输出层，每一层神经元的输出作用于下一层神经元输入。如果在输出层没有得到期望的输出，则计算输出层的误差变化值，然后转向反向传播，通过网络将误差信号沿原来的连接通路反传回来修改各层神经元的权值直至达到期望目标。反向传播可通过整个训练过程使网络输出的均方误差最小化(即达到数据的最佳适应性)。每次学习训练允许修正的值必须在训练期前确定。一般来讲，问题越复杂，允许修正的值就越小。对于一些复杂的问题，BP算法可能要进行几小时甚至更长时间的训练。这主要是由于学习速率太小所造成的。对于复杂的网络，其误差函数为多维空间的曲面，就像一个碗，其碗底是最小值点。但是这个碗的表面是凹凸不平的，因而在对其训练过程中，可能陷入某一小谷区，而这一小谷区产生的是一个局部极小值。由此点向各方向变化均使误差增加，以至于使训练无法跳出这一局部极小值。为防止ANN陷入局部极小值和丢失最低误差值，则需要给网络提供一个学习动量。

飞行质谱技术曾获2002年度诺贝尔化学奖，该技术是在细胞水平上对生命功能直接执行体蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质，找出与疾病相关的特异蛋白质组即特异的疾病生物标志物，是对疾病的特异生物标志物作直接鉴定，是直接对疾病作出诊断、治疗、预防和预后观察，故优于酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验等间接测定生物标志物的方法，甚至优于1993年诺贝尔化学奖的基因诊断技术(PCR)。飞行质谱技术目前已广泛用于癌症、老年病、感染性疾病、心血管病和神经系统疾病的蛋白质组学研究分析，认为应用飞行质谱技术可以提高这些疾病的诊断率，其中应用于癌症的最多。国外研究人员应用飞行质谱检测了转移性黑色素瘤、肉瘤和肾癌，敏感性达87％。他们认为，该方法根据独特的8～24条蛋白指纹图可以用于多种癌症的诊断，如肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食道癌，其检测限量为飞摩尔/升。据报道，美国华盛顿伊丽莎白医院利用该技术检测肺癌，敏感性达98％，特异性97％；美国霍普金斯医学院检测了卵巢癌敏感性82％，特异性98％；霍普金斯医学院、美国国立癌症研究所合作检测乳腺癌，敏感性93％，特异性91％。国内研究也成绩斐然，结果十分惊人，各项统计指标均远好于经典的肿瘤标志。总之，只要具有特异生物标志物即能引起蛋白质组特异变化的疾病，均可用飞行质谱蛋白质组学的方法来诊断，虽然目前已开展产前诊断的几种疾病(遗传病)均有蛋白质变化的标志：如蛋白质以mRNA为模板翻译，两者有相关性(r＝0.5)，基因的突变会引起对应蛋白质的改变；怀患有神经管缺陷类多基因病遗传病胎儿的孕妇血浆中甲胎蛋白异常；怀患有染色体病(染色体数目异常如21-三体综合症、18-三体综合症)胎儿的孕妇血浆中甲胎蛋白及妊娠相关蛋白异常；在生物信息数据库类的功能数据库中，TRANSFAC的扩展库S/MART-DB收集了与染色体结构异常相关的蛋白因子和位点信息，说明了染色体结构异常与特定蛋白的关系；但目前尚未见与产前诊断相关的蛋白质组研究的报道；虽然国内外对飞行质谱的蛋白质组学临床应用作了一些研究，并建立了一些可用于临床疾病诊断的方法，但尚未见国内外建立基于飞行质谱技术的蛋白质组学产前诊断方法的报道。

本发明的目的是要提供一种通过分析被检产前诊断标本中出生缺陷病表达的蛋白质谱(或称为特异生物标志物、特异蛋白质组学图谱、一个或一组差异蛋白、蛋白质荷比数)从而作出出生缺陷病产前诊断或患出生缺陷病风险率评估的蛋白质组学产前诊断方法及其相关生物信息分析软件如人工神经网络产前诊断模型。

本发明的目的是这样实现的：从蛋白质组学的角度，基于飞行质谱等蛋白质组分析鉴定原理，成批分析被检产前诊断标本或对照标本的蛋白质谱，以定性或定量分析出生缺陷病特异蛋白质谱为原理建立蛋白质组学产前诊断方法，主要按以下操作实现，用飞行质谱蛋白芯片结合被检标本中的蛋白，经选择性清洗，芯片保留了高分辨率的蛋白谱，加能量吸收分子(EAM)后，芯片上保留的蛋白形成晶体，经特异激光照射，晶体发生解离使蛋白形成离子化分子，经高压电场加速后进入真空无电场区(飞行管)飞向离子检测器，不同质荷比(m/z)的蛋白质依据其通过飞行管的时间长短被记录，并经高速模拟数字转化器转化后，被测蛋白以一系列蛋白质荷比峰即蛋白质谱的形式呈现，以相关分析软件或人工神经网络筛选出疾病表达的差异蛋白质谱作为出生缺陷病产前诊断或患病风险率评估的标准，或通过人工神经网络Matlab-NNTools软件将被检标本作训练集和交叉验证后，以筛选出的差异蛋白利用反向传播算法建立人工神经网络预测模型，再经相应出生缺陷病标本盲法验证后，建立人工神经网络飞行质谱蛋白质组学产前诊断模型。

本发明可以不考虑成千上万种出生缺陷病的具体病种，只通过直接分析研究孕妇尿液、外周血液等标本(或胎儿、胚胎组织、羊水、绒毛、精子、卵子、受精卵等相关标本)中几种危害性最大的出生缺陷病的综合性特异生物标志物即分析其综合特异蛋白质谱、以所发现的一组综合性差异蛋白作为胎儿或胚胎各类出生缺陷病的产前诊断标准，以此建立起新的飞行质谱蛋白质组学产前诊断标准和方法，取代经典的羊水穿刺胎儿染色体核型分析以及产前筛查等方法。本发明与经典方法相比具有对胎儿无创性、无风险，操作简便、快速、灵敏、准确、高效、自动化、早期诊断、诊断项目全面等优点，可使孕妇产前诊断率达到100％，解决了目前的羊水染色体核型分析因手工操作繁琐费时致工作量太大使大部份孕妇无法作产前诊断而冒生育产前缺陷病患儿风险等诸多问题，减轻了孕妇及其家人的精神负担，方便了孕妇就诊，提高了工作效率及产前诊断的医疗质量。

下面详细说明实现本发明的总的实施方法和具体的实施方法。

本发明实现各类出生缺陷病蛋白质组学产前诊断方法的总的实施方法是：1、分析标本的选择与处理：分析标本可选用孕妇的尿液、外周血液、体液、分泌物、呼气成份、组织、细胞、出生缺陷病患者或疑似患者或胎儿组织、胚胎组织、脐血、羊水、绒毛、精子、精液、卵子、受精卵等，其中细胞和组织标本应先作裂解处理，具体方法有温和裂解法(渗透裂解：主要用于组织培养细胞和血细胞，通常用低渗溶液悬浮细胞；冻融裂解：常用于组织培养细胞，通常用液氮迅速冷冻细胞，随后在37℃融化，反复几次；去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜，裂解细胞，释放其内容物，常用于组织培养细胞，通常用含去污剂的裂解液悬浮细胞；酶裂解法：某些细胞含有细胞壁，需要首先用酶来消化细胞壁，如溶菌酶等，通常这些酶在等渗溶液中处理细胞)和剧烈裂解法(超声裂解：超声仪可产生超声波，通过切应力来裂解细胞；弗氏压碎器裂解：在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞；研磨法：用研钵或研杵研磨细胞，此法常用于固体组织，组织细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状；机械匀浆法：常用于固体组织，通常将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，通过过滤或离心获得裂解液；玻璃珠匀奖法：常用于细胞悬液，通常剧烈振荡的玻璃珠可以打破细胞壁释放细胞内容物)。2、蛋白质芯片的制作：包括(1)上样检测：裂解组织细胞的提取液及血清、尿液等标本经变性处理，再用相应的结合缓冲液稀释后即可用于上样检测；(2)芯片的处理：主要是用对应的结合缓冲液激活芯片，但金属螯合芯片等则需加入相关金属盐溶液使金属离子先结合在芯片表面后再激活；(3)上样后，样本与芯片充分结合反应，分别用结合缓冲液和去离子水洗去未结合的物质；(4)加入能量吸附分子(EAM)微干后即可上机检测。3、芯片的阅读包括：(1)在Ciphergen Software 3.1.1支持下，建立一个新数据库和一个新项目；(2)使用All-in-one标准蛋白质芯片校正质谱仪；(3)放入芯片，设最高分子量(50000Da)和最佳检测范围(2000-20000Da)，选择最佳激光强度和最佳检测灵敏度及数据收集方法和数据收集参数；(4)建立两个点阅读程序，即可进行芯片阅读和数据收集。4、资料分析：对收集的数据和谱图资料在Biomarker Wizard软件支持下首先进行基线干扰消减和噪音过滤，通常设置初始的噪音过滤值为5，允许分子量偏差为0.5％，以10％为最小阈值(在总样本中要出现的比率大于10％)，然后再作第二次的噪音过滤值为2来增加较小丰度的峰值：统一标准化处理后的资料蛋白分子质量精确度校正和自动波峰检测，分子量相同的信号被综合聚类，结果输出到EXCEL表中。初步筛选的结果，做同一质荷比处的蛋白峰相对强度组间平均数比较t检验，按照P值的大小确定在不同组别样本中上调或下调的质荷比蛋白质。筛选出的组间蛋白质表达存在统计学差异的蛋白质哪些具有分类意义，哪一种蛋白或哪几种蛋白质组合能将两组病变较好的区分开，这通常要在Biomarker PatternsTM Software支持下通过特殊算法完成。常用的方法有决策树法、人工神经网络和支持向量机法。决策树法是将待测样本分成训练组和测试组，先是决策树的训练和学习，依据决策树生成算法形成基本决策树，再以树的剪裁算法输出改良的决策树，提取分类规则；其次是按已提取的分类规则对双盲测试组进行分类预测，根据测试组分类误差的大小评估该分类规则对两组样本的分类能力。人工神经网络信息的处理由类似人脑功能的神经元之间的相互作用完成，网络的学习和计算决定各神经元连接权系的动态演化过程，用于处理一些环境信息十分复杂，背景知识不清楚，推理规则不明确的医学诊断问题。支持向量机方法是建立在统计学习理论的VC维理论和结构风险最小原理基础上的，根据有限的样本信息在模型的复杂性和学习能力之间寻求最佳折衷，以期获得最好的概括分析能力。采用人工神经网络或支持向量机在分类决策过程中均采用训练方式和分类决策方式进行。训练方式是指在已确定的特征空间中，对作为训练样本的量测数据进行特征选择与提取，得到它们在特征空间的分布，依据这些分布决定分类器的具体参数。由于各类样本分布呈现出聚类状态，因此可以将该特征空间划分成由各类占据的子空间，确定相应的决策分界。在三类算法中，决策树法更易理解且每个样本都能在决策树中显示(此外，还可采用传统的微阵列蛋白质芯片、二维电泳(2-DE)、基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)和电喷雾离子化来实施本发明)。5、蛋白质(组)的鉴定：对被分析的蛋白质谱，分析软件结合国际上建立的数据库检索作出鉴定：(1)鉴定蛋白质的方法及其软件包括①肽质量指纹图谱鉴定蛋白质：蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质是专一而特异的，称肽质量指纹图谱(PMF)，将实验所得PMF与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可鉴定蛋白质，所用数据库软件名称为：Mascot、Profound、PeptIdent、Proteinprospector、PepSea；②一级质谱(MS)结合串联质谱(MS/MS)肽鉴定蛋白质：根据MS测得精确分子质量和MS/MS所得序列信息，通过蛋白质数据库检索鉴定蛋白质，所用数据库软件为SEQUEST、Mascot、PepFrag。(2)鉴定蛋白质的数据库包括：①蛋白质数据库：SWISS-PROT/TrEMBL、Protein information Resource、NCBInr、dbEST、OWL、UniGene；②蛋白质组数据库：AAindex.GELBANK.Predictome.profeomeAnalysis Database、REBASE；③蛋白质序列数据库：Blocks、CDD、cluSTr、INterPro、Pfam、PROSITE；④其他蛋白质序列数据库：EMOTIF、PRINTS、iPROClASSO-GLYCBASE、PIR-ALN、Proclass、ProDom、ProtoMaP、SBASE、SMART、suPFAM、sysTERSE、GeneNest、spliceNest；⑤蛋白质三维结构相关数据库：PDB、MMDB；⑥在线蛋白工具软件名：MCB search、lanncher、DAS、Topred2、SOSUI、PS Ipred-MEM-SAT2、HMMTOP、SOSUI、CoPreThi、PSIpred-MEM-SAT2、HMMTOP、TMHMM、The predictProtein Server、SMART、SPLIT、PRED-TMR、TMAP、multalin、Protein Sequence Analysis、PSA、PRS、AAA。(3)蛋白质的其他鉴定方法：先纯化或至少浓缩标本以备鉴定，在蛋白质具有明显的理化性质或样本成分相对简单时可以直接从芯片表面获得蛋白，或选择抗体与预先已活化的芯片表面结合选择性捕获蛋白，在其他情况下采用mini-spin柱或titre plate formatted层析装置分离蛋白，经纯化或浓缩的蛋白质鉴定前要先行消化裂解，得到的肽片段分子经芯片阅读器检测后结果查阅肽指纹图谱数据库鉴定，要对蛋白进行准确鉴定和测序则应将芯片在高可靠性的Tandem-MS下阅读。(4)质谱仪配套软件直接鉴定蛋白质：包括质谱数据直接搜寻基因组数据库、蛋白质质谱鉴定软件和算法、人工神经网络(artificial neural network ANN)联合飞行质谱。6、新建出生缺陷病蛋白质组数据库或人工神经网络产前诊断模型：如果检测到相关数据库中所没有的出生缺陷病表达的差异蛋白质谱，可能为新发现的蛋白，需进一步经多个数据库鉴定，并与相对应的出生缺陷病及相关临床症状作对比分析后，记录结果，建立出生缺陷病蛋白质组数据库，作为产前诊断的新标准。或取大批量经临床确诊的出生缺陷病及正常孕妇的待检产前诊断标本，在相同的条件下进行实验检测，以相关软件筛选出出生缺陷病表达的特异蛋白质谱，建立新的出生缺陷病蛋白质组数据库或人工神经网络产前诊断模型用于产前诊断。

本发明涉及的其他生物信息软件和器材包括PBS-II表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)、能量吸收分子CHCA、H4型蛋白质芯片以及相应的基础分析软件ProteinChiD Software3.0、人工神经网络软件Matlab-NNTools、Ciphergen Software 3.1.1支持下建立的新数据库、All-in-one标准蛋白质芯片Cibcron blue3GA、BiomarkerWizard软件、Biomarker PatternsTM Software、Tandem-MS、白蛋白亲和树脂、HEPES缓冲盐、CHAPS缓冲盐等，上述器材可根据医学科技的发展以及具体实验的需要作出适当的更改。

本发明实现各类出生缺陷病蛋白质组学产前诊断方法的具体的实施方法是：取待作产前诊断孕妇的外周血液(可取孕妇的尿液、体液、羊水、死胎、胚胎组织、精子、卵子、受精卵等标本，但标本的处理方法不同)，以适当速度离心分离血清，-20℃冻存，实验时取出成批的冻存血清标本(可同时取若干份正常孕妇对照血清或质控血清标本在同等条件下检测)在冰浴中解冻后，以3000r/min离心5min，取10ul加入90ul 0.5％CHAPS(pH7.4)溶液中充分混匀10min。白蛋白亲和树脂Cibacron Blue3GA(Sigma公司)预先用0.5％CHAPS平衡3次，每次5min，将Cibacron Blue3GA与血清样本混和，在4℃摇床上振摇60min，12000r/min离心5min(4℃)，取上清溶液40ul，应用免疫散射比浊法测定处理后血清白蛋白的含量(以去除99％以上为标准)，H4芯片预先用20mmol/L HEPES(pH 7.4)平衡2次，每次5min，将去除白蛋白后的血清标本用20mmol/L HEPES稀释至200ul，加至96孔的Bioprocessor(Ciphergen)，振荡平台上振荡60min，甩去血清标本，20mmol/L HEPES 200ul清洗芯片3次，每次5min，再用去离子水清洗芯片2次，每次1min，干燥后加入0.5ul能量吸收分子(CHCA，Ciphergen公司)于已结合上蛋白质的H4芯片上级。干燥后再重复加1次CHCA。上机检测。数据收集和生物信息学处理：设定SELDI-TOF-MS的激光强度为150，灵敏度为6，收集数据的质荷比范围为1000～200000，收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次，在收集每次实验数据前用已知分子量的标准蛋白芯片校正仪器测定分子量，误差＜0.1％，以质控蛋白芯片做重复性检测，其峰值大小及其强度的变异系数(CV)均控制在0.05％和15％以下，具有很好的重复性。所有原始数据先用Proteinchip Software 3.0做校正(总离子强度及分子量的均一化)，对位于2000～20000的质荷比峰值，用Biomarker Wizard过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，第2次的噪音过滤值为2，以10％为最小阈值进行聚类，得到初步筛选结果后，对初步筛选出来的质荷比峰做怀出生缺陷儿(如21-三体症)孕妇与正常孕妇的成组数据的统计学分析，以寻找两组之间表达有差异的蛋白质，进一步将上述训练集数据初步分析结果利用反向传播算法通过Matlab-NNTools软件建立人工神经网络产前诊断模型，人工神经网络参数的设置：人工神经网络采用反向传播算法，用共轭梯度学习函数改进Trainscy函数，具体设置：共有4层，为输入、输出层和两个隐含层，每个隐含层有20个神经元。每一层都采用正切s形传递函数(tansig)，权重与偏值随机初始化，训练次数最大为1000次，最小下降梯度为1×10-6，输出神经元为1个，对应健康孕妇和怀出生缺陷儿(如21-三体症)孕妇的期望输出值分别设为-1和1(即输出值接近-1被判为怀健康儿孕妇，接近1则被判为怀出生缺陷儿孕妇)。

人工神经网络是国际上公认的较先进的计算机网络系统模拟生物神经智能化信息处理系统。本发明按上述方法建立起人工神经网络产前诊断模型后，对于同类同质的产前诊断标本，就可按上述方法对出生缺陷病的生物标志物即蛋白质谱进行高通量的自动化分析，分析仪及其软件分析系统会自动给出是否患出生缺陷病的报告以及是否终止妊娠等的提示，由于在不同的实验等条件下，蛋白质组值的分析结果会有所不同，所以各实验室在进行出生缺陷病蛋白质组分析时，因根据各自实验条件，按标准操作规范，统一操作步骤和方法，在相同的实验条下，从常见病开始，按病种用本发明介绍的蛋白质组学分析方法及人工神经网络产前诊断模型建立方法，建立系列的诊断模型，同时，本发明也可以不考虑具体的出生缺陷病病种，通过对比分析大量常见的、严重的几种出生缺陷病及正常人的蛋白质组学，得出一组特异的蛋白质谱，建立产前诊断标准，如果在被检的标本中出现这组蛋白质谱，就作出终止妊娠的诊断或患出生缺陷病高风险的预告，如临床上最常见、危害最严重的产前诊断类疾病是21-三体综合症和18-三体综合症，按本发明的方法进行大批量的蛋白质组学分析，并与正常对比，分析不同条件下所测得的蛋白质谱特点或蛋白质荷比(m/z)数值，作为21-三体症和18-三体症的诊断标准，在具体的产前诊断标本检测中，一旦出现这种蛋白质荷比峰或蛋白质谱，即作出21-三体症和18-三体症的诊断，或作出患病高风险的评估。

本发明在上述阐述的实施本发明的具体方法中，其本质是采用蛋白质组学分析方法分析产前诊断标本中蛋白质组的变化作出出生缺陷病的产前诊断，用同质同类的正常或已知出生缺陷病或人工制作或相关标准数据库中对应的标准蛋白质谱作为实验室质量控制，其所用的仪器、试剂以及实验条件等可因标本种类、疾病种类等不同而在一定的范围内变动，其中蛋白质组分析方法还可采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、液相色谱-电喷雾-串联质谱、肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术、串联质谱数据鉴定蛋白质技术以及蛋白质组相关数据库鉴定蛋白质谱；此外，还可采用荧光染料蛋白质组定量分析、质谱法蛋白质组定量分析和蛋白质芯片技术对出生缺陷病特异的蛋白质组作定量分析，作为产前诊断的指标。

Claims (1)

1. 一种蛋白质组的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分析标本的选择与处理：分析标本选用体液、分泌物、呼气成份、组织或细胞；其中细胞和组织标本先作裂解处理，其方法为温和裂解法或剧烈裂解法；

所述温和裂解法包括：

渗透裂解：用于组织培养细胞和血细胞，用低渗溶液悬浮细胞；

冻融裂解：用于组织培养细胞，用液氯迅速冷冻细胞，随后在37℃融化，反复几次；

去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜，裂解细胞，释放其内容物，用于组织培养细胞，用含去污剂的裂解液悬浮细胞；

酶裂解法：含有细胞壁的细胞，首先用酶消化细胞壁，酶在等渗溶液中处理细胞；

所述剧烈裂解法包括：

超声裂解：超声仪产生超声波，通过切应力裂解细胞；

弗氏压碎器裂解：在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞；

研磨法：用研钵或研杵研磨细胞，用于固体组织，研磨成粉状；

机械匀浆法：用于固体组织，将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，通过过滤或离心获得裂解液；

玻璃珠匀浆法：用于细胞悬液，通过剧烈振荡的玻璃珠打破细胞壁释放细胞内容物；

(2)蛋白质芯片的制作：

上样检测：裂解组织细胞的提取液经变性处理，用相应的结合缓冲液稀释后即可用于上样检测；

芯片的处理：用对应的结合缓冲液激活芯片，金属螯合芯片则需加入相关金属盐溶液使金属离子先结合在芯片表面后再激活；

上样后，样本与芯片充分结合反应，分别用结合缓冲液和去离子水洗去未结合的物质；

加入能量吸附分子微干后上机检测；

(3)芯片的阅读：

在Ciphergen Software 3.1.1支持下，建立一个新数据库和一个新项目；

使用All-in-one标准蛋白质芯片校正质谱仪；

放入芯片，设最高分子量50000Da和最佳检测范围2000-20000Da，选择最佳激光强度和最佳检测灵敏度及数据收集方法和数据收集参数；

建立两个点阅读程序，进行芯片阅读和数据收集；

(4)资料分析：对收集的数据和谱图资料在Biomarker Wizard软件支持下首先进行基线干扰消减和噪音过滤，设置初始的噪音过滤值为5，允许分子量偏差为0.5％，以10％为最小阈值，然后再作第二次的噪音过滤值为2来增加较小丰度的峰值：统一标准化处理后的资料蛋白分子质量精确度校正和自动波峰检测，分子量相同的信号被综合聚类，结果输出到EXCEL表中；

初步筛选的结果，做同一质荷比处的蛋白峰相对强度组间平均数比较t检验，按照P值的大小确定在不同组别样本中上调或下调的质荷比蛋白质；

(5)蛋白质组的鉴定：

对被分析的蛋白质谱，分析软件结合国际上建立的数据库检索作出鉴定，

鉴定蛋白质的方法及其软件包括：

①肽质量指纹图谱鉴定蛋白质：蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质是专一而特异的，称肽质量指纹图谱，将实验所得肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论肽质量指纹图谱比对，所用数据库软件名称为：Mascot、Profound、PeptIdent、Proteinprospector、PepSea；

②一级质谱结合串联质谱肽鉴定蛋白质：根据一级质谱测得精确分子质量和串联质谱所得序列信息，通过蛋白质数据库检索鉴定蛋白质，所用数据序软件为SEQUEST、Mascot、PepFrag；

鉴定蛋白质的数据库包括：

①蛋白质数据库：SWISS-PROT/TrEMBL、Protein informationResource、NCBInr、dbEST、OWL、UniGene；

②蛋白质组数据库：Aaindex.GELBANK.Predictome.profeome AnalysisDatabase、REBASE；

③蛋白质序列数据库：Blocks、CDD、cluSTr、INterPro、Pfam、PROSITE；

④其他蛋白质序列数据库：EMOTIF、PRINTS、lPROClASSO-GLYCBASE、PIR-ALN、Proclass、ProDom、ProtoMaP、SBASE、SMART、suPFAM、sysTERSE、GeneNest、spliceNest；

⑤蛋白质三维结构相关数据库：PDB、MMDB；

⑥在线蛋白工具软件名：MCB search、lanncher、DAS、Topred2、SOSUI、PSIpred-MEM-SAT2、HMMTOP、SOSUI、CoPreThi、PSIpred-MEM-SAT2、HMMTOP、TMHMM、The predictProtein Server、SMART、SPLIT、PRED-TMR、TMAP、multalin、Protein Sequence Analysls、PSA、PRS、AAA；

蛋白质的其他鉴定方法包括：纯化或浓缩标本以备鉴定，在蛋白质具有明显的理化性质或样本成分相对简单时直接从芯片表面获得蛋白，或选择抗体与预先已活化的芯片表面结合选择性捕获蛋白，在其他情况下采用mini-spin柱或titre plate formatted层析装置分离蛋白，经纯化或浓缩的蛋白质鉴定前先消化裂解，得到的肽片段分子经芯片阅读器检测后结果查阅肽指纹图谱数据库鉴定，对蛋白进行准确鉴定和测序应将芯片在高可靠性的Tandem-MS下阅读；

质谱仪配套软件直接鉴定蛋白质方法包括：

质谱数据直接搜寻基因组数据库、蛋白质质谱鉴定软件和算法、人工神经网络联合飞行质谱。