CN100410252C - 可用于抑制g蛋白功能的三环酰胺代谢物及治疗增生性疾病的方法 - Google Patents

可用于抑制g蛋白功能的三环酰胺代谢物及治疗增生性疾病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及结构式(I)代表的三环酰胺化合物的代谢物和结构上相关的化合物，以及式(I)化合物的可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯，其中：R1是选自H和＝O；R2至R5可以相同或不同，各自独立地选自H、-OH、卤素、-NH2和＝O；实-虚组合线独立地代表单键或双键，其中代表双键的实-虚组合线的数目不超过2，而且当为2时，这些双键不相邻，当为0时，R1至R5中之一不是H。还公开了使用这种新颖化合物治疗增生性疾病的方法和抑制细胞异常生长及抑制法尼基蛋白酶的方法。

Description

可用于抑制G蛋白功能的三环酰胺代谢物及治疗增生性疾病的方法
发明背景
技术领域
本发明的一些实施方案涉及可用于抑制G蛋白功能的三环酰胺代谢物，以及治疗增生性疾病的相关化合物和方法。
在PCT国际出版物No.WO 95/00497和WO 95/10516中描述了大鼠肉瘤(“Ras”)癌基因的生物意义和Ras及称为法尼基蛋白转移酶(“FPT”)的酶在正常细胞转化成癌细胞中的作用。这些出版物还都描述了一类特殊的化合物，它们抑制法尼基蛋白转移酶的活性，从而抑制Ras蛋白的法尼基化。
在全文引用在本申请中作为参考的美国专利5,874,442中，公开了可用于抑制法尼基蛋白转移酶的多种三环酰胺化合物。在这些化合物中下列的一种在本发明中称作“化合物A”：
Figure C20048001751800051
化合物A在抑制法尼基蛋白转移酶方面特别有用。如美国专利5,874,442中所述，服用有效数量的此种化合物提供了一种抑制细胞(包括转化细胞)的异常生长和治疗癌症的方法。
发明概要
在一些实施方案中，本发明涉及结构式(I)代表的化合物：
Figure C20048001751800061
及式(I)化合物的可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯，其中
R1是选自H和＝O；
R2-R5可以相同或不同，各自独立地选自H、-OH、卤素、-NH2和＝O；
各实-虚组合线独立地代表单键或双键，其中代表双键的实-虚组合线数目不超过2，而且当是2时，这些双键不相邻，而当是0时，R1至R5中有一个不是H。
在一些实施方案中，本发明涉及结构式(I)代表的化合物，其中R1、R2、R3和R5均为H，R4选自H和-OH，代表双键的实-虚组合线不超过1。
在一些实施方案中，本发明涉及以下结构式代表的化合物
Figure C20048001751800071
及其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。在进一步的实施方案中，本发明涉及一种纯的分离形式的以上化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及以下结构式代表的化合物
Figure C20048001751800072
及其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。在进一步的实施方案中，本发明涉及一种纯的分离形式的以上化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及以下结构式代表的化合物
Figure C20048001751800081
及其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。在进一步的实施方案中，本发明涉及一种纯的分离形式的以上化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及以下结构式代表的化合物
Figure C20048001751800082
及其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。在进一步的实施方案中，本发明涉及一种纯的分离形式的以上化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及一种对于有需要的患者抑制法尼基蛋白转移酶的方法，包括施用治疗有效量的至少一种式(I)化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及一种对于有需要的患者治疗胰腺癌、非小细胞肺癌、骨髓性白血病、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合症、表皮癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌的方法，包括施用治疗有效量的至少一种式(I)化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其中含有和一种可药用的载体组合的治疗有效量的至少一种式(I)化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及纯的分离形式的式(I)化合物。
发明详述
在某些实施方案中，本发明涉及化合物A的代谢物，它能够：(1)在体外试验中，有效地抑制法尼基蛋白转移酶，但不抑制牻牛儿牻牛儿基蛋白转移酶I；(2)阻断由作为法尼基受体的一种形式的转化Ras引发的表型变化，但不阻断由人工改造成牻牛儿牻牛儿基受体的一种形式的转化Ras引发的表型变化；(3)阻断作为法尼基受体的Ras的胞内加工，但不阻断人工改造成牻牛儿牻牛儿基受体的Ras的胞内加工；和/或(4)阻断培养物内由转化Ras诱发的异常细胞生长。以下四种化合物(标记为化合物8-11)是化合物A的代谢物：
Figure C20048001751800091
化合物A已显示出在动物模型中具有抗肿瘤活性，因此其代谢物具有相应的用途。
本发明还涉及结构上与化合物A的代谢物相似的化合物，据信它们有相应的用途。这种结构上相关的化合物由结构式(I)表示：
Figure C20048001751800101
其中：
R1是选自H和＝O；
R2至R5可以相同或不同，各自独立地选自H、-OH、卤原子、-NH2和＝O；
各实-虚组合线独立地代表单键或双键，其中代表双键的实-虚组合线的数目不超过2，而且当为2时，这些双键不相邻；当为0时，R1至R5中有一个不是H。
本发明包括非晶态的或晶态的以上化合物。
本发明提供了一种方法，通过向需要治疗的哺乳动物(例如人)施用治疗有效量的至少一种式(I)化合物，抑制细胞(包括转化细胞)的异常生长。细胞的异常生长是指与正常的调节机制无关的细胞生长(例如失去接触抑制)。这包括以下的异常生长：(1)表达活化的Ras癌基因的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其中Ras蛋白由于在另一基因中的致癌突变而被活化的肿瘤细胞；和(3)其中发生异常Ras活化的其它增生性疾病的良性和恶性细胞。
本发明还提供了一种方法，通过向需要治疗的哺乳动物(例如人)施用治疗有效量的至少一种式(1)化合物，抑制肿瘤的生长。特别是，本发明提供了通过施用有效数量的一种上述代谢物抑制表达活化Ras癌基因的肿瘤生长的方法。可以被抑制的肿瘤的实例包括但不限于：肺癌(例如肺腺癌和非小细胞肺癌)，胰腺癌(例如胰腺癌，如外分泌胰腺癌)，结肠癌(例如结肠直肠癌，如结肠腺癌和结肠腺瘤)，骨髓性白血病(例如急性髓细胞性白血病(AML))，甲状腺滤泡癌，骨髓增生异常综合症(MDS)，膀胱癌，表皮癌，乳腺癌和前列腺癌。
本发明还提供了一种抑制良性和恶性的增生性疾病的方法，所述疾病中Ras蛋白由于其它基因中的致癌突变而被活化，即，Ras基因本身不被突变活化成致癌形式，该抑制作用是通过向需要治疗的哺乳动物(例如人)施用治疗有效量的至少一种式(I)化合物来实现的。例如，良性增殖失调神经纤维瘤病或其中Ras由于酪氨酸激酶癌基因(例如neu，src，abl，lck和fyn)的突变或超量表达而被活化的肿瘤，可以被本发明的代谢物抑制。
本发明的代谢物抑制法尼基蛋白转移酶和癌基因蛋白Ras的法尼基化。本发明还提供了一种方法，通过施用有效数量的至少一种式(I)化合物，对需要治疗的哺乳动物，尤其是人，抑制Ras法尼基蛋白转移酶。向患者施用至少一种式(I)化合物以抑制法尼基蛋白转移酶可用于治疗上述癌症。
可用于本发明方法中的化合物抑制细胞的异常生长。不希望受理论的约束，相信这些化合物可以通过阻断G-蛋白异戊二烯化，抑制G蛋白功能，例如Ras p21，从而可用于治疗增生性疾病，例如肿瘤生长和癌症。不希望受理论的约束，相信这些化合物抑制Ras法尼基蛋白转移酶，因此显示出对抗Ras转化细胞的抗增生活性。
另外，式(I)化合物可以用在涉及抑制法尼基蛋白转移酶的其它治疗方法中。在美国临时专利申请60/498,509中公开了可以通过施用抑制法尼基蛋白转移酶的化合物治疗的其它症状和疾病，该项申请在本文中全文引用作为参考。
式(I)化合物的盐也在本发明的范围之内。本文中提到的式(I)化合物，除非另外说明，应理解为包括其盐。这里所用的术语“盐”，代表与无机和/或有机酸形成的酸式盐，以及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。此外，当式(I)化合物既含有碱性部分(例如但不限于吡啶或咪唑)，又含有酸性部分(例如但不限于羧酸)时，可以形成两性离子(“内盐”)，并被包括在这里所用的术语“盐”之内。可药用的盐(即，无毒的，生理上可接受的)是优选的，但其它的盐也可以使用。式(I)化合物的盐可以通过式(I)化合物与一定量(例如等当量)的酸或碱在介质中，例如在盐于其中沉淀的介质中反应形成，或者在水基介质中反应随后冷冻干燥。在本发明范围内的成盐的酸包括盐酸、硫酸、氢溴酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、柠檬酸、磷酸、乙酸、双羟萘酸/扑酸、氢碘酸、硝酸、乳酸、甲基硫酸和富马酸。在本发明范围内的成盐的碱包括钠、钙、钾、镁、甲基葡胺、铵、铝、锌、哌嗪、氨丁三醇、锂、胆碱、二乙胺、4-苯基环己胺和N，N’-二苄基-1，2-乙二胺。
本发明化合物(包括该化合物的盐、溶剂化物、酯和前药，以及该前药的盐、溶剂化物和酯)的所有异构体(例如几何异构体、旋光异构体等)，例如由于各种取代基上的不对称碳原子而可能存在的异构体，包括对映体形式(即使不存在不对称碳原子也可以存在)，旋转异构形式，阻转异构体和非对映异构形式，都被考虑在本发明的范围之内。本发明化合物的各个异构体可以是例如基本上不含其它异构体，或者可以混合成外消旋物，或与所有其它的或选择的其它立体异构体混合。本发明化合物的手性中心可以像IUPAC 1974建议中定义的具有S或R构型。术语“盐”、“溶剂化物”、“前药”等的使用同样适用于本发明化合物的对映异构体、立体异构物、旋转异构体、互变异构体、外消旋物或前药的盐、溶剂化物和前药。
还应该指出，在正文、示意图、实施例和表格中的带有不饱和价的任何碳及杂原子都假设有足够数目的氢原子使价数得到饱和。
如以上和整篇说明书中所使用的，除非另有说明，以下术语应理解为具有下述含义：
“患者”包括人和动物。
“哺乳动物”是指人和其它哺乳动物。
“卤素”指氟、氯、溴或碘。“卤”或“卤化根”指氟、氯、溴或碘基团。
本发明化合物的前药和溶剂化物也在本发明考虑之内。这里所用的“前药”一词，代表一种药物前体，它在施用给对象后，通过代谢或化学过程发生化学转化，产生式(I)化合物或其盐和/或溶剂化物。在T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems，A.C.S.Symposium Series 14(1987)和Bioreversible Carriers in Drug Design，Edward B.Roche编，American Pharmaceutical Association andPergamon Press(1987)中有关于前药的讨论，这两份文献都并入本申请作为参考。
“溶剂化物”是指本发明化合物与一个或多个溶剂分子的物理缔合物。这种物理缔合涉及不同程度的离子键合和共价键合，包括形成氢键。在某些情形，溶剂化物能够分离，例如在一个或多个溶剂分子被结合在晶态固体的晶格中的情形。“溶剂化物”包括溶液相的和可分离的溶剂化物。合适的溶剂化物的非限制性实例包括乙醇化物、甲醇化物等。“水合物”是其中的溶剂分子为H2O的溶剂化物。
“有效量”或“治疗有效量”是用来描述能有效抑制法尼基蛋白转移酶并因此产生所希望的治疗效果的一定数量的本发明化合物或组合物。
对于一种化合物，术语“分离的”或“分离的形式”是指该化合物在从合成过程或天然来源或其组合中分离出之后的物理状态。对于一种化合物，术语“纯化的”或“纯化形式”是指该化合物在由纯化方法或本文所述方法或专业技术人员熟知的方法得到之后的物理状态，它具有可用本文所述的或专业技术人员熟知的标准分析技术鉴定的足够高的纯度。
关于化合物中各部分(例如取代基、基团或环)的数目，除非另外限定，短语“不超过2”是指0、1或2。短语“不超过1”是指0或1。
上面的说法例如“R2至R5可以相同或不同，各自独立地选自H、-OH、卤素、-NH2和＝O”，意味着所提到的各取代基(即R2、R3、R4和R5)的选择与基团中任何其它取代基的选择无关。例如，选择R2为H与同一分子中R3的选择无关，R3可以是-OH。
以下的溶剂和试剂在本文中用缩写表示：四氢呋喃(THF)；乙醇(EtOH)；甲醇(MeOH)；乙酸(HOAc或AcOH)；乙酸乙酯(EtOAc)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；三氟乙酸(TFA)；三氟乙酸酐(TFAA)；1-羟基苯并三唑(HOBT)；间氯过苯甲酸(MCPBA)；三乙胺(Et3N)；乙醚(Et2O)；氯甲酸乙酯(ClCO2Et)；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(DEC)；二异丁基氢化铝(DIBAL)；异丙醇(iPrOH)；二甲基亚砜(DMSO)；十二烷基硫酸钠(SDS)；三氯乙酸(TCA)；二硫苏糖醇(DTT)；三(羟甲基)氨基甲烷(tris)；和乙二胺四乙酸(EDTA)。
除非另外指出，本文中提到的物理参数的所有定量量度，例如温度、质量、体积、浓度、均应理解成包括偏离所述量的合理的变化范围。
本发明化合物可以用下述步骤制备。
实施例1-化合物8和9的制备
步骤1：
Figure C20048001751800141
按照Labouta等的步骤(Labouta，A.M.et al.，Eur.J.Med.Chem.-Chem.Therm.，Vol.17，No.6，pp.531-535，(1982))，将4-哌啶酮水合物盐酸盐1(20.0g，130mmol)溶于水(100mL)，在0℃下依次加入三乙胺(58mL，417mmol，3.2当量)和二碳酸二叔丁酯(39.8g，182mmol，1.4当量)在THF(100mL)中的溶液。将该溶液搅拌过夜(0℃→室温)。然后将反应混合物减压浓缩，残余物用硅胶色谱法纯化(10∶1己烷/乙酸乙酯)，得到24.0g(93％)4-哌啶酮-1-羧酸叔丁酯(076483-141-26；CAS 79099-07-3)，即化合物2，为无色油状物。产物中残留少量的二碳酸二叔丁酯(根据1H NMR)，但该物的纯度适合下一步骤。
步骤2：
Figure C20048001751800142
还按照Labouta等的步骤，在0℃下向NaH(矿物油中的60％分散体，未洗，2.38g，59.6mmol，1.2当量)在无水1，2-二甲氧基乙烷(150mL)中的悬浮液加入二乙基膦酰乙酸叔丁酯(15.0g，59.6mmol，1.2当量)在无水1，2-二甲氧基乙烷(50mL)中的溶液。搅拌化合物2半小时后，在0℃下向该混合物中逐滴加入在无水1，2-二甲氧基乙烷(20mL)中的4-哌啶酮-1-羧酸叔丁酯(9.9g，49.7mmol)，然后搅拌过夜(O℃→室温)。用NaHCO3(100mL，饱和水溶液)猝灭反应，分离各层。水相用CH2Cl2(3×20mL)萃取，合并的有机相用MgSO4干燥，过滤，然后减压浓缩。残余物用硅胶色谱法(95∶5的己烷∶乙酸乙酯)纯化，得到10.2g(69％)1-叔丁氧羰基哌啶-4-亚基乙酸叔丁酯(076483-143-32；CAS 84839-55-4)，化合物3，为无色油状物。
步骤3：
Figure C20048001751800151
将1-叔丁氧羰基哌啶-4-亚基乙酸叔丁酯(化合物3，10.2g，34.2mmol)溶在叔丁醇钠(1.6g，0.5当量)的无水叔丁醇(150mL)溶液中。在100℃下平衡0.5小时，然后在室温下过夜。加入NH4Cl(饱和水溶液)至pH＝7，将该溶液依次用己烷(2×20mL)和CH2Cl2(4×20mL)萃取。合并的有机相用MgSO4干燥，过滤，然后减压浓缩。残余物是化合物4(1-叔丁氧羰基哌啶-4-亚基乙酸)和化合物5(1-叔丁氧羰基-1，2，5，6-四氢吡啶乙酸，076483-149-30)的混合物，将其不经纯化用于下一步骤。
将该残余物溶在CH2Cl2(20mL)中，在0℃下逐滴加入HCl在1，4-二噁烷(4.0M，17mL，68mmol，2.O当量)中的溶液。将反应混合物搅拌1小时(0℃→室温)，然后将样品减压浓缩，不作进一步纯化直接用于下一步骤。
然后将该残余物溶在3∶1的MeOH-H2O(150mL)中，用NaOH(1.0N水溶液)将该溶液调节至pH＝10。随后加入二碳酸二叔丁酯(11.2g，51.4mmol，1.5当量)，反应混合物在室温下搅拌过夜。将该样品减压浓缩，加水(50mL)，加柠檬酸(5％水溶液)至pH＝3。产物用乙醚萃取(3×50mL)，合并的有机相用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到2.6g(三个步骤共32％)产物，为α，β-和β，γ-不饱和酸的1∶1混合物。该物质用于下一步骤，不作进一步纯化。
步骤4：
Figure C20048001751800161
将(+)-4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶-11(R)-基)哌啶(3.8g，8.1mmol)、化合物4(1-叔丁氧羰基哌啶-4-亚基乙酸)和化合物5(1-叔丁氧羰基-1，2，5，6-四氢吡啶乙酸)的1∶1混合物(2.61g，10.8mmol，1.3当量)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC，2.69g，14.1mmol，1.7当量)和3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT，2.29g，1.7当量)溶于DMF(100mL)中。加入N-甲基吗啉(9.5mL，8.8g，87mmol，10.7当量)，将该混合物在室温下搅拌50小时。加入NaHCO3(50mL，饱和水溶液)，接着加乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)。水相用乙酸乙酯(6×30mL)萃取。合并的有机相用MgSO4干燥，过滤和减压浓缩。残余物用硅胶色谱法纯化(75∶25的己烷∶乙酸乙酯→25∶75的己烷∶乙酸乙酯)，得到3.66g(65％)偶合产物，为灰白色泡沫状固体。该物质作为α，β-和β，γ-不饱和酰胺，即化合物6((+)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶-11(R)-基)-1-哌啶基]-2-氧代亚乙基]-1-哌啶羧酸叔丁基)和化合物7((+)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶-11(R)-基)-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-3，4-二脱氢-1-哌啶羧酸叔丁酯(076483-151-29))的9∶1混合物进行下一步骤。Mp＝112-125℃。
步骤5：
Figure C20048001751800171
将化合物6((+)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶-11(R)-基)-1-哌啶基]-2-氧代亚乙基]-1-哌啶羧酸叔丁基)和化合物7((+)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶-11(R)-基)-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-3，4-二脱氢-1-哌啶羧酸叔丁酯)的9∶1混合物溶于CH2Cl2(20mL)中，在0℃下逐滴加入HCl在1，4-二噁烷(4.0M，4.6mL，18.4mmol，4.0当量)中的溶液。将混合物搅拌1小时(0℃→室温)，然后减压浓缩，用于下一步骤前不作进一步纯化。
将该物质溶在CH2Cl2(25mL)中，加入Et3N(2.6mL，18.4mmol，4.0当量)。室温下向该溶液逐滴加入三甲基甲硅烷基异氰酸酯(2.1g，18.4mmol，4.0当量)，将反应混合物搅拌1小时，然后减压浓缩，得到白色固体。残余物用制备型TLC(85∶15的CH2Cl2∶MeOH)纯化，得到900mg(31％)β，γ-不饱和酰胺(+)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯[1，2-b]吡啶-11(R)-基)-1-哌啶基]-2-氧代亚乙基]-1-哌啶甲酰胺，即化合物9(078017-013-22，主异构体)，为灰白色泡沫状固体，和122mg(4.2％)α，β-不饱和酰胺，(+)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并[5，6]环庚三烯[1，2-b]吡啶-11(R)-基)-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-3，4-二脱氢-1-哌啶甲酰胺，即化合物8(078017-015-33，次要异构体)，为黄色固体。Mp(化合物9，主异构体)＝157-162℃；Mp(化合物8，次异构体)＝167-171℃。HRMS(主异构体化合物9与次异构体化合物8的7.4∶1混合物)m/z＝637.0404。
用来制备化合物10和11的培养
具有化合物10和11的结构的化合物A代谢物按照以下实施例2-6中所述的步骤制备
Figure C20048001751800181
实施例2
在装有2mL Waymouth培养基、2.54μg(2μM)或63.8μg(50μM)化合物A(～20μCi/mg)和2×106细胞的25mL锥形瓶中，于95∶5(v/v)的氧∶二氧化碳气氛下，进行化合物A与得自小鼠、大鼠、猴子和人的肝细胞的体外培养。将锥形瓶用橡皮塞封住以保持气体成分，放在37℃水浴中。在温和的摇动下培养5小时。利用快速冷却(-80℃)终止反应。将热灭活的肝细胞平行地与化合物A一起培养作为对照。
实施例3
使用得自非诱导型动物的大鼠肝微粒体进行化合物A代谢物的放大生产。将微粒体在含有1nmol P450/mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中培养。该培养混合物中还含有10mM MgCl2，5mM葡糖-6-磷酸，1.5单位/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶，0.5mM β-NADP(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和25μM化合物A(～20μCi/mg)。在四只烧瓶中进行培养，每只装有49.4mL的以上混合物，并在不加NADP的情况下于37℃预培养2分钟。加入NADP引发反应，培养2小时，通过将混合物在冰水中冷却终止反应。然后对合并的培养混合物进行固相萃取(SPE)，将混合物以等分的体积直接施加在10只固相柱(tC18，10g吸收剂)上。这些柱子预先用甲醇和水洗过。用总体积670mL的甲醇(每只柱子约70mL)洗脱出药物衍生的物质。然后将洗脱物在TuboVap LV工作站中于37℃和氮气流下蒸发，并将萃取残留物在甲醇中重组，用于随后的HPLC分离。
实施例4
在有25μM化合物A和1nmol/mL CYP 450的情况下，将人肝微粒体于产生NADPH体系(5mM葡糖-6-磷酸，1.5单位/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶，0.5mM β-NADP)和3mM氯化镁存在下，进行体外培养30分钟。煮沸的微粒体在同一条件下培养作为对照。培养30分钟后，将样品放在冰上进行固相萃取。将甲醇洗脱物分成三组，一组样品用HPLC分析，另两组样品用LC/MS和NMR分析。然后，用乙腈代替甲醇以避免化合物10或11与甲醇之间的化学反应。
NMR分析的结果证实化合物在悬垂的哌啶环中有一个双键。在用大鼠肝微粒体大规模培养后用NMR完全鉴别出化合物10的结构。
实施例5
用人
Figure C20048001751800191
在3mM氯化镁和一个NADPH产生体系存在下与25μM化合物A和0.2nmol/mL CYP450一起体外培养30分钟。对照的昆虫微粒体在相同条件下培养作为对照。培养30分钟后，将样品放在冰上进行固相萃取。将甲醇洗脱物分成两组，一组样品用HPLC分析，另一组用LC/MS分析。
LC/MS分析结果表明代谢物化合物11(RT～51.9分)和代谢物化合物10(RT～61.6)的m/z分别是653和635。
实施例6
重组的人CYP3A4酶(得自Gentest和SPRI)用恒定数量的细胞色素P450(“CYP”)(0.2nmol/mL)和25μM化合物A分别培养。培养是在60mL磷酸钾缓冲液(0.05M，pH 7.4)中在37℃于空气中和3mM氯化镁及一种NADPH产生体系存在下进行30分钟。通过加入药物引发反应，将培养样品在冰和水的混合物中冷却以终止反应，并立即进行固相萃取(用乙腈洗脱)。将各样品分别蒸发至干，用质谱法(LC/MS和LC/MS/MS)和NMR分析。
使用适当的起始物和上述及本领域已知的其它步骤，可以制备其它的式(I)化合物。
化合物分离
进行以下的分离和纯化，它们是适用于本发明化合物的各类分离和纯化方法的示例说明。以下的分离方法是可以用来分离本发明化合物的分离方法的非限制性实例。本领域技术人员已知的其它分离方法同样可用于分离本发明的化合物。
化合物10的分离
将用大鼠肝微粒体放大生产得到的代谢物在固相萃取(SPE)后浓缩，并用HPLC法分离。将HPLC梯度洗脱法如以下表1中所示地最优化。流动相由用乙酸调节至pH 6.0的20mM乙酸铵和乙腈组成。流速设定为1.0mL/分，柱温保持在40℃。洗脱液在278nm下监测。
表1
  时间(分)   ％20mM乙酸铵(pH 6)   ％乙腈
  052450   65655151   35354949
根据在278nm处的UV吸收，人工收集39.2-41.2分钟的化合物10的HPLC洗脱峰。化合物10级分用LC-MS检测，其中分子离子以(M-2)形式被检测。将柱的收集液合并构成用于分析的NMR样品。
代谢物化合物10的NMR分析
化合物A和化合物10的质子归属列在表2中。大多数的共振归属保持母体化合物A的不变，但在4.73和6.71ppm处观察到两个新的共振。在质子-质子相关谱中观察到它们的交叉峰。这两个共振被归属为在H-19’和H-20’位置处的烯型质子。在H-18、H-19和H-20处的质子由于C-19’和C-20’间形成双键而向低场移动。
表2
Figure C20048001751800211
a-质子位置标记在下面列出的结构式上。
b-无数据。
Figure C20048001751800221
化合物11的分离
将用得自BD Gentest(1E)的重组CYP3A4酶放大培养得到的代谢物化合物11用SPE洗脱，并用HPLC分离。流动相含有用乙酸调节至pH 6.0的20mM乙酸铵和乙腈。HPLC梯度洗脱法示于表3，使用一只Luna苯基己基半制备型柱(5μm，250×10mm内径，Phenomenex，Inc.，Torrance，CA)。流速设定为4.0mL/分，柱温为室温。根据其在278nm处的UV吸收收集代谢物级分。将各级分合并构成一个在DMSO-d6中的NMR样品用于在25℃的NMR数据收集。
表3
  时间(分)   ％20mM乙酸铵(pH 6)   ％乙腈
  0102030505260   656554515155   35354649499595
化合物11的NMR分析
化合物A和化合物11的质子NMR归属列在下表中。化合物11的大多数共振归属保持化合物A的不变，但在5.54ppm处出现新的质子共振。在质子-质子相关谱中观察到此共振与H-19和H-19’的交叉峰。其碳化学位移发现为72.7ppm，与在C-20’处仲醇的形成相一致。因此，化合物11被指认为以下结构，在化合物A的悬垂的哌啶环上H-20’处的一个质子被羟基取代。
表4
Figure C20048001751800251
试验
在(H-Ras)法尼基转移酶抑制试验中的活性
为了检验化合物10和化合物11的药理活性，将化合物A与高水平重组表达在大肠杆菌中的人CYP3A4和人氧化还原酶在30升的发酵罐中培养。化合物A以1升的规模和15-20％的总产率转化成化合物11和化合物10。在固相树脂吸附后将代谢物分离并利用HPLC纯化。两种代谢物的身份均经LC-MS/MS证实。为进行生物活性评价共提供4.45mg化合物10和2.2mg化合物11。
该代谢物用LC-MS(在药理试验采用的条件下)检验。发现化合物11混合物含～75％纯化合物11和～25％纯化合物10。化合物10混合物含～5％纯化合物11和～95％纯化合物10。
所有以上化合物在(H-Ras)法尼基转移酶抑制试验中显示出以下的IC50活性：
化合物            82.6nM
化合物            923.3nM
化合物11(混合物)  22.5nM
化合物10(混合物)  4.1nM
化合物A(对照)     2.4nM
(H-Ras)FPT的试验条件
通过测定[3H]法尼基由[3H]磷酸法尼酯向衍生自H-Ras的C末端的生物素化的肽(生物素-CVLS)的转移，确定FPT活性。反应混合物在总体积100μL中含有50mM Tris pH 7.7，5mM MgCl2，5mM Zn++，5mM DTT，0.1％Triton-X，0.05μM肽，0.03nM纯化的人法尼基蛋白转移酶，0.180μM[3H]焦磷酸法尼酯，加上所示浓度的三环化合物或载体对照物。将反应混合物在一台Vortemp摇荡式培养箱中于37℃和45RPM下培养60分钟，用含有0.5％BSA和1.3mg/mL链霉抗生物素蛋白SPA珠的150μL 0.25M EDTA停止培养。在一台Wallach1450Microbeta液体闪烁计数器中测定放射性。相对于载体对照样计算出抑制百分数。
药物制剂
为了从本发明所述的化合物制备药物制剂，惰性的可药用载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、可分散粒剂、胶囊剂、糯米纸囊剂和栓剂。粉剂和片剂可以含约5-70％的活性成分。合适的固体载体是本领域已知的，例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖和乳糖。片剂、粉剂、糯米纸囊剂和胶囊剂可以作为适合口服的固体剂型使用。
为制备栓剂，首先将一种低熔点的蜡例如脂肪酸甘油酯混合物或可可脂熔化，利用搅拌将活性成分均匀地分散于其中。然后将该熔融的均匀混合物倒入尺寸合适的模具中，令其冷却和固化。
液体形式的制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。可以使用水或水-丙二醇溶液用于非肠道注射。
液体形式制剂还可以包括用于鼻内给药的溶液。
适合吸入的气溶胶制剂可以包括溶液和粉末形式的固体，它可以与可药用的载体，例如惰性压缩气体，组合使用。
还包括这样的固体形式制剂，它们准备在使用前不久转化成液体形式制剂，用于口服或非肠道给药。这些液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。
本发明化合物还可以透皮释放。透皮组合物可以采取乳膏、洗剂、气溶胶和/或乳状液的形式，并可包含在基质型或贮库型的透皮贴剂中，象本领域为此用途的常规作法一样。
优选将化合物口服给药。
药物制剂优选是单位剂量形式。在这种形式中，制剂被再分成含适量活性组分(例如为实现预期目的的有效数量)的单位剂量。
单位剂量制剂中活性化合物的数量，根据具体的用途，可以变化或调节成从约0.1mg至1000mg，更优选从约1mg至300mg。
实际使用的剂量可根据患者的需要和所治疗的病症的严重程度而变。根据具体情况决定合适的剂量属于本领域的技能之内。通常，用小于化合物最佳剂量的较小剂量开始治疗。然后以小的增量加大剂量，直至达到该条件下的最佳效果。为方便起见，可以将总日剂量等分，如果需要，在一天内分批服用。
本发明化合物及其可药用盐的服用量和服用频率，将根据责任医生考虑诸如患者的年龄、状况和身材以及所治疗的症状的严重性作出的判断进行调节。一个典型的推荐用药方案是每天口服10-2000mg，优选10-1000mg，分2-4次给药，以阻断肿瘤生长。化合物在此剂量范围内服用是无毒的。
以下是含有本发明化合物的药物剂型的实例。本发明在其药物组合物方面的范围不受所提供的实例的限制。
药物剂型实例
表5实例A片剂
Figure C20048001751800271
制造方法
将第1项与第2项在合适的混合器中混合10-15分钟。用第3项成分使混合物成粒。研磨该湿颗粒，必要时过粗筛(例如1/4”，0.63cm)。将湿粒干燥，必要时将干燥的颗粒过筛并与第4项成分混合10-15分钟。加入第5项成分并混合1-3分钟。将混合物在合适的压片机上压制成合适的尺寸和重量。
表6实例B胶囊剂
Figure C20048001751800281
制造方法
将第1、2和3项成分在合适的掺混机中混合10-15分钟。加入第4项成分并混合1-3分钟。将该混合物在合适的封装机械上装入合适的拼合式硬明胶胶囊中。
在美国临时专利申请60/498,509中公开了抑制法尼基蛋白转移酶的化合物与其它化合物(包括抗癌药物)的另一些制剂和组合物，以及使用这些制剂和/或组合物的治疗方法，该申请全文并入本发明中。
本发明已联系上述的具体实施方案作了描述，但对于本领域的普通技术人员，很多替代物、修改和变动将是显而易见的。所有这些替代物、修改和变动都打算归属于本发明的精神和范围之内。

Claims (9)

1. 一种结构式(I)代表的化合物
Figure C2004800175180002C1
或式(I)化合物的可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯，其中：
R1选自H和＝O；
R2至R5相同或不同，各自独立地选自H、-OH、卤素、-NH2和＝O；
实-虚组合线独立地代表单键或双键，其中代表双键的实-虚组合线的数目不超过2，而且当为2时，这些双键不相邻，而当为0时，R1至R5中有一个不是H。
2. 权利要求1的化合物，其中R1、R2、R3和R5均为H，R4选自H和-OH，代表双键的实-虚组合线的数目不超过1。
3. 以下结构式代表的权利要求1化合物
Figure C2004800175180002C2
或其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。
4. 以下结构式代表的权利要求1化合物
Figure C2004800175180003C1
或其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。
5. 以下结构式代表的权利要求1化合物
Figure C2004800175180003C2
或其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。
6. 以下结构式代表的权利要求1化合物
Figure C2004800175180003C3
或其可药用的异构体、盐、溶剂化物或酯。
7. 权利要求1的化合物用于制备抑制法尼基蛋白转移酶的药物的用途。
8. 权利要求1的化合物用于制备治疗胰腺癌、非小细胞肺癌、骨髓性白血病、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合症、表皮癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌的药物的用途。
9. 一种药物组合物，其中含有与可药用载体组合的治疗有效量的权利要求1化合物。
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