CN100376598C - 犬静脉注射白蛋白、其制备方法以及犬静脉注射白蛋白制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及犬静脉注射白蛋白、其制备方法及其制剂，主要是用来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺法分离、制备得到的pH值在6.4～7.4，纯度不低于95%的可用于犬静脉注射的犬血白蛋白，以及用该白蛋白加入适量稳定剂后制成可静脉注射的蛋白含量为1～25%的白蛋白注射液或配制成3～10%葡萄糖溶液或3～5%葡萄糖盐水的蛋白含量为1～25%的白蛋白注射液。

Description

犬静脉注射白蛋白、其制备方法以及犬静脉注射白蛋白制剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬静脉注射白蛋白、其制备方法以及犬静脉注射白蛋白制剂。

发明背景

宠物在人们日常生活中的地位越来越重要，宠物保健已经成为一个重要的课题。犬用血液制品是从犬血浆中分离提取的生物制品，又称血浆衍生物。这类制品可以用于犬病的治疗或补充替代。

上述生物制品之一即为白蛋白，白蛋白作为溶质可降低溶液中水分子的势能，1克白蛋白可使18克水保持在血管内，产生的渗透压相当于20毫升血浆或40毫升全血，并对某些离子(如钙、铜、锌等两价金属离子)和化合物(如胆红素、尿酸、脂肪酸等代谢产物，乙酰胆碱、组胺、甲状腺素等调节物质以及多种药物等)均有较高亲和力，与之可逆结合以发挥运输和调节作用。本品主要用作血容扩充剂，可提高血浆胶体渗透压、增加血容量，用于预防或抢救失血性休克、创伤性休克，严重烧伤、烫伤等。本品可补充机体白蛋白，提高血浆白蛋白的浓度，用于治疗低蛋白血症、肝硬化以及肾疾患所致的腹水和水肿，由脑水肿或大脑损伤所致的脑压增高等。

现已有发明人研究从动物血中提取蛋白的方法，如专利申请9410410.8，但是，由于技术上的原因，其研制出的白蛋白不能应用于静脉注射。目前，尚没有对犬用静脉注射用免疫球蛋白的研究和应用的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬静脉注射白蛋白。

本发明提供的犬静脉注射白蛋白，是由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺法分离、制备得到的pH值在6.4～7.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的犬血白蛋白。

其中，所述血浆或血清来自多种犬病，包括细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病和犬副流感等疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血浆或血清。

本发明的另一目的在于提供犬静脉注射白蛋白的制备方法。

本发明的犬静脉注射白蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1).将健康犬的血浆或血清融解后去除杂蛋白；

2).将去除杂蛋白的溶液在pH6.4～7.4条件下，超滤、浓缩、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～25％的白蛋白注射液。

上述方法中，步骤1)所述去除杂蛋白的过程为利凡诺法，包含以下步骤：

(1).融化后血浆或血清调至PH8.5±0.1，加入2％利凡诺，去除上清液，取沉淀；

(2).将沉淀解离时加入稳定剂，调整解离液pH值至5.5±0.1，升温至60℃并保持恒温1小时后快速降温至30℃以下，离心去除沉渣，再用活性炭吸附其余杂质，得到含白蛋白的上清液。

上述方法中，步骤1)中所述去除杂蛋白的过程为低温乙醇法，包含以下步骤：

(1).将血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，控制pH7.0～7.4，加入预冷乙醇，至乙醇终浓度为8％，离心去除杂蛋白；

(2).多次对上清液进行处理，在pH4.5～6.0，逐渐加入乙醇至终浓度19～40％，静置过夜后，离心去除沉淀的杂蛋白；

本发明还有一目的在于提供一种犬静脉注射白蛋白制剂。

本发明提供的犬静脉注射白蛋白制剂，由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺法分离、制备得到的pH值在6.4～7.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的蛋白含量为1～25％的白蛋白注射液。

上述制剂中，还包括生物体可接受的稳定剂，所述稳定剂为0.16mmol/L辛酸钠或0.08mmol/L辛酸钠和0.08mmol/L乙酰色氨酸钠。

上述制剂，为配制成3～10％葡萄糖溶液或3～5％葡萄糖盐水的白蛋白溶液。

本发明提供的犬静脉注射白蛋白，其保持有完整的天然生物分子结构，保持蛋白质的天然性质：乙醇沉淀血浆在接近溶液冰点温度下进行，能使蛋白质变性降至最低限度，保持其天然状态。

本发明提供的犬静脉注射白蛋白的制备方法，工艺简单，成本低，回收率高，制备的成品纯度好，纯度超过96％，且性能稳定。

本发明提供的犬静脉注射白蛋白制剂，不含任何防腐剂，生物适应性好。

附图说明

图1是本发明方法得到的白蛋白分子量鉴定图。

具体实施方式

为更清楚地公开，以下从几方面叙述本发明。

本发明提供的犬静脉注射白蛋白(Alb)，是将犬的血浆或血清，用现代生物技术分离提取，经病毒灭活并加入适量稳定剂制成的犬用静脉注射生物制剂。其中，血浆和血清可为多种犬病(如细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病、犬副流感等)的疫苗免疫大量健康犬后获得的混合血浆，此时，对犬的免疫、取血浆过程，与其它常规做法相同；病毒灭活的方法和步骤可以采用常规的方法；现代生物分离技术，在本发明中是指从血浆中分离提取白蛋白的方法，可以为低温乙醇法或利凡诺法，提取时的总体要求为：

1、原料

新鲜分离的液体血浆、血清、轻度溶血或脂肪血浆、去除其他血浆蛋白的组分等均可用于制备。

2、原料要求

所用之血浆或血清，应尽可能保持无菌，否则应及时投料制造或低温冰冻保存。低温冰冻保存血浆最长保存期不应超过2年。

3、操作场所

工作室应符合GMP工艺流程要求。冷库及各种生产用具必须专用，严禁与其他异种蛋白质混用。工作室的建筑应便于清洁、消毒、防霉。在制造过程中为防止制品污染热原质，应采取各种有效措施，如降低操作室温度，注意无菌操作等。各种直接接触制品的用具，用后应立即洗净，用前须经除热原质或灭菌处理。

4、制备用水及化学药品

生产用水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。所用各种化学药品应符合《中国兽药典》、《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《中国生物制品主要原材料试行标准》等规定，未纳入标准者应不低于化学纯。

在本发明技术方案和以下实施例中，如无特殊说明，所提及物质浓度如蛋白浓度、乙醇浓度和葡萄糖、葡萄糖盐水浓度等均以％表示，意为g/100ml，即每100毫升溶液中所含溶质的重量克。

实施例一：采用利凡诺法提取犬白蛋白

1)融浆及调pH

将符合原料要求的血浆20万毫升在37℃条件下快速融化，并在无菌环境下置入反应罐；在搅拌状态下缓慢加入浓度为1％的Na₂CO₃，调pH至8.5±0.1。

2)络合与解离

在搅拌状态下，向反应罐中加入与血浆等体积(20万毫升)的2％利凡诺，加完后停止搅拌，静置2小时。

取出反应罐内络合后的上清部分用于分离免疫球蛋白用，沉淀部分留于罐内；启动搅拌器，用PP6泵将NaCl，HCl溶液及辛酸钠溶液先后加入罐内；混合液搅拌2小时以上或过夜；

按投入血浆体积加入终浓度为0.6％的NaCl、终浓度为0.2％的辛酸钠和4％的0.5mol HCl，溶入10万毫升水中。NaCl与辛酸钠分开溶解，0.5mol/LHCl加入溶解后的NaCl溶液中。

3)去除杂蛋白

用0.5mol/L HCl调pH值至5.5±0.1；用60-65℃水将解离液在1小时内升温至60℃并保持恒温1小时；用冷水快速降温至30℃以下。

用兰氏离心机3000rpm/mim离心解离后的样品，弃沉渣，留上清液。

将上清液置入不锈钢罐中，搅拌并按上清液体积的2％加入处理后的活性炭，加完后搅拌半小时后停机静置。

4)过滤与超滤

用乙-3板、甲-2板先后过滤静置后的上清液，将过滤后的白蛋白液置入超滤罐中，启动超滤装置，浓缩白蛋白液至所需浓度，该浓度范围最好控制在1～25％。

实施例二：采用低温乙醇法提取犬白蛋白

所述低温乙醇法包含以下步骤：

1).融浆及添加乙醇

将符合原料要求的血浆20万毫升在37℃条件下快速融化，并在无菌环境下置入反应罐；在搅拌状态下逐渐降温至0℃，用pH为4的醋酸缓冲液调pH至7.2±0.2；边搅拌边加入预冷为-15℃--20℃的53.3％乙醇至乙醇体积终浓度为8％(加乙醇要缓慢，以10万毫升血浆计，每分钟加400-500ml，2-3小时加完)，温度维持在-2℃--3℃，加完后继续搅拌1小时，静置2小时。

2).离心去除杂蛋白

使用G142连续离心机，13000r，多次离心，弃沉淀，留上清液。

首次离心时离心机出液口温度-2℃--3℃，上清液用pH为4的醋酸缓冲液调pH为5.8±0.05，用95％的低温乙醇缓慢加至终体积浓度为19％，温度保持在-5℃～-6℃，加完后搅拌2小时，-5℃静置过夜；

第二次离心，弃沉淀，留上清液，对上清液进行深处理，调整pH值至5.8-5.85，乙醇浓度加至总体积的40％，温度保持在-5℃--7℃，加完后搅拌2小时，静置过夜；

第三次离心，弃沉淀，留上清，对上清液进一步处理，加0.5％的去热原硅藻土，搅拌30分钟，静置30分钟以上，在-5℃室温下，用乙-3，甲-2板先后过滤去除残余杂蛋白，过滤液调pH4.8±0.05(用醋酸缓冲液调，注意补加缓冲液的乙醇，使之终浓度仍维持在40％)，温度仍控制在-5℃--7℃，搅拌2小时，静置过夜；

第四次离心，弃上清，沉淀即为得到的白蛋白(参见图1)。

3).白蛋白组分的处理：

用1∶6或1∶10比例的0℃H2O搅拌溶解沉淀，保持温度-2℃--3℃，在PH4.6±0.1下，补加53％的低温乙醇，使乙醇总浓度为10％，搅拌溶解后，继续搅拌2小时，静置过夜。

4)过滤与超滤

甲-2板过滤静置后的上清液，过滤液调pH6.4-7.4。将过滤后的白蛋白液置入超滤罐中，启动超滤装置，用10倍体积的0℃水超滤去乙醇，使乙醇最终浓度不高于0.03％，并浓缩白蛋白液至所需浓度，该浓度范围最好控制在1～25％。

对实施例一、二得到的白蛋白进行鉴定，结果如图1所示。

实施例三：配制犬静脉注射白蛋白制剂--白蛋白含量在1％～25％的静脉注射液

将实施例一和实施例二提取的浓度为1～20％的白蛋白液，继续下述操作得到可静脉注射用的白蛋白制剂：

5)送检及添加试剂：

取浓缩后样品送检，测定白蛋白的含量；按0.16mmol/g白蛋白添加辛酸钠；按160mmol/L白蛋白液添加NaCl；调至pH7.0±0.2。

6)灭活：

将白蛋白溶液置入不锈钢牛奶罐中，密封。每批制品必须经60±0.5℃加温10小时处理。灭活处理可在除菌过滤前或分装后24小时内进行。

7)分批：

同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批。不同滤器除菌过滤的制品则分为不同亚批。

8)半成品检定：

液体制剂于除菌过滤后应做理化检查(残余利凡诺含量≤0.0％)及热原质试验，并按亚批抽样做无菌试验。

直接分装时应留样做上述试验。

9)配制、除菌与分装：

将半成品检定合格的制品，根据白蛋白的浓度进行配制；无菌过滤，按要求分装成不同剂型和规格。其中，剂型主要为液体，规格可以按白蛋白含量分为但不限于1％、5％和10％、20％、25％多种。1％、5％和10％的白蛋白注射液系可以为5％葡萄糖生理盐水，规格为但不限于20mL/每瓶和50mL/每瓶；5％的白蛋白注射液系可以为但不限于5mL/每瓶和10mL/每瓶；10％和20％、25％的白蛋白注射液系可以为但不限于5mL/每瓶和10mL/每瓶。在配制过程中，需要加入稳定剂，以每克白蛋白含0.16mmol辛酸钠或0.08mmol辛酸钠和0.08mmol乙酰色氨酸钠计算稳定剂的加入量。

实施例四：制备犬静脉注射白蛋白制剂-葡萄糖注射液

在实施例三步骤9)中，向确定浓度(如5％)的白蛋白液中加入葡萄糖至终浓度5％(重量)，然后再除菌分装，得到蛋白含量为5％的添加葡萄糖的犬静脉注射白蛋白注射液。

用同样的方法，改变葡萄糖的添加量，使得葡萄糖的含量在1％至10％之间的任意期望浓度变化，得到蛋白含量在1％至25％之间，制成含葡萄糖浓度在1％至10％的犬静脉注射白蛋白注射液。

实施例五：制备犬静脉注射白蛋白制剂-葡萄糖生理盐水注射液

和实施例四同样的方法，用葡萄糖生理盐水代替葡萄糖作保护剂，得到蛋白含量在1％至25％之间，1％至10％(重量)葡萄糖盐水的犬静脉注射白蛋白注射液。

对上述得到的白蛋白制剂进行检验，其符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《中华人民共和国兽用生物制品制造与检验规程》、《生物制品化学检定规程》等要求。

1、放置试验：液体制剂分装后，应在20～35℃的条件下放置至少14天，逐瓶检查，外观应为略有粘稠、黄色或绿色至棕色澄明液体，不含有任何异物，也无混浊和沉淀现象。

2、热稳定性试验

取液体制剂检品，放入57±0.5℃水浴保温50小时后，与同批未保温的另一瓶检品比较，除颜色有轻微变化外，无肉眼可见的变化。

3、化学检定

按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《生物制品化学检定规程》等进行。

3.1pH值

1％的白蛋白注射液在20＜±2＜℃测定，其pH值为6.4～7.4；5％和10％的制品用生理盐水稀释成1％蛋白质浓度，在20＜±2＜℃测定，pH值为6.4～7.4。

3.2蛋白质含量及总量

用钨酸沉淀法测定，蛋白质含量不低于标示量的95％，每瓶蛋白质总量应不低于25％。

3.3纯度

经检验，不同规格的制品，白蛋白含量不低于蛋白质总量的96％。

3.4钠离子测定

除1％白蛋白葡萄糖盐水外，其它制品的钠离子含量≤160mmol/L。

3.5钾离子测定

所有规格的制品，其钾离子含量均≤2mmol/L。

3.6吸收度测定

1％蛋白质溶液在1cm比色池403nm波长下测定吸收度，应≤0.15。

3.7多聚体含量

所有规格的制品，其多聚体含量均≤5％。

3.9辛酸钠含量

所有规格的制品，其辛酸钠含量均≤0.18mmol/g蛋白质。

4、鉴别试验

采用免疫双扩散法。仅与抗犬的血清产生沉淀线，与抗人、抗马、抗牛的血清不产生沉淀线。

5、无菌试验

按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》进行。

结果：符合标准。

6、安全试验

6.1豚鼠试验

用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml，注射后半小时内动物没有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。

结果：符合标准。

6.2小白鼠试验

用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射检品0.5ml，半小时内动物没有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠复试一次，判定标准同前。

结果：符合标准。

7、热原质试验

按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《生物制品化学检定规程》等进行。注射剂量按家兔体重注射0.6g/kg。

结果：符合标准。

上述得到的犬静脉注射白蛋白制剂可以直接使用，是急、危、难、重病的特效、高效药。其使用方法：

一般采用静脉推注或滴注。为防止大量注射时使机体组织脱水，必要时可用5％葡萄糖注射液或氯化钠注射液适当稀释作静脉滴注。

输注剂量：5公斤以下犬，10毫升/日；5～10公斤犬，20毫升/日；10公斤以上犬，20～40毫升/日。病情严重时，可酌情加倍。

创伤、烧伤、手术、失血等情况：可按上述剂量输注，隔4～6小时重复注射一次。

肾病、肝硬化、营养不良等慢性白蛋白缺乏症等情况：可按上述剂量输注，直至水肿消失、血清白蛋白含量恢复正常为止。

中毒性疾病、脑水肿、大脑损伤等情况：可按上述剂量输注，直至症状缓解或消失为止。

输注速度：每分钟不超过0.5毫升(约10～15滴)为宜。但在开始15分钟内，应注意缓慢加速至上述速度。

保存及有效期：保存于2～8℃暗处，谨防冻结；有效期3年。

Claims (6)

1.一种犬静脉注射白蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1).将采集的健康犬的血浆或血清融化后，逐渐降温至0℃，控制pH7.0～7.4，加入预冷乙醇，至乙醇终浓度为8g/100ml，温度控制在-2℃～-3℃搅拌后静置；

2)多次离心对上清液进行处理去除杂蛋白：

对步骤1)静置溶液离心，取上清液，调pH为5.8±0.05，加入低温乙醇至乙醇浓度为19g/100ml，温度保持在-5℃～-6℃，搅拌2小时后静置过夜；

对上次静置液进行第二次离心，取上清液，调整pH值至5.8～5.85，乙醇加至其浓度为40g/100ml，温度保持在-5℃～-7℃，搅拌，静置过夜；

对上次静置液进行第三次离心，留上清，加0.5％的去热原硅藻土，搅拌后静置，在-5℃室温下，用乙-3，甲-2滤板先后过滤去除残余杂蛋白，取过滤液调至pH4.8±0.05，补加乙醇至其浓度仍维持在40g/100ml，温度控制在-5℃～-7℃，搅拌，静置过夜；

对上次静置液进行第四次离心，弃上清，留沉淀得白蛋白。

2.根据权利要求1所述犬静脉注射白蛋白的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

3).用0℃的H₂0搅拌溶解沉淀，保持温度-2℃～-3℃，在pH4.6±0.1下，补加低温乙醇至乙醇浓度为10g/100ml，搅拌，静置过夜；

4)将步骤3)去除杂蛋白的溶液在pH6.4～7.4条件下，超滤、浓缩、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～25％的白蛋白注射液。

3.根据权利要求2所述犬静脉注射白蛋白的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

5)向确定浓度的白蛋白注射液中加入葡萄糖或葡萄糖生理盐水溶液至葡萄糖浓度1～10％，然后再除菌分装成犬静脉注射白蛋白注射液制剂。

4.一种犬静脉注射白蛋白，是用权利要求1所述方法制备得到的pH值在6.4～7.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的犬血白蛋白。

5.一种犬静脉注射白蛋白注射液，是用权利要求2的方法制备得到的白蛋白含量为1～25％的白蛋白注射液。

6.一种犬静脉注射白蛋白制剂，是用权利要求3的方法制备得到的含白蛋白1～25％，以及葡萄糖1～10％或葡萄糖生理盐水的白蛋白注射液制剂。

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