CN100355891C

CN100355891C - 人kctd10基因启动子

Info

Publication number: CN100355891C
Application number: CNB2006100312795A
Authority: CN
Inventors: 张健; 周爱东; 周建林; 胡翔; 刘如石; 杨利平
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2007-12-19
Anticipated expiration: 2026-02-28
Also published as: CN1844389A

Abstract

本发明提供了人KCTD10基因(钾离子通道四聚化结构域包含蛋白10基因)启动子，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的人KCTD10基因启动子元件可用于研究DNA复制、修复和细胞凋亡过程中重要分子的功能，以及用来筛选DNA复制、修复和细胞凋亡相关疾病的药物等。

Description

人KCTD10基因启动子

技术领域：

本发明涉及基因表达调控领域，具体是指人KCTD10(钾离子通道四聚化结构域包含蛋白10)基因的启动子以及它的用途。

背景技术：

周建林等人克隆了小鼠KCTD10基因(钾离子通道四聚化结构域包含蛋白基因10)(周建林等人，Biochimica et Biophysica Acta.1729，200-203(2005))。研究分析表明KCTD10基因氨基酸序列与PDIP1(DNA聚合酶δ相互作用蛋白1)以及TNFAIP1(TNF-α诱导蛋白因子1)高度保守，与PDIP1和TNFAIP1一样，KCTD10蛋白在氨基末端包含一个BTB/POZ结构域以及一个钾离子通道四聚化结构域，在碳末端包含一PCNA(增殖细胞核抗原)结合结构域，因此把他们归纳为同一基因家族-PDIP1基因家族。同时发现小鼠KCTD10基因主要在肺部表达，在心脏和睾丸也有适量的表达，并且KCTD10基因可以被TNF-α(肿瘤致死因子α)所诱导。进一步实验表明KCTD10可以与P50(DNA聚合酶δ小亚基)以及PCNA(增殖细胞核抗原)能相互作用(周建林等人，Biochimica et Biophysica Acta.1729，200-203(2005)；何华等人，PNAS.98，11979-11974(2001))。

KCTD10蛋白能与DNA聚合酶δ和PCNA相互作用，DNA聚合酶δ是真核细胞DNA复制的主要聚合酶，而PCNA则为一多功能的蛋白，它通过与其它蛋白的相互作用参与一系列细胞内必需的生命过程，而研究最为透彻的是它作为一个滑动夹钳结构为DNA聚合酶δ结合到DNA模板上提供了便利，从而参与DNA复制，并且在DNA修复以及细胞周期的控制中发挥功能。因此，KCTD10很可能参与了DNA的复制，而且还具有促进DNA修复和抗细胞凋亡作用。KCTD10基因的表达可以被TNF-α所诱导，而TNF-α是一种多功能的细胞因子，参与细胞的复制、凋亡等的调控，因此可以推断PDIP1基因家族包括KCTD10可能在TNF-α诱导和DNA复制/修复之间起到了一个“桥梁”作用(周建林等人，J.Exp.Zool.303A，227-240(2005)；周建林等人，Biochimica et Biophysica Acta.1729，200-203(2005))。

鼠KCTD10基因位于5号染色体，人KCTD10基因位于12号染色体，它们间具有相似的基因组结构，氨基酸序列也高度保守，它们在体内应发挥相似的功能。

启动子在基因表达调控中起关键作用，然而目前还没有获得人KCTD10基因的启动子有关的调控序列。鉴于KCTD10基因在DNA复制、DNA修复以及细胞周期调控中可能存在的重要作用，因此，本领域迫切需要开发人KCTD10基因启动子以及其调控序列。

发明内容：

本发明的目的是提供人KCTD10基因的启动子及含有该启动子的载体。

本发明提供的人KCTD10基因启动子，包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明提供的载体，它包含本发明上述的启动子。

本发明的人KCTD10基因启动子无论是在理论研究还是在现实应用方面都具有广阔的前景。实验证明PDIP1基因家族(包括KCTD10)能结合PCNA，并刺激PCNA依赖的DNA聚合酶δ的活性，而DNA聚合酶δ又是真核生物DNA复制及修复的主要酶，这就说明KCTD10能刺激DNA复制和修复，并参与抗凋亡的过程。因此可以利用本发明的启动子筛选与DNA复制及修复等有关疾病(比如肿瘤)的药物；可以利用该发明的启动子作为导向元件，对一些因与DNA复制及修复有关基因的缺失或表达不足而造成的疾病如肿瘤进行基因治疗；除此之外，通过作用于该启动子，可以对与DNA复制、修复和细胞凋亡过程中重要分子的功能进行研究，并且通过对该启动子的控制，可以在特定时间、特定组织能改变KCTD10基因的表达，对与DNA复制、修复以及细胞凋亡有关的疾病如肿瘤的治疗提供一条可行的途径。

附图说明：

图1.人KCTD10基因启动子序列(对应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)。图中下划线表示没有或仅有弱调控活性的转录因子结合位点；方框表示强调控活性转录因子结合位点；向右的箭头表示转录起始位点，标注为+1位；向右的空心箭头表示第一个内含子的起始位点；向左的箭头表示其相邻基因UBE3B(泛素化蛋白连接酶E3B)mRNA的起始位点；黑方框标示的碱基(ATG)为翻译起始位点。

图2.引物延伸实验结果，左侧为双脱氧测序法所测得的核苷酸序列，星号表示转录起始位点，箭头所示为以HeLa细胞RNA为模板进行反转录的产物。

图3.人KCTD10基因启动子的一系列缺失突变体的相对荧光值。

图4.人KCTD10基因启动子的一系列位点特异性突变体的相对荧光值。图中椭圆表示c-myb结合位点，圆圈表示Sp1结合位点，方框表示SREBP-1结合位点，向右的梯形表示AP-2结合位点，叉号表示对应的位点被突变。

图5. 转录因子AP-2α对人KCTD10基因启动子-203～+30区转录活性的影响。

图6. 转录因子Sp1对人KCTD10基因启动子-203～+30区转录活性的影响。

具体实施方式：

本发明提供的人KCTD10基因启动子驱动人KCTD10基因在细胞或组织中的特性表达。发明人在实验中首次分离克隆得到人KCTD10基因启动子序列，并对其进行了进一步分析，通过引物延伸确定了该启动子的转录起始位点。同时，分别构建了不同长度的人KCTD10基因启动子的表达载体，转染哺乳动物细胞使报告基因获得瞬时表达，以确定人KCTD10基因启动子的转录活性及转录活性主要存在的区段。除此之外，还找出了该启动子中起调控作用的主要反式作用因子及结合位点。

本发明的全长序列或其片段可以通过多种方法获得，包括PCR(聚合酶链式反应)扩增法、重组法、从含有DNA序列的基因组中分离该DNA序列的方法以及体外合成法，但PCR扩增法被优先应用获得本发明的启动子。

如应用PCR扩增法，可以根据本发明所公开的有关寡核苷酸序列来设计引物，并以人基因组DNA或所构建的人基因组DNA文库作为模板获得相应的序列。

当获得该序列以后，就可以通过重组的方法批量获得此种序列，方法是先把序列克隆到能自主复制和增殖的适当载体，然后把载体转入到能快速繁殖和扩增的细胞如大肠杆菌中，再通过常规方法从增殖的的大肠杆菌中分离得到有关的序列。

从含有DNA序列的基因组中分离DNA序列的方法主要是通过筛选DNA文库，以鉴定包含人KCTD10基因启动子全长序列或其片段的方法。

除此之外，还可以用体外化学合成的方法获得相关的序列，一般是先合成多个小片段序列，再通过末端合适的限制位点把这些序列依次连接，形成正确的核苷酸序列，从而得到包含KCTD10基因启动子或其片段的DNA序列，然后可将该DNA序列引入本领域中已知的的DNA分子如载体或细胞中。

本发明也包括包含了人KCTD10基因启动子的载体，以及用所述载体转化或转导宿主细胞，并涉及经过重组技术产生外源蛋白的方法。

本发明的启动子适用于在宿主细胞中驱动外源基因的表达。KCTD10基因启动子或其片段都可操作性地连接任何一个感兴趣的基因编码序列，并指导与之相连的核酸分子的转录。

除此之外，当本发明所公开的启动子或元件能够控制其它异源启动子的功能时，它们也可操作性地连在一起，共同指导下游外源基因的表达。

能用于本发明中的外源基因没有特殊限制，包括各种报告基因和功能相关基因等。特别是宿主固有基因应用于该启动子在基因治疗中能发挥作用，比如某些基因的先天缺陷病，或由于基因表达不足造成的病症，可以从人体分离这种基因，并把它构建在本发明所涉及的启动子下游，得到能表达外源基因的构建物，这种构建物能用于基因治疗。

运用本发明中人KCTD10基因启动子或片段来表达外源基因，其中涉及表达载体的使用。本发明的表达载体为“质粒”形式，为圆形双链DNA分子。在表达载体中，除本发明所涉及的人KCTD10基因启动子或片段序列以外，还应包括复制起点、筛选标记基因、转录终止序列等等。同时还可以运用体外DNA重组技术和DNA合成技术等可以在载体恰当位置引入合适的转录和翻译控制序列，从而指导mRNA的合成和蛋白质的表达。

表达载体复制起点用于在宿主细胞中扩增该质粒载体，所用的复制起点应与宿主细胞相匹配。若在原核细胞中表达，则在表达载体中应包含原核基因的起始序列如ColE1复制起始序列ori；若在真核细胞中表达，则应包含真核基因的复制起始序列如SV40病毒的复制序列。此外，表达载体应包含一个或多个选择标记基因，以提供用于筛选转化细胞的表型性状，如在真核细胞中培养用的二氰叶酸还原酶(DHFR)、新霉素抗性基因(neo)及绿色荧光蛋白(GFP)等，或在大肠杆菌中培养用的卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)等。

宿主细胞包括多种细胞类型，可以是原核细胞或是真核细胞，原核细胞如细菌，最有代表性的有大肠杆菌和链霉菌属；低等真核细胞如酵母细胞；高等真核生物如哺乳动物细胞，COS、CHO、HeLa等比较常用。本发明优先利用哺乳动物细胞。

根据所用的宿主细胞不同，采用各种细胞常用的培养基在适于宿主细胞生长和增殖的条件下进行培养。重组DNA导入宿主细胞可以利用本领域专业人员熟知的方法进行，对于原核细胞如大肠杆菌，可以用氯化钙处理制备感受态细胞的转化法以及电击转化法，对于真核生物细胞特别是培养的哺乳动物细胞，采用的常用转化方法包括磷酸钙共沉淀法、脂质体包装法以及显微注射法等等。

在本发明的一个实施例中，通过PCR的手段获得了人KCTD10基因的启动子序列，并且发现KCTD10基因与人UBE3B基因(泛素蛋白连接酶E3B)头头相对，两者间的距离只有大约300bp，进一步对KCTD10基因启动子序列分析表明，这段序列富含GC，达到65％以上，尽管没有TATA框和CCAAT框，但存在多个潜在的转录因子的结合位点，其中包括两个Sp1，两个AP-2，两个c-Myb，一个CACCC-box等。现在已经证明许多富含GC的启动子缺乏典型的TATA或DPE核心元件，但Sp1和其它相关的转录因子结合于启动子，并通过与其它基本转录复合物相互作用组装成转录起始复合体，启动基因的转录(Brandeis等人，Nature.371，435-438(1994)；Macleod等人，Genes Dev.8，2282-2292(1994))。这说明分离的序列包含了典型的启动子区域。

本发明还通过引物延伸方法确定了人KCTD10基因启动子的转录起始位点为腺嘌呤A，位于KCTD10基因翻译起始位点上游63bp。

在另一实施例中，本发明将含有不同长度的人KCTD10基因启动子的表达载体导入哺乳动物细胞，使报告基因得到瞬时表达，分析了人KCTD10基因启动子的活性以及转录活性主要存在的区段，并找出了起调控作用的主要反式作用因子以及其作用位点。

下面结合实施例，进一步阐述该发明。

实施例1：人KCTD10基因启动子的克隆、测序

设计并合成一对引物，引物序列如下：

正向：5’-GGGGTACCTGGAGCACACACGCCAGATC-3’(SEQ ID NO：2)

反向：5’-CCAAGCTTCGGACTGAGAGAGGCAGGAA-3’(SEQ ID NO：3)

以人基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：12.5μl 2×GC buffer，0.1mM dNTP(2.5mM)，正向和反向引物各0.2μM，1单位的LA Taq DNA聚合酶(购自大连宝生物)，50ng的模板DNA，加无菌水至25μl。反应程序为94℃预变性2分钟，然后进行5个循环(每个循环包括94℃变性45秒，49℃退火45秒，72℃延伸1.2分钟)，接着进行30个循环(每个循环包括94℃变性45秒，68℃退火45秒，72℃延伸1.2分钟)，最后72℃延伸5分钟。

得到的PCR产物即为人KCTD10基因的启动子，其长度为639bp。将该产物用KpnI和HindIII酶切，并将此酶切产物克隆到用同样酶切处理的带有荧光素酶报告基因的pTAL-Luc载体(购自Clontech公司)中，得到质粒P(-609/+30)，并测序。序列如图1和SEQ ID NO：1所示。

实施例2：人KCTD10基因启动子的序列分析

将人KCTD10基因启动子的序列(SEQ ID NO：1)用PromoterInspector在线软件(网址：http://www.genomatix.de)和TFSEARCH软件(网址：http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)进行分析，发现该段序列没有典型的TATA盒，但含有CpG岛。其中-108～+30bp之间有2个c-myb结合位点、1个SREBP-1结合位点、2个Sp1结合位点和2个AP-2结合位点。如图1所示，c-myb.1位点位于-100～92之间，SREBP-1位点位于-61～-53之间，Sp1.1位点位于-68～-62之间，AP-2位点位于-16～-8之间。

实施例3：人KCTD10基因转录起始位点的确定

采用Promega公司的引物延伸试剂盒并按说明书上的方法进行。设计并合成引物，引物序列为：5’-TCTCCAAACCCGGACTGAGA-3’(SEQ ID NO：4)。用T4多聚核苷酸激酶和[γ-³²P]ATP标记引物。然后将10fmol已标记的引物、10μg的小鼠RNA混合并在60℃下温育30分钟，然后加入1单位的AMV反转录酶，在42℃温度条件下温育40分钟。同时，以人KCTD10基因启动子序列为模板，用Cycler DNA测序试剂盒(构自MBI公司)进行测序，测序的引物与反转录引物相同。最后，将反转录产物和测序产物在同一个测序胶上电泳，然后按常规方法进行干胶、压X光片和冲洗X光片。结果如图2所示，左边序列为测序胶所测得的核苷酸序列，人KCTD10基因转录起始位点被定位于核苷酸A，位于翻译起始点(ATG)上游63bp处。

实施例4：人KCTD10基因启动子的真核表达质粒的构建

为了确定人KCTD10基因启动子的主要转录活性区段，我们通过PCR手段以实施例一中所构建的P(-609/+30)载体为模板，将质粒P(-609/+30)中所包含的SEQ ID NO：1所显示的人KCTD10基因启动子序列分割成六段不同长度的片段，然后连接到荧光素酶报告基因载体pTAL-Luc中，构建一系列重组表达质粒。用引物PLuc-KCTD10-R(SEQ ID NO：3)和引物P(-343/+30)-F2：GGGGTACCCGACGCACTACCGCCATCGT(SEQ ID NO：5)得到一373bp片段，然后此片段经过KpnI和HindIII酶切，插入pTAL-Luc的KpnI和HindIII之间，得到质粒P(-343/+30)。用引物P(-609/+30)-F1：GGGGTACCTGGAGCACACACGCCAGATC(SEQ ID NO：2)以及引物P(-609/-241)-R：CCAAGCTTTTCCTTCCCGGGCGAAGAAG(SEQ ID NO：6)得到一368bp片段，此片段经过KpnI和HindIII酶切，插入pTAL-Luc的KpnI和HindIII之间，得到质粒P(-609/-241)。

此外，我们分别上游引物P(-241/+30)-F3、P(-203/+30)-F4、P(-108/+30)-F5及P(-13/+30)-F6和共有的下游引物PLuc-KCTD10-R(SEQ ID NO：3)PCR分别得到271bp、233bp、138bp和43bp的片段，这些片段都用KpnI和HindIII酶切，插入pTAL-Luc的KpnI和HindIII之间，分别得到质粒P(-241/+30)、P(-203/+30)、P(-108/+30)和P(-13/+30)。引物P(241/+30)F3、P(-203/+30)-F4、P(108/+30)-F5及P(-13/+30)-F6的序列如下：

P(-241/+30)-F3：GGGGTACCCTTCTTCGCCCGGGAAGGAA(SEQ ID NO：7)

P(-203/+30)-F4：GGGGTACCGCAGCTGAAATAGCGGAGGT(SEQ ID NO：8)

P(-108/+30)-F5：GGGGTACCAACGGACGGCTTAAGACGTT(SEQ ID NO：9)

P(-13/+30)-F6：GGGGTACCCCGGCTGGCGTGAGCTGGGT(SEQ ID NO：10)

除了上述的按照5’到3’的方向对小鼠PDIP1基因启动子作系列缺失外，本发明还采用重叠PCR的方法(参见萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南，科学出版社，2002年，第1109-1112页)对质粒P(-203/+30)中启动子序列上的c-myb.1、SREBP-1、AP-2.2和Sp1.1结合位点进行了突变。所用的引物(小写字母表示突变核苷酸)如下：

c-myb.1位点的突变引物：

正向：CTAGGCGaAtcAtGGACGGC(SEQ ID NO：11)

反向：GCCGTCCaTgaTaCGCCTAC(SEQ ID NO：12)

SREBP-1位点突变引物：

正向：GCGGAAtTaGtGTGCGGACA(SEQ ID NO：13)

反向：TGTCCGCACaCtAaTTCCGC(SEQ ID NO：14)

Sp1.1位点突变引物：

正向：CCTCTGCGaGtCaGAAGTGG(SEQ ID NO：15)

反向：CCACTTCtGaCtCGCAGAGG(SEQ ID NO：16)

AP-2.2位点突变引物：

正向：CGCCTCCGtCaCCGtCTGGC(SEQ ID NO：17)

反向：GCCAGaCGGtGaCGGAGGCG(SEQ ID NO：18)

实施例5：人KCTD10基因启动子的主要转录活性区段的确定

(1)在5％CO₂培养箱中用DMEM完全培养液(含10％新生牛血清、2mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)培养HeLa细胞。

(2)至细胞密度为90％左右时，完全培养液换成没有抗生素和血清的培养液，换液3小时以后分别将实施例5所述的包含KCTD10基因启动子不同区段的重组表达质粒和β-半乳糖苷酶报告质粒pCMV-LacZ(作为内对照，购自Promega公司)共转染人HeLa细胞，转染试剂采用Lipofectamine^TM 2000(购自Invitrogen/Gibco公司)，并按产品说明书所述的方法进行转染。24孔板每一孔转染0.5μg样品DNA、0.5μg pCMV-LacZ。

(3)转染6小时以后，再把培养液换成完全培养液，36小时后，收获细胞。使用Luciferase Assay System试剂盒(购自Promega)，在TD-20/20型荧光照度计(购自Promega)下测量荧光强度。以共表达的β-半乳糖苷酶活性作为内标，用来校正因转染率不同而造成的荧光素酶活性差异。β-半乳糖苷酶活性的测定按照凯里等人的方法(参见凯里等，真核生物转录调控-概念、策略与方法，科学出版社，2002，p178-179)进行。

实验结果如图3所示。结果表明，其转录活性主要区段在-108～+30bp之间(对应于SEQID NO：1中501-639位的核苷酸序列)。

实施例6：转录因子c-myb、SREBP-1、AP-2和Sp1对人KCTD10基因启动子转录活性的分析

如实施例4所述，对质粒P(-203/+30)中启动子序列上的c-myb、SREBP-1、AP-2和Sp1结合位点进行了突变。然后将各种突变转入HeLa细胞中并按实施例5所述的方法分析各个突变体的转录活性。实验结果如图4所示，突变了c-myb.1位点，转录活性降低了28.6％；突变SREBP-1位点，转录活性增加了27.4％；突变Sp1.1位点，转录活性降低了46.9％；突变AP-2.2位点，转录活性升高了88.1％。说明c-myb和Sp1对人KCTD10基因启动子起正调控作用，而SREBP-1和AP-2则起负调控作用。

为了进一步证实Sp1和AP-2在KCTD10基因调控中的功能，我们将野生型质粒P(-203/+30)或Sp1.1位点突变的突变型质粒MT-Sp1.1和pCMV-Myc-Sp1(Sp1的真核表达质粒)共转染HeLa细胞。结果如图5所示，野生型质粒P(-203/+30)在Sp1过表达下，启动子活性上调58.3％，而突变型质粒MT-Sp1.1在Sp1过表达下，启动子活性只增加了15.4％。说明转录因子Sp1激活KCTD10基因转录。此外，我们将质粒P(-203/+30)和pCMV-Myc-AP-2α(AP-2α的真核表达质粒)共转染HepG2细胞。结果如图6所示，随着pCMV-Myc-AP-2α的量的增加，启动子的活性逐渐下降，进一步说明转录因子AP-2α抑制KCTD10基因转录。

序列表

<110>湖南师范大学

<120>人KCTD10基因启动子

<130>生物领域

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>700

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(700)

<223>

<400>1

tggagcacac acgccagatc ccagcacttg ttcctccgac ctggccaggc agggactgtg 60

ccctagagcc aactccctca aagtccccag ccccaccact cggaggactg acgacccagt 120

tctcccgcag gccggaccgc aggccctacc ggcctacccg caggccgacc tttattcgcc 180

ggaggtcccc gcacttgggg tcggggccgc agctgccact gtctcagccc aaaacacccg 240

agttctgcca gacccggggc agcagccgac gcactaccgc catcttgccc cgcggtgttc 300

gctttcagaa ccccgccagg aagcaagcat ccagttccgg aaaatgacag ttccgcagag 360

cttcttcgcc cgggaaggaa aacttcccca caccttgcct cccctctggc agctgaaata 420

gcggaggtgg gataaatgcc ctccccagcc gagaaaagct ggaacccact ccggccgggg 480

aggctggaaa gaaaactggc ccctaggcgc acaacggacg gcttaagacg ttgccctctg 540

cggggcggaa gtggggtgcg gacagcggaa gttatcgctc cggccccgcc tccgcccccg 600

gctggcgtga gctgggtgtt tcctgcctct ctcagtccgg gtttggagac tcctgcgtcc 660

tccgactttt catggtaggg agggcggtgc ccatggacta 700

Claims

1.一种人KCTD10基因启动子，其特征在于它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的人KCTD10基因启动子，其特征在于对其起调控作用的主要转录因子有c-myb、CACCC-box、Sp1和AP-2。

3.一种载体，其特征在于包含权利要求1所述的启动子。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于它还含有所述的启动子可操作地连接的外源基因。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述的基因是报告基因。