CN100352836C - 新颖的缩肽和制备它们的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新颖的缩肽化合物。本发明还涉及这些化合物的药物组合物和使用这些化合物作为抗菌剂的方法。本发明还涉及制备这些新颖的缩肽化合物的方法和用于制备这些化合物的中间体。

Description

新颖的缩肽和制备它们的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求保护2001年8月6日提交的美国申请No.60/310,313的利益，其全文结合在此作为参考。

发明领域

本发明涉及新颖的缩肽化合物。本发明还涉及这些化合物的药物组合物和使用这些化合物作为抗菌剂的方法。本发明还涉及制备这些新颖的缩肽化合物的方法和用于制备这些化合物的中间体。

发明背景

革兰氏阳性感染——包括由耐药性细菌所导致的那些——发生率的迅速增加已经激发人们重新引起对开发新一类抗生素的兴趣。一类已经显示作为有用抗生物剂的潜力的化合物是环状缩肽。环状缩肽的重要成员是A-21978C脂肽，例如描述在美国专利RE 32,333；RE32,455；RE 32,311；RE 32,310；4,482,487；4,537,717；5,912,226；国际专利申请WO 01/44272；WO 01/44274；WO 01/44271中。另外，描述在美国专利4,994,270；5,039,789和5,028,590中的A54145类化合物也已经显示具有抗生物活性。

达托霉素已知也称LY 146032，包含正癸酰基侧链，与三氨基酸链的N-末端色氨酸连接，后者与环状10氨基酸肽连接。达托霉素具有有力的体外和体内杀菌活性，对抗临床上有关的革兰氏阳性细菌，这些细菌导致严重的和危及生命的疾病。这些细菌包括耐药性病原体，例如万古霉素耐药性肠球菌(VRE)、甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)、糖肽中间体易感性金黄色葡萄球菌(GISA)、万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌(VRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和青霉素耐药性肺炎链球菌(PRSP)，对它们很少有可供替代的治疗选择。例如参见Tally等，1999，Exp.Opin.Invest.Drugs 8：1223-1238。

尽管现有抗菌剂被寄予希望，不过对新抗生素的需求仍在继续。很多病原体已经被反复暴露于常用的抗生素。这种暴露已经引起耐受广谱抗生素的不同抗菌菌株的选择。由耐药机理所导致的抗生素效力与有效性的丧失使抗生素无效，所以能够引起一些事实上不可治疗的危及生命的感染。随着新抗生素的上市，病原体可以发展对这些新药的耐药性或中间耐药性，有效地产生对新抗菌剂潮流的需求，以对抗这些正在出现的菌株。另外，表现杀菌活性的化合物提供优于目前抑菌化合物的优点。因而，新颖的合成抗菌剂将被预期不仅可用于治疗“天然的”病原体，而且可用于治疗中间药物耐药性与药物耐药性病原体，因为该病原体从未暴露于该新颖的抗菌剂。新抗菌剂可以对不同类型的病原体表现不同的有效性。

发明概述

本发明提供新颖的化合物，它们具有抗菌活性，对抗广谱细菌，包括耐药性细菌，还提供制备这些化合物的方法。

本发明在一方面提供式I化合物

及其盐；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2’-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁶独立地是氢或甲基；

(c)R²是甲基或-CH₂CH₂CH₂R⁸；

(d)R³是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；

(e)R⁴是氢或甲氧基；

(f)R⁵是羟基或碳酰氨基；

(g)每个R⁷、R⁸和R⁹独立地是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

(h)其条件是

(1)若R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸，则R⁷不是

其中R¹⁰是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

(2)若R²是甲基，则R⁷不是

其中每个R¹¹和R¹²是氢、C₆-C₁₈未取代的烷酰基、C₈-C₁₈未取代的烯酰基、C₈-C₁₈未取代的烷基或C₈-C₁₈有选择取代的烷基；或者作为替代选择，R¹¹和R¹²一起是C₈-C₁₈亚烷基。

本发明在另一方面提供包括式I化合物的药物组合物和使用该组合物的方法。

本发明在进一方面提供制备式I化合物的方法。

本发明在进一方面提供可用作式I化合物制备中间体的化合物。

发明的详细说明

定义

术语“活化基团”表示这样一种基团，当与羰基相邻时活化羰基被亲核性胺攻击，导致活化基团的丧失和酰胺键的生成。活化基团的实例有芳氧基、酰氧基、咪唑基、

优选的活化基团是芳氧基。最优选的活化基团是五氟苯氧基。

术语“酰基”表示羰基原子团，与烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基连接，实例非限制性地包括诸如乙酰基和苯甲酰基等原子团。术语酰基的子集是(1)“未取代的烷酰基”，它被定义为与未取代的烷基连接的羰基原子团，和(2)“未取代的烯酰基”，它被定义为与未取代的烯基连接的羰基原子团。

术语“酰基氨基”被定义为与酰基相邻的氮原子团。

术语“酰氧基”表示与酰基相邻的氧原子团。

术语“烯基”被定义为直链或支链原子团，具有二至约二十个碳原子，优选三至约十个碳原子，并且含有至少一条碳-碳双键。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。不饱和烃链的双键部分可以是顺式或反式构型。烯基的实例非限制性地包括乙烯基或苯乙烯基。术语烯基的子集是“未取代的烯基”，它被定义为没有携带取代基的烯基。

术语“烷氧基”表示被烷基、环烷基或杂环基取代的氧原子团。实例非限制性地包括甲氧基、叔丁氧基、苄氧基和环己氧基。

术语“烷基”被定义为直链或支链的饱和原子团，具有一至约二十个碳原子，另有指定除外。术语“低级烷基”被定义为含有1-4个碳原子的烷基。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。烷基的实例非限制性地包括甲基、丁基、叔丁基、异丙基、三氟甲基、壬基、十一烷基、辛基、十二烷基、甲氧基甲基、2-(2’-氨基苯甲酰甲基)、3-吲哚基甲基、苄基和羧甲基。术语烷基的子集是(1)“未取代的烷基”，它被定义为没有携带取代基的烷基，(2)“取代的烷基”，它表示这样一种烷基原子团，其中一个或多个氢原子被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基，和(3)“有选择取代的烷基”，它表示这样一种烷基原子团，其中(a)一个质子被选自羟基、羧基、C₁-C₈烷氧基代替，或者(b)一至三个质子被卤代取代基代替。

术语“亚烷基”被定义为下式碳原子团

其中R^x和R^x1独立地选自氢或C₇-C₁₇未取代的烷基，其中来自R^x和R^x1的总碳数不超过17。

术语“炔基”表示为直链或支链原子团，具有二至约十个碳原子，并且含有至少一条碳-碳叁键。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。炔基的实例非限制性地包括丙炔基。

术语“氨基”被定义为NH₂原子团。

术语“氨基酸残基”表示下式化合物

其中R^aa是氨基酸侧链。

术语“氨基酸侧链”表示来自天然存在或合成的氨基酸的任何侧链(R基团)。例如，3-吲哚基甲基也可以被称为色氨酸侧链。

术语“2-(2’-氨基苯甲酰甲基)”表示下式原子团

术语“氨基保护基团”表示任意这样的化合物，可以用于防止分子上的氨基经历化学反应，而化学变化发生在分子中另处。大量氨基保护基团是本领域技术人员已知的，  实例可以见于″ProtectiveGroups in Organic Synthesis″by Theodora W.Greene，John Wileyand Sons，New York，1981。氨基保护基团的实例包括苯二甲酰亚氨基、三氯乙酰基、STA-碱、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片氧基羰基、金刚烷氧基羰基、氯苄氧基羰基、硝基苄氧基羰基等。优选的氨基保护基团是“氨甲酸酯型氨基保护基团”，它们被定义为这样一种氨基保护基团，当与氨基结合时生成氨甲酸酯。优选的氨甲酸酯型氨基保护基团是烯丙氧基羰基(alloc)、苄酯基(CBZ)和叔丁氧基羰基保护基团。

术语“芳基”或“芳基环”被定义为在单一或稠合碳环系统中的芳族原子团，具有五至十四个环成员。在优选的实施方式中，环系具有六至十个环成员。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。芳基的实例非限制性地包括苯基、萘基、联苯、三联苯。

术语“芳氧基”表示被芳基或杂芳基取代的含氧原子团。实例非限制性地包括苯氧基。

术语“氨甲酰基”表示下式氮原子团

其中R^x2选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基且R^x3选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。

术语“烷氧羰基”被定义为与烷氧基或芳氧基相邻的羰基原子团。

术语“羧基”表示COOH原子团。

术语“碳酰氨基”表示CONH₂原子团。

术语“氨基羰基”被定义为与单取代的氨基或二取代的氨基相邻的羰基原子团。

术语“α-羧基氨基酸侧链”被定义为下式碳原子团

其中R^x4被定义为氨基酸侧链。

术语“羧甲基”表示CH₂CO₂H原子团。

术语“环烷基”或“环烷基环”表示单一或稠合碳环系统中的饱和或部分不饱和碳环，具有三至十二个环成员。在优选的实施方式中，环烷基是具有三至七个环成员的环系。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。环烷基的实例非限制性地包括环丙基、环丁基、环己基和环庚基。

术语“二取代的氨基”被定义为含有两个取代基的氮原子团，取代基独立地选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。优选的二取代的氨基原子团是“低级二取代的氨基”原子团，其中取代基是低级烷基。也优选这样的二取代的氨基原子团，其中一个取代基是低级烷基，另一个取代基是α-羧基氨基酸侧链。

术语“Fmoc”是9-芴基甲氧基羰基。

术语“胍基”被定义为下式氮原子团

其中每个R^x5、R^x7和R^x8独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；R^x6选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。

术语“卤代”表示溴代、氯代、氟代或碘代原子团。

“杂芳基”或“杂芳基环”被定义为这样一种芳族原子团，它在单一或稠合的杂环环系中含有一至四个选自O、N、S或SO的杂原子或杂基团，并且具有五至十五个环成员。在优选的实施方式中，杂芳基环系具有六至十个环成员。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。杂芳基的实例非限制性地包括吡啶基、噻唑基、噻二唑基、异喹啉基、吡唑基、_唑基、_二唑基、三唑基和吡咯基。

术语“杂环基”、“杂环的”或“杂环”表示饱和或部分不饱和的环，它在单一或稠合的杂环环系中含有一至四个选自O、N、NH、N(低级烷基)、S、SO或SO₂的杂原子或杂基团，并且具有三至十二个环成员。在优选的实施方式中，杂环基是具有三至七个环成员的环系。一个或多个氢原子还可以被取代基代替，取代基选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨甲酰基、烷氧羰基、羧基、氨基羰基、碳酰氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤代、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、硫代、硫代酰基氨基、硫脲基或脲基。杂环基的实例非限制性地包括吗啉基、哌啶基和吡咯烷基。

术语“氢”被定义为单一的氢原子(H)。

术语“亚氨基氨基”表示下式氮原子团

其中每个R^x9和R^x11独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；R^x10选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基。

术语“改性剂”被定义为(a)亲核性受体或者(b)醛或酮，在还原性条件下与胺反应生成烷基化胺。

术语“单取代的氨基”表示含有氢基和取代基的氮原子团，取代基选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。优选的单取代的氨基原子团是“低级单取代的氨基”原子团，其中取代基是低级烷基。更优选的单取代的氨基原子团是含有α-羧基氨基酸侧链的氨基原子团。

术语“亲核性受体”被定义为容易受到伯胺或仲胺的亲核性攻击的化合物。亲核性受体的实例非限制性地包括异氰酸酯、异硫氰酸酯、活化酯、酰氯、磺酰氯、活化磺酰胺、活化杂环、活化杂芳基化合物、氯甲酸酯、氰基甲酸酯、硫代酸酯、磷酰氯、氨基磷酸酯、亚氨酸酯和内酯。

术语“膦酰氨基”被定义为下式氮原子团

其中R^x12选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；其中每个R^x13和R^x14独立地选自烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、环烷基、杂芳基和杂环基。

术语“亚磺酰基”表示被氧代取代基和第二取代基取代的四价硫原子团，第二取代基选自由烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基组成的组。

术语“磺酰氨基”被定义为下式氨基原子团

其中R^x15选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；R^x16选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基。

术语“磺酰基”表示被两个氧代取代基和第三取代基取代的六价硫原子团，第三取代基选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

术语“硫代”被定义为含有与二价硫原子连接的取代基的原子团，取代基独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，例如甲硫基和苯硫基。

术语“硫代酰基氨基”表示下式氨基原子团

其中R^x17选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；其中R^x18选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。

术语“硫脲基”被定义为下式硫原子团

其中每个R^x19和R^x20独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；R^x21选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。

三苯甲基是三苯基甲基。

术语“脲基”被定义为下式氮原子团

其中每个R^x21和R^x22独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；R^x23选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。

本发明化合物的盐包括酸加成盐和碱加成盐。在优选的实施方式中，该盐是式I化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”涵盖常用于生成碱金属盐和生成游离酸或游离碱的加成盐的盐。盐的属性不是关键，只要它是药学上可接受的即可。本发明化合物的适合的药学上可接受的酸加成盐可以从无机酸或有机酸制备。这类无机酸的实例非限制性地包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。适当的有机酸可以选自脂族、脂环族、芳族、芳基脂族、杂环、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例非限制性地包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、马来酸、扑酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、甲磺酸、环己氨基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羟基丁酸、丙二酸、半乳酸和半乳糖醛酸。本发明化合物的适合的药学上可接受的碱加成盐包括但不限于从铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制备的金属盐和从N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、赖氨酸和普鲁卡因制备的有机盐。所有这些盐都可以按照常规手段从相应的本发明化合物加以制备，例如将本发明化合物用适当的酸或碱处理。

本发明化合物可以具有一个或多个不对称的碳原子，因而能够存在旋光异构体的形式及其外消旋或非外消旋混合物的形式。本发明化合物可以作为单一的异构体或者作为立体化学异构型的混合物而用在本发明中。非对映异构体、即不可叠加的立体化学异构体可以按照常规手段加以分离，例如色谱、蒸馏、结晶或升华。旋光异构体可以这样获得，按照常规方法拆分外消旋混合物，例如用旋光活性的酸或碱处理以生成非对映异构盐。适当的酸的实例非限制性地包括酒石酸、二乙酰酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲苯甲酰酒石酸和樟脑磺酸。非对映体的混合物可以这样分离，先结晶，再从这些盐中释放旋光活性的碱。可供替代的分离旋光异构体的方法包括使用经过优化选择的手性色谱柱，以最大程度地分离对映体。还有另一种可利用的方法涉及使本发明化合物与光学纯的酸的活化形式或光学纯的异氰酸酯反应合成共价的非对映异构分子。所合成的非对映异构体可以按照常规手段加以分离，例如色谱、蒸馏、结晶或升华，然后水解得到对映体纯的化合物。本发明的旋光活性化合物同样可以利用旋光活性原料而获得。这些异构体可以是游离酸、游离碱、酯或盐的形式。

本发明还涵盖分离的化合物。分离的化合物指在混合物中含有至少10％的化合物，优选为至少20％，更优选为至少50％，最优选为至少80％。在优选的实施方式中，当在常规的生物学测定法中进行试验时，例如本文所述，化合物、其药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物表现可检测的(即统计学上显著的)抗微生物活性。

缩肽化合物

本发明在一方面提供式I化合物

及其盐；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2’-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁶独立地是氢或甲基；

(c)R²是甲基或-CH₂CH₂CH₂R⁸；

(d)R³是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；

(e)R⁴是氢或甲氧基；

(f)R⁵是羟基或碳酰氨基；

(g)每个R⁷、R⁸和R⁹独立地是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

(h)其条件是

(1)若R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸，则R⁷不是

其中R¹⁰是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

(2)若R²是甲基，则R⁷不是

其中每个R¹¹和R¹²是氢、C₆-C₁₈未取代的烷酰基、C₈-C₁₈未取代的烯酰基、C₈-C₁₈未取代的烷基或C₈-C₁₈有选择取代的烷基；或者作为替代选择，R¹¹和R¹²一起是C₈-C₁₈亚烷基。

优选地，R⁷是

其中每个R^aa、R^aa2和R^aa3独立地是氨基酸侧链，其中R¹³是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

在本发明的一种实施方式中，R是2-(2’-氨基苯甲酰甲基)；每个R¹和R⁴是氢；R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸；每个R³和R⁶是甲基；R⁵是羟基。这种实施方式提供式II化合物。

在本发明的另一种实施方式中，R是异丙基或2-丁基；每个R¹和R²是甲基；R³是-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；R⁴是甲氧基；R⁵是碳酰氨基。这种实施方式提供式III化合物

其中R¹⁴是氢或甲基。

表I提供示范性式II化合物。

表I

式II化合物

其中R^7**是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基，每个R^aa4、R^aa5和R^aa6独立地是氨基酸侧链。

表II提供示范性式III化合物。

表II

式III化合物

其中R^7**是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基，每个R^aa4、R^aa5和R^aa6独立地是氨基酸侧链。

中间体

本发明还提供特别可用作式I化合物制备中间体的式IV化合物

及其盐；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2’-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁶独立地是氢或甲基；

(c)R⁴是氢或甲氧基；

(d)R⁵是羟基或碳酰氨基；

(e)R¹⁵是氢、

或

其中：R¹⁸是氨基或羟基；R¹⁹是氢或羟基；R²⁰是碳酰氨基或羧甲基；

(f)R¹⁶是甲基或-CH₂CH₂CH₂R²¹；

(f)R¹⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R²²；

其中每个R²¹和R²²独立地是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

在优选的发明实施方式中，每个R²¹和R²²是-NHR²³，其中R²³是氨基保护基团。在更优选的发明实施方式中，R²³是氨甲酸酯型氨基保护基团，选自烯丙氧基羰基、苄酯基羰基和叔丁氧基羰基。在最优选的实施方式中，R²³是烯丙氧基羰基。

在更优选的实施方式中，本发明提供式V、VI、VII、VIII、IX和X中间体，它们特别可用作式I化合物制备的中间体。

VIII

其中R⁶和R¹⁴是如前面所定义的。

其中R⁶和R¹⁴是如前面所定义的。

其中R⁶和R¹⁴是如前面所定义的。

药物组合物及其使用方法

本发明提供包含式I化合物或其盐的药物组合物或制剂。

可以将本发明化合物、优选式I化合物或其药学上可接受的盐配制成口服、静脉内、肌内、皮下或肠胃外给药的剂型，用于疾病、特别是细菌感染的治疗性或预防性处置。关于口服或肠胃外给药，可以将本发明化合物与常规的药物载体和赋形剂混合，以片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、纸囊剂等形式使用。包含本发明化合物的组合物将含有约0.1至约99重量％的活生化合物，更一般为约10至约30％。

本文所公开的药物制备物是按照标准工艺制备的，并且是按照所选择的剂量给药的，以减少、预防或消除感染(例如参见Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA和Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis ofTherapeutics，Pergamon Press，New York，NY，其内容结合在此作为参考，关于人类疗法中各种抗微生物剂的给药方法的一般说明)。可以利用控制(例如胶囊剂)或持续释放的释放系统(例如生物可侵蚀的基质)释放本发明组合物，优选式I化合物。适合于本发明组合物、优选式I化合物给药的延迟释放的示范性药物释放系统描述在美国专利No.4,452,775(颁给Kent)、5,239,660(颁给Leonard)、3,854,480(颁给Zaffaroni)中。

本发明的药学上可接受的组合物包含一种或多种本发明化合物、优选式I化合物以及一种或多种无毒的、药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或助剂和/或赋形剂，本文统称为“载体”材料，如果需要的话还有其他活性成分。组合物可以含有普通的载体和赋形剂，例如玉米淀粉或明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、磷酸二钙、氯化钠和藻酸。组合物可以含有交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、玉米淀粉、淀粉羟乙酸钠和藻酸。

可以包括的片剂粘合剂是阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。

可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其他金属硬脂酸盐、硬脂酸、硅酮液、滑石、蜡、油和胶体二氧化硅。

还可以使用矫味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。还可能需要加入着色剂，使剂型在外观上更美观或者有助于识别产品。

关于口服使用，固体制剂是特别有用的，例如片剂和胶囊剂。还可以设计持续释放或包肠溶衣的制剂。关于儿科和老年医学应用，混悬剂、糖浆剂和咀嚼片是尤其适合的。关于口服给药，药物组合物例如是片剂、胶囊剂、混悬剂或液体的形式。优选地将药物组合物制成剂量单元的形式，其中含有治疗学上有效量的活性成分。这类剂量单元的实例是片剂和胶囊剂。出于治疗目的，片剂和胶囊剂除了活性成分以外还可以含有常规的载体，例如粘合剂，例如阿拉伯胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、山梨糖醇或黄蓍胶；填充剂，例如磷酸钙、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨糖醇或蔗糖；润滑剂，例如硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅或滑石；崩解剂，例如马铃薯淀粉；矫味剂或着色剂，或可接受的润湿剂。口服液体制剂一般是水性或油性溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，可以含有常规的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水试剂、防腐剂、着色剂和矫味剂。液体制剂添加剂的实例包括阿拉伯胶、杏仁油、乙醇、分馏椰子油、明胶、葡萄糖浆、甘油、氢化食用脂、卵磷脂、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。

关于静脉内(IV)使用，可以将本发明化合物溶解或悬浮在任意常用的静脉内液体中，通过输注给药。静脉内液体非限制性地包括生理盐水或林格氏溶液。静脉内给药可以非限制性地利用注射器、微量泵或静脉内管线加以实现。

肠胃外给药制剂可以是水性或非水性等渗的无菌注射溶液或混悬剂的形式。这些溶液或混悬剂可以从无菌的粉末或颗粒制备，其中含有一种或多种用于口服给药制剂所提到的载体。可以将化合物溶于聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲液。

关于肌内制备物，可以使本发明化合物或该化合物的适合的可溶性盐形式、例如盐酸盐的无菌制剂在药物稀释剂中溶解和给药，例如注射用水(WFI)、生理盐水或5％葡萄糖。可以制备该化合物的适合的不溶性形式，作为在水性基质或药学上可接受的油性基质中的混悬剂给药，油性基质例如长链脂肪酸的酯，例如油酸乙酯。

本发明化合物的一剂静脉内、肌内或肠胃外制剂可以作为药团给药或者通过缓慢输注给药。药团是在不到30分钟内给药的。在优选的实施方式中，药团是在不到15或10分钟内给药的。在更优选的实施方式中，药团是在不到5分钟内给药的。在进而更优选的实施方式中，药团是在一分钟或以下内给药的。输注是按照30分钟或以上的速率进行的。在优选的实施方式中，输注进行一小时或以上。在另一种实施方式中，输注基本上是恒速的。

关于局部使用，还可以将本发明化合物、优选式I化合物制成适合用于皮肤或鼻与咽喉黏膜的剂型，可以采取霜剂、软膏剂、液体喷雾剂或吸入剂、锭剂或咽喉涂剂的形式。这类局部制剂进一步可以包括诸如二甲基亚砜(DMSO)等化合物，以促进活性成分的表面渗透。

关于眼睛或耳朵用药，本发明化合物、优选式I化合物可以呈液体或半液体的形式，在疏水性或亲水性基质中配制成软膏剂、霜剂、洗剂、涂剂或粉剂。

关于直肠给药，本发明化合物、优选式I化合物可以以栓剂的形式给药，其中混合有常规的载体，例如可可脂、蜡或其他甘油酯。

作为替代选择，本发明化合物、优选式I化合物可以是粉末状，在释药之时再生在适当的药学上可接受的载体中。在另一种实施方式中，化合物的单位剂型可以是该化合物或优选为它的盐在适合的稀释剂中的溶液，盛放在无菌的、密封的安瓿或无菌的注射器内。化合物在单位剂量中的浓度例如可以从约1％至约50％不等，这由医师根据所用的化合物及其溶解度和所需的剂量加以确定。如果组合物含有剂量单元，那么每个剂量单元优选地含有1-500mg活性材料。关于成人治疗，所采用的剂量优选地从5mg至10g每天，这取决于给药的途径和频率。

本发明在另一方面提供抑制微生物、优选细菌的生长的方法，包含使所述生物与本发明化合物在允许该化合物进入所述生物和所述微生物的条件下接触。这类条件是本领域技术人员已知的，例举在实施例中。这种方法牵涉使微生物细胞与治疗学上有效量的本发明化合物、优选式I化合物在体内或体外接触。

按照这方面发明，将本文所公开的新组合物置于药学上可接受的载体中，按照已知的药物释放方法释放给受治疗者(优选人)。一般而言，用于体内释放本发明组合物的本发明方法采用本领域公认的药物释放方案，唯一的实质性工艺改变在于用本发明化合物、优选式I化合物取代本领域公认的方案中的药物。同样，使用所要求保护的组合物处理培养物中的细胞例如以消除或减少细胞培养物的细菌污染水平的方法采用本领域公认的用抗菌剂处理细胞培养物的方案，唯一的实质性工艺改变在于用本发明化合物、优选式I化合物取代本领域公认的方案中的药物。

在一种实施方式中，本发明提供用治疗学上有效量的本发明化合物治疗受治疗者的感染、尤其是由革兰氏阳性菌所导致的那些的方法。用于释放抗菌剂的示范性工艺描述在美国专利No.5,041,567和PCT专利申请No.EP 94/02552(公开号WO 95/05384)中，这些文献的完整内容全部结合在此作为参考。本文所用的措辞“治疗学上的有效量”表示本发明化合物预防细菌感染的发作、减轻其症状或终止其进展的量。术语“治疗”被定义为对受治疗者给以治疗学上有效量的本发明化合物，既预防感染的发生，也控制或消除感染。本文所描述的术语“受治疗者”被定义为哺乳动物、植物或细胞培养物。在优选的实施方式中，受治疗者是需要抗菌治疗的人或其他动物患者。

该方法包含对受治疗者给以有效剂量的本发明化合物。有效的剂量一般在约0.1与约100mg/kg本发明化合物或其药学上可接受的盐之间。优选的剂量从约0.1至约50mg/kg本发明化合物或其药学上可接受的盐。更优选的剂量从约1至约25mg/kg本发明化合物或其药学上可接受的盐。对细胞培养物有效的剂量通常在0.1与1000μg/mL之间，更优选地在0.1与200μg/mL之间。

含有本发明化合物的组合物可以作为单一每日剂量给药或者每天分多次剂量给药。治疗制度可能需要长期给药，例如若干天或者二至四周。每次给药的剂量或总的给药量将取决于这样的因素，例如感染的性质与严重性、患者的年龄与一般健康状况、患者对化合物的耐药性和牵涉在感染中的一种或几种微生物。缩肽化合物类的另一成员达托霉素对患者给药的方法公开在1999年9月24日提交的美国专利申请No.09/406,568中，该申请要求保护1998年9月25日提交的美国临时申请No.60/101,828和1999年3月24日提交的美国临时申请No.60/125,750的利益，其内容结合在此作为参考。

还可以将本发明化合物在患者饮食或动物饲料中给药。如果作为总的饮食摄取的一部分给药，那么所采用的化合物的量可以小于饮食重量的1％，优选地不超过0.5重量％。动物饲料可以是正常的食物，可以向其中或者向预混合物中加入化合物。

本发明还提供将式I化合物或其药物组合物按有效减少或消除细菌感染的量对需要它们的受治疗者给药的方法。化合物的给药方式可以是口服、肠胃外、吸入、局部、直肠、鼻、颊、阴道或植入的药库、外泵或导管。可以将化合物制成眼用的或雾化的形式。本发明化合物可以作为气雾剂给药，用于治疗肺炎或其他肺类感染。优选的气雾剂释放载体是无水或干粉吸入剂。还可以将式I化合物或其药物组合物直接注射或给药到脓肿、室或关节内。肠胃外给药包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、池的、鞘内、肝内、损伤内和颅内注射或输注。在优选的实施方式中，式I化合物是静脉内、皮下或口服给药的。在将式I化合物对细胞培养物给药的优选实施方式中，可以将化合物在营养培养基中给药。

本发明的方法可以用于治疗患有细菌感染的受治疗者，其中该感染是由任意类型的细菌、特别是革兰氏阳性细菌所导致或恶化的。在一种实施方式中，将本发明化合物或其药物组合物按照本发明的方法对患者给药。在优选的实施方式中，该细菌感染是由革兰氏阳性细菌所导致或恶化的。这些革兰氏阳性细菌包括但不限于甲氧西林易感性与甲氧西林耐药性葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌和凝固酶-阴性葡萄球菌)、糖肽介导易感性金黄色葡萄球菌(GISA)、万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌(VRSA)、青霉素易感性与青霉素耐药性链球菌(包括肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、鸟链球菌、牛链球菌、乳酸链球菌、血链球菌和C族链球菌、G族链球菌和绿色链球菌)、肠球菌(包括万古霉素易感性与万古霉素耐药性菌株，例如粪肠球菌和屎肠球菌)、艰难梭状芽孢杆菌、梭形梭状芽孢杆菌、无害梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、多枝梭状芽孢杆菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李司忒氏菌、杰氏棒状杆菌、双歧杆菌、产气真杆菌、迟缓真杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、小球菌、厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、大消化链球菌、小消化链球菌、普氏消化链球菌、产生消化链球菌、痤疮丙酸杆菌、放线菌、摩拉克氏菌(包括黏膜炎摩拉克氏菌)和埃希氏杆菌(包括大肠杆菌)。

在优选的实施方式中，式I化合物在体外实验中对典型“耐药性”菌株的抗菌活性相当于对典型“易感性”菌株的抗菌活性。在另一种优选的实施方式中，根据本发明的化合物对易感性菌株的最小抑制浓度(MIC)值通常等于或低于万古霉素。因而在优选的实施方式中，将本发明化合物或其药物组合物按照本发明的方法对表现耐受其他化合物、包括万古霉素或达托霉素的细菌感染的患者给药。另外，与糖肽抗生素不同，缩肽化合物对革兰氏阳性生物表现快速的、浓度依赖性杀菌活性，例如本发明所公开的那些。因而在优选的实施方式中，将根据本发明的化合物或其药物组合物按照本发明的方法对需要快速实行抗生素疗法的患者给药。

本发明的方法可以用于机体任意器官或组织的任意细菌感染。在优选的实施方式中，该细菌感染是由革兰氏阳性细菌所导致的。这些器官或组织非限制性地包括骨骼肌、皮肤、血流、肾、心、肺和骨。本发明的方法可以用于非限制性地治疗皮肤与软组织感染、菌血症和尿道感染。本发明的方法可以用于治疗公众获得性呼吸感染，非限制性地包括中耳炎、窦炎、慢性支气管炎和肺炎，包括由耐药性肺炎链球菌或流感嗜血杆菌导致的肺炎。本发明的方法还可以用于治疗混合感染，包含不同类型的革兰氏阳性细菌，或者包含革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌。这些类型的感染包括腹内感染和产科/妇科感染。本发明的方法还可以用于治疗这样的感染，非限制性地包括心内膜炎、肾炎、脓毒性关节炎、腹内脓毒症、骨与关节感染和骨髓炎。在优选的实施方式中，任意上述疾病都可以用根据本发明的化合物或其药物组合物加以治疗。

在实施本发明方法的同时，还可以给以一种或多种其他抗微生物剂，例如抗细菌剂(抗生素)或抗真菌剂。一方面，在实施该方法时可以给以一种以上根据本发明的化合物。在另一种实施方式中，在实施该方法时可以给以根据本发明的化合物与一种脂肽化合物，例如达托霉素或者例如描述在国际专利申请WO 01/44272、WO 01/44274和WO 01/44271中的脂肽化合物。

可以与根据本发明的化合物共同给药的抗细菌剂及其分类非限制性地包括青霉素类与有关药物、碳青霉素烯类、头孢菌素类与有关药物、氨基苷类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、夫西地酸钠、林可霉素、克林霉素、大环内酯类、新生霉素、多粘菌素类、利福霉素类、壮观霉素、四环素类、万古霉素、替考拉宁、链阳性菌素、抗叶酸剂，包括磺胺类、甲氧苄啶及其组合和乙胺嘧啶，合成的抗菌剂，包括硝基呋喃类、扁桃酸乌洛托品和马尿酸乌洛托品，硝基咪唑类、喹诺酮类、氟喹诺酮类、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对-氨基水杨酸(PAS)、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、氨硫脲、紫霉素、everninomycin、糖肽、glycylcylcline、ketolides、_唑烷酮；亚胺培南、阿米卡星、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲松、Ziracin、LY 333328、CL 331002、HMR 3647、Zyvox_、Synercid_、氨曲南和甲硝唑、依匹曾林、OCA-983、GV-143253、Sanfetrinem钠、CS-834、比阿培南、A-99058.1、A-165600、A-179796、KA 159、Dynemicin A、DX 8739、DU 6681；Cefluprenam、ER 35786、Cefoselis、Sanfetrinem celexetil、HGP-31、头孢匹罗、HMR-3647、RU-59863、Mersacidin、KP 736、Rifalazil；AM 1732、MEN 10700、Lenapenem、BO 2502A、NE-1530、PR 39、K 130、OPC 20000、OPC 2045、Veneprim、PD 138312、PD 140248、CP 111905、硫培南、利替培南acoxyl、RO-65-5788、Cyclothialidine、Sch-40832、SEP-132613、micacocidin A、SB-275833、SR-15402、SUN A0026、TOC 39、卡芦莫南、头孢唑兰、头孢他美新戊酰氧甲酰和T 3811。

可以与根据本发明的化合物共同给药的抗真菌剂非限制性地包括Caspofungen、Voriconazole、舍他康唑、IB-367、FK-463、LY-303366、Sch-56592、Sitafloxacin、DB-289、多烯类，例如两性霉素、制霉菌素、Primaricin；唑系，例如氟康唑、伊曲康唑和酮康唑；烯丙胺类，例如萘替芬和特比奈芬；和抗代谢产物，例如氟胞嘧啶。其他抗真菌剂非限制性地包括公开在Fostel等Drug Discovery Today 5：25-32(2000)中的那些，结合在此作为参考。Fostel公开的抗真菌化合物包括Corynecandin、Mer-WF3010、Fusacandins、Artrichitin/LL15G256、Sordarins、Cispentacin、Azoxybacillin、Aureobasidin和Khafrefungin。

可以将根据本发明的化合物按照本方法给药直至根除或减少细菌感染。在一种实施方式中，将式I化合物给药2天至6个月。在优选的实施方式中，将式I化合物给药7至56天。在更优选的实施方式中，将式I化合物给药7至28天。在进而更优选的实施方式中，将式I化合物给药7至14天。可以将式I化合物给药更长或更短的时间，如果需要这么做的话。

新颖的缩肽的制备

1.半合成过程

式I化合物的制备过程，其中R²和R³至少有一个不是甲基，每个R⁸和R⁹独立地是NH₂。

工艺A

关于其中R²和R³至少有一个不是甲基、每个R⁸和R⁹独立地是NH₂的式I化合物，制备过程按照本发明的一个方面包含下列步骤：

(a)提供式XI缩肽衍生物

其中：R、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁸、R¹⁹和R²⁰是如前面所述的；R²⁵是烷基；R²⁶是甲基或-CH₂CH₂CH₂NH₂；R²⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂；或其盐；

(b)将式XI化合物的游离氨基用保护基团保护起来，得到被保护的缩肽化合物；

(c)将(b)中所得被保护的缩肽化合物用脱酰剂处理，得到末端氨基化合物；

(d)除去(c)中所得末端氨基化合物的色氨酸氨基酸残基，得到脱色氨酸化合物；

(e)除去(d)中所得脱色氨酸化合物的末端氨基酸残基，得到缩肽化合物；

(f)除去(e)中所得缩肽化合物的末端氨基酸残基，得到缩肽核心化合物；

(g)将(f)的缩肽核心化合物用改性剂处理；

(h)从被保护的式I化合物中除去保护基团，得到式Ia化合物。

工艺A阐述在流程I中。

流程I(续)

流程I(续)

半合成过程按照本发明的一个方面包含提供式XI化合物(步骤(a))。式XI化合物可以借助下列文献所公开的方法获得：美国专利RE 32,333；RE 32,455；RE 32,311；4,482,487；4,537,717；4,800,157；4,874,843；4,885,243；5,912,226；4,994,270；5,039,789；5,028,590国际专利申请No.WO 01/44272，WO 01/44274，WO 01/44271，WO 01/53330，WO 02/059,322，它们各自结合在此作为参考。

在优选的实施方式中，式XI化合物是这样的，其中每个R¹和R⁴是氢；每个R³和R⁶是甲基；R⁵是羟基；R²⁵是7-甲基壬基、9-甲基癸基、9-甲基十一烷基、壬基、癸基或它们的混合物；R²⁶是-CH₂CH₂CH₂NH₂。

在另一种优选的实施方式中，式XI化合物是这样的，其中R是异丙基或2-丁基；每个R¹和R²是甲基；R⁴是甲氧基；R⁵是碳酰氨基；R²⁵是8-甲基壬酰基、正癸酰基或8-甲基癸酰基；R²⁷是-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂。

将式XI化合物的游离胺用保护基团处理，得到式XII被保护的缩肽化合物(步骤(b))，其中：R、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁸、R¹⁹、R²⁰和R²⁵是如上所述的；R²⁸是甲基或-CH₂CH₂CH₂NHP；R²⁹是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NHP；其中P是氨基保护基团或其盐。

氨基保护基团的实例和用所述基团保护胺的方法可以参见Protective Groups in Organic Synthesis by Theodora W.Greene，(New York：John Wiley and Sons，Inc.)，1981，以下称为″Greene″，结合在此作为参考。优选的氨基保护基团是氨甲酸酯型氨基保护基团。更优选的氨基保护基团是烯丙氧基羰基(alloc)、苄酯基(CBZ)和叔丁氧基羰基保护基团。最优选的氨甲酸酯型氨基保护基团是烯丙氧基羰基。保护达托霉素、A54145和相关脂肽的胺的方法可以参见美国专利RE 32,310；RE 32,311；4,482,487；4,524,135；4,537,717；5,039,789；5,028,590；和国际专利申请WO 01/44272，WO 01/44274，WO 01/44271。

然后将被保护的缩肽化合物用脱酰剂处理，生成式XIII末端氨基化合物(步骤(c))。适合于本发明的脱酰剂是酶类脱酰剂。可用于式XII化合物脱酰作用的酶是由幅动菌科某些微生物产生的。该科一些已知的种类和变体包括菲律宾游动放线菌、亚美尼亚游动放线菌、犹他游动放线菌、密苏里游动放线菌、微白螺孢菌、粉红链孢囊菌、普通链孢囊菌、粉红链孢囊菌荷兰变种、白色链孢囊菌、绿白链孢囊菌、橙色无定形孢囊菌、规则瓶孢囊菌、钟形瓶孢囊菌、叶状瓶孢囊菌、指瓶孢囊菌、圆囊水生角质菌、环列水生角质菌、排孢游动单孢、委内瑞拉游动单孢、长孢游动双孢、玫瑰色游动双孢、桔橙指孢囊菌和泰国指孢囊菌。

在本发明中可以使用所有从幅动菌科得到的并且产生酶的天然与人工变体和突变体。

优选的脱酰作用酶来源是犹他游动放线菌NRRL 12052、密苏里游动放线菌NRRL 12053、游动放线菌NRRL 8122、游动放线菌NRRL 12065、粉红链孢囊菌荷兰变种NRRL 12064、犹他游动放线菌ATCC 14539和密苏里游动放线菌ATCC 14538。更优选的脱酰作用酶来源是犹他游动放线菌。最优选的脱酰作用酶来源是从重组变青链霉菌产生的，它表达犹他游动放线菌脱酰作用酶，如J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2000，24(3)173-180所述。该酶已知也称棘白菌素B脱酰酶或ECB脱酰酶。

适合于式XII化合物的酶脱酰作用的方法可以参见美国专利4,524,135；4,537,717；4,482,487；RE 32,310；RE 32,311；5,039,789；5,028,590；和国际专利申请WO 01/44272；WO 01/44274；WO 01/44271，各自结合在此作为参考。

从式XIII末端氨基化合物中除去色氨酸氨基酸残基引起式XIV化合物的生成(步骤(d))。除去色氨酸氨基酸残基的方法是本领域技术人员已知的。优选的除去色氨酸氨基酸残基的方法是在埃德曼降解条件下。

埃德曼降解是本领域技术人员已知的成熟反应(例如参见P.Edman，1950，Acta Chem.Scan.4：283-93；P.Edman，1956，ActaChem.Scan.10：761-768)。在这种反应中，肽的末端NH₂基与异硫氰酸酯反应，生成肽的硫脲衍生物。一经酸或碱的处理，硫脲肽经历环化反应，得到乙内酰硫脲和更短的肽(见流程II)。

流程II

其中R³⁰、R³¹和R³²各自是氨基酸侧链；R³³是芳基或烷基。

埃德曼降解可以在多种条件下进行。在埃德曼降解顺序的第一步中，在溶剂中，例如四氢呋喃、N，N’-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二_烷或乙醇，异硫氰酸酯与胺在中性至弱碱性(pH＜9.5)条件下反应。可以使用多种异硫氰酸酯(K.K.Han et al.Biochemie 1977，59：557-576)。

随后的环化和裂解可以在多种条件下完成。通常使用无水三氟乙酸、七氟丁酸(例如参见W.F.Brandt et al.，1976，Z.Physiol.Chem.357：1505-1508)或浓盐酸(例如参见G.E.Tarr，1977，Methods in Enzymology，47：335-337)。还可以使用弱碱性条件，例如三乙胺或N，N-二甲基烯丙胺/乙酸(pH～9)(G.C.Barrett etal.，1985，Tetrahedron Letters 26(36)：4375-4378)。关于该反应的评述，参见K.K.Han，1985，Int.J.Biochem 17(4)：429-445。

在优选的实施方式中，在酸性条件下处理由异硫氰酸酯与式XIII化合物的反应所生成的硫脲肽(式XVIII化合物)，得到式XIV化合物。在更优选的发明实施方式中，将式XVIII化合物用三氟乙酸处理，得到式XIV化合物(流程III)。

流程III

其中每个R、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁸、R¹⁹、R²⁰、R²⁸、R²⁹和R³³是如上所述的。

在优选的实施方式中，R³³是苯基、正癸基、壬基或辛基。在更优选的实施方式中，R³³是正癸基。

从式XIV化合物中除去末端氨基酸残基引起式XV缩肽化合物的生成(步骤(e))。除去末端氨基酸残基的方法是本领域技术人员已知的。优选的除去末端氨基酸残基的方法是在埃德曼降解条件下(参见上文)。

在优选的实施方式中，在酸性条件下处理由异硫氰酸酯与式XIV化合物的反应所生成的硫脲肽(式XIX化合物)，得到式XV缩肽化合物。在优选的发明实施方式中，将式XIX化合物用三氟乙酸处理，得到式XV化合物(流程IV)。

流程IV

其中每个R、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁸、R¹⁹、R²⁰、R²⁸和R²⁹是如上所述的；R³⁴是烷基或芳基。

从式XV化合物中除去末端氨基酸残基引起式XVI缩肽核心化合物的生成(步骤(f))。除去末端氨基酸残基的方法是本领域技术人员已知的。优选的除去末端氨基酸残基的方法是在埃德曼降解条件下(参见上文)。

在优选的实施方式中，在酸性条件下处理由异硫氰酸酯与式XV化合物的反应所生成的硫脲肽(式XX化合物)，得到式XVI缩肽核心化合物。在优选的发明实施方式中，将式XX化合物用三氟乙酸处理，得到式XVI化合物(流程IV A)。

流程IV A

其中每个R、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁸、R¹⁹、R²⁰、R²⁸和R²⁹是如上所述的；R³⁵是烷基或芳基。

将式XVI缩肽核心化合物用改性剂处理，导致被保护的式I化合物的生成(式XVII化合物，步骤(f))。胺与如本文所定义的改性剂的反应是本领域技术人员熟知的。例如，将式XVI化合物用异氰酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是脲基。类似地，将式XVI化合物用活化酯、内酯或酰氯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是酰基氨基。将式XVI化合物用磺酰氯或活化磺酰胺处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是磺酰氨基。将式XVI化合物用活化杂环处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是杂环氨基。将式XVI化合物用活化杂芳基化合物处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是杂芳基氨基。将式XVI化合物用碳酸酯、氯甲酸酯或氰基甲酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是氨甲酰基。将式XVI化合物用硫代酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是硫代酰基氨基。将式XVI化合物用磷酰氯或氨基磷酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是膦酰氨基。将式XVI化合物用亚氨酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是亚氨基氨基。将式XVI化合物用硫代异氰酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是硫脲基。将式XVI化合物用醛或酮在还原条件下处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是单取代的氨基或二取代的氨基。将式XVI化合物用亚氨酸酯处理，得到式XVII化合物，其中R⁷是亚氨基氨基。将式XVI化合物用胍基化剂处理，例如

得到式XVII化合物，其中R⁷是胍基。

将被本领域技术人员所理解的是，如果改性剂含有与生成式XVII化合物的反应条件不相容的取代基，那么将不得不在用于反应之前保护所述取代基。适合的保护基团和制备它们的方法可以参见Greene(参见上文)。

复杂分子的胺、例如达托霉素和相关缩肽的反应可以参见美国专利4,399,067；4,482,487；4,537,717；5,039,789；5,028,590；和国际专利申请WO 01/44272，WO 01/44274，WO 01/44271。

在优选的反应实施方式中，改性剂是活化酯。在更优选的反应实施方式中，改性剂是

其中R^aa1、R^aa2和R^aa3是氨基酸侧链或氨基酸侧链的被保护形式；R³⁶是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基；X是活化基团。在进而更优选的实施方式中，X是芳氧基。在进而更优选的实施方式中，X是五氟苯氧基。

式XXI、XXII和XXIII化合物可以这样制备，将对应的肽或氨基酸用活化剂处理，例如酸酐、氯甲酸酯、五氟苯酚/二环己基碳二亚胺、N’，N’-羰基二咪唑、羟基苯并三唑或N-羟基琥珀酰亚胺。肽可以借助任意标准肽工艺加以制备。关于一些标准肽生成工艺的评述，参见Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry，5th Ed.eds.B.S.Furniss，A.J.Hannaford；P.W.G.Smith；A.R.Tatchell(New York：John Wiley and Sons，Inc.)，1989，pp 750-763和Introduction to Organic Chemistry，2nd Ed.by A.Streitwieser，Jr.and C.H.Heathcock(New York：MacMillan Publishing Co.，Inc.)，pp 954-962。其他可用于制备本发明肽的方法牵涉在固体载体上的合成。这类工艺的具体实例在实施例中有详细描述(参见下文)。

从被保护的式I化合物(式XVII化合物)中除去保护基团，导致式Ia化合物的生成(步骤(h))，其中R¹、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷是如上所述的；R^2a是甲基或-CH₂CH₂CH₂NH₂；R^3a是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂。氨基保护基团的除去可以按照Greene所述工艺来完成(参见上文)。正如本领域技术人员将认识到的，用在该过程第一步中的氨基保护基团的选择将决定用于除去所述氨基保护基团的试剂和工艺。

当改性剂含有一个或多个保护基团时，所述保护基团也必须被除去。用于改性剂取代基的保护基团的选择将决定用于除去所述保护基团的试剂和工艺。当用于改性剂取代基的保护基团与用在步骤(b)中的保护基团是相容的，可以在单一步骤中除去保护基团。不过，当保护基团是不相容的，可能需要多个步骤来除去所有保护基团。

式I化合物的制备过程，其中R²和R³至少有一个不是甲基，每个R⁸和R⁹不是NH₂。

工艺B

关于其中R²和R³至少有一个不是甲基、每个R⁸和R⁹不是NH₂的式I化合物，制备过程按照本发明的另一方面包含下列步骤：

(i)将工艺A步骤(h)的式I游离胺化合物用改性剂处理，得到式I化合物。

用改性剂处理式Ia的式I游离胺化合物是本领域技术人员熟知的，描述在工艺A步骤(g)中(参见上文)。

复杂分子的游离胺、例如达托霉素和相关缩肽的反应可以参见美国专利4,399,067；4,482,487；4,537,717；和国际专利申请WO01/44272，WO 01/44274，WO 01/44271。

将被本领域技术人员所理解的是，如果R⁷或步骤(i)的改性剂含有与生成式I化合物的反应条件不相容的取代基，那么将不得不在步骤(i)之前保护所述取代基。适合的保护基团和制备它们的方法可以参见Greene(参见上文)。

当R⁷和步骤(i)的改性剂含有保护基团时，可以除去所述保护基团。用于R⁷和改性剂取代基的保护基团的选择将决定用于除去所述保护基团的试剂和工艺。当用于R⁷和改性剂取代基的保护基团是相容的，可以在单一步骤中除去保护基团。不过，当保护基团是不相容的，可能需要多个步骤来除去所有保护基团。

工艺C

制备式I化合物的替代工艺包含下列步骤，其中R³和R³至少有一个不是甲基、每个R⁸和R⁹不是NH₂：

(a)提供式XI缩肽衍生物：

其中：R、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁸、R¹⁹、R²⁰、R²⁵、R²⁶和R²⁷是如上所述的；

(b)将式XI化合物的游离氨基用改性剂处理，得到被封阻的缩肽化合物，其中所述改性剂是这样选择的，以便所生成的被封阻的缩肽化合物对步骤(c)、(d)、(e)、(f)和(g)都是稳定的；

(c)将(b)中所得被封阻的缩肽化合物用脱酰剂处理，得到末端氨基化合物；

(d)除去(c)中所得末端氨基化合物的色氨酸氨基酸残基，得到脱色氨酸化合物；

(e)除去(d)中所得脱色氨酸化合物的末端氨基酸残基，得到缩肽化合物；

(f)除去(e)中所得缩肽化合物的末端氨基酸残基，得到缩肽核心化合物；

(g)将(f)的缩肽核心化合物用改性剂处理。

工艺C描述在流程V中。

流程V(续)

将式XII化合物用改性剂处理，导致被封阻的式I化合物的生成(式XXIV化合物，步骤(b))，其中R³⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂R⁸；R³⁸是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；其条件是R³⁷和R³⁸至少有一个必须不是甲基，R⁸和R⁹必须不是氨基。被封阻的式I化合物的生成是如上工艺A步骤(g)所述进行的(参见上文)。

化合物XXIV的脱酰作用引起末端氨基化合物XXV的生成。适合于式XXIV化合物脱酰作用的试剂是酶类脱酰剂(参见上文)。

从式XXV末端氨基化合物中除去色氨酸氨基酸残基，引起式XXVI化合物的生成(步骤(d))。除去色氨酸氨基酸残基的方法是本领域技术人员已知的。优选的除去色氨酸氨基酸残基的方法是在埃德曼降解条件下(参见上文)。

从式XXVI化合物中除去末端氨基酸残基，引起式XXVII缩肽化合物的生成(步骤(e))。除去末端氨基酸残基的方法是本领域技术人员已知的。优选的除去末端氨基酸残基的方法是在埃德曼降解条件下(参见上文)。

从式XXVII化合物中除去末端氨基酸残基，引起式XXVIII缩肽核心化合物的生成(步骤(f))。除去末端氨基酸残基的方法是本领域技术人员已知的。优选的除去末端氨基酸残基的方法是在埃德曼降解条件下(参见上文)。

用改性剂处理式XXVIII缩肽化合物是本领域技术人员熟知的，是如工艺A步骤(g)所述的(参见上文)。

将被本领域技术人员所理解的是，如果改性剂含有与生成式I化合物的反应条件不相容的取代基，那么必须在与式XXVIII化合物反应之前保护所述取代基。适合的保护基团和制备它们的方法可以参见Greene(参见上文)。

在需要时可以除去保护基团。当保护基团是相容的，可以在单一步骤中除去保护基团。不过当保护基团是不相容的，可能需要多个步骤来除去所有保护基团。

工艺D

式I化合物和式Ia化合物，其中R⁷是

其中每个R¹⁸、R¹⁹和R²⁰是如上所述的，R³⁹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基，

可以如流程VI所述从化合物XIII制备，或者如流程VII所述从化合物XXV制备。

流程VI

流程VII

工艺E

类似地，式I化合物和式Ia化合物，其中R⁷是

其中每个R¹⁸、R¹⁹和R²⁰是如上所述的，R³⁹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基，

可以如流程VIII所述从化合物XIV制备，或者如流程IX所述从化合物XXVI制备。

流程IX

工艺F

类似地，式I化合物和式Ia化合物，其中R⁷是

其中每个R¹⁸和R¹⁹是如上所述的，R³⁹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基，

可以如流程X所述从化合物XV制备，或者如流程XI所述从化合物XXVII制备。

流程XI

2.合成过程

缩肽化合物的固体载体合成

在替代的发明实施方式中，可以在固体载体上合成式I缩肽化合物(流程XII、流程XIII和流程XV)。

流程XII

步骤1中，使N-保护的-β-甲基谷氨酸-O-烯丙基酯或保护的谷氨酸-O-烯丙基酯与树脂偶联，得到化合物101，其中R⁶是如上所述的。在该反应中可以使用树脂或固体载体，例如但不限于Wang、HMPA、Safety Catch、Rink Acid、2-氯三苯甲基氯树脂、三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂或PAM树脂。

化合物101的去保护、继之以游离氨基与被保护的丝氨酸或被保护的天冬酰胺偶联，得到化合物102，其中R⁴⁰是-OP²或-CONHP³；每个P、P¹、P²和P³独立地是保护基团。重复这种肽偶联过程，也就是α-氨基的去保护、继之以与被保护的氨基酸偶联，直至所需数量的氨基酸已被偶联到树脂上。在流程XII中，已经偶联了总计七个氨基酸，得到化合物103，其中A³是

A⁴是

其中P⁴是保护基团，R⁴是如上所述的；

A⁵是

其中R⁴⁴是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NP⁵，其中P⁵是氨基保护基团；

A⁶是

其中P⁶是保护基团；

A⁷是

其中R⁴⁵是甲基或-CH₂CH₂CH₂NP⁷，其中P⁷是氨基保护基团。按相似的方式使第二个碳与树脂偶联，如流程XIII所述。

流程XIII

步骤1中，使N-保护的-甘氨酸或肌氨酸与树脂偶联，得到化合物104，其中R¹是如上所述的，P⁸是氨基保护基团。用在步骤1中的树脂的选择依赖于在步骤2-6中偶联的氨基酸的属性。如果氨基酸侧链含有保护基团，那么树脂必须是这样选择的，以便当在步骤7中从肽上除去树脂时，保护基团保持完整。能够被裂解、同时保留肽保护基团的树脂包括但不限于Safety Catch、Rink Acid、2-氯三苯甲基氯树脂、三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂或PAM树脂。

被保护的化合物104氨基的去保护、继之以游离氨基与

的偶联，得到化合物105，其中R⁴¹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

当R⁴¹是氨基时，重复这种肽偶联过程，也就是α-氨基的去保护、继之以与被保护的氨基酸偶联，直至所需数量的氨基酸已被偶联到树脂上。在流程XIII中，已经偶联了五个氨基酸，得到化合物108，其中A⁸是

其中R⁴⁶是氢、氨基酸侧链或被保护的氨基酸侧链；

A⁹是

其中R⁴⁷是氢、氨基酸侧链或被保护的氨基酸侧链；

A¹⁰是

其中R⁴⁸是氢、氨基酸侧链或被保护的氨基酸侧链，R⁴⁹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

使化合物108与

偶联，得到化合物111，其中P⁹是保护基团，R⁴²是2-丁基、异丙基或

其中R⁴³是能够转化为氨基的基团。例如，R⁴³可以是叠氮基、被保护的氨基苯二甲酰亚氨基或硝基。

然后从树脂上除去肽111，得到化合物112。

肽片段103与112的偶联概述在流程XIV中。

流程XIV

使肽片段103与112偶联，得到与树脂结合的肽113。P⁹保护基团和O-烯丙基酯的去保护、继之以环化作用，得到与树脂结合的缩肽114。从树脂上裂解缩肽、继之以任何剩余保护基团的去保护，得到式I化合物(流程XVI)。

当需要不存在环外氨基酸的式I化合物时，可以使用化合物105代替化合物108(流程XV)。使化合物105与化合物110偶联，得到化合物115；从树脂上除去，得到化合物116；与化合物103偶联，得到化合物117；然后去保护和环化，得到与树脂结合的缩肽(118)，再从树脂上裂解，如前面流程XIII和XIV所述(参见上文)。

流程XV

当需要存在一个环外氨基酸的式I化合物时，可以使用化合物106代替化合物108(流程XVII)。使化合物106与化合物110偶联，得到化合物119；从树脂上除去，得到化合物120；与化合物103偶联，得到化合物121；然后去保护和环化，得到与树脂结合的缩肽(122)，再从树脂上裂解，如前面流程XIII和XIV所述(参见上文)。

流程XVII

当需要存在两个环外氨基酸的式I化合物时，可以使用化合物107代替化合物108(流程XVIII)。使化合物106与化合物110偶联，得到化合物123；从树脂上除去，得到化合物124；与化合物103偶联，得到化合物125；然后去保护和环化，得到与树脂结合的缩肽(126)，再从树脂上裂解，如前面流程XIII和XIV所述(参见上文)。

流程XVIII

在上述合成流程(流程XII-XVII)之后，可以理解的是氨基酸氨基和氨基酸侧链官能团都必须在与成长中的肽链连接之前被正交保护起来。适合的保护基团可以是任何可用于肽合成的氨基保护基团。这类保护基团对是熟知的。例如参见Novabiochem Catalog and Peptide SynthesisHandbook中的“合成注释”(1999)，p.SS1-S93和其中引用的参考文献。

也将为本领域技术人员所理解的是，氨基酸侧链官能团上保护基团的选择将导致或者不导致伴随最终从树脂上裂解肽而裂解保护基团，这将分别得到天然的氨基酸官能度或其被保护的衍生物。若在从树脂上裂解缩肽时没有伴随裂解保护基团，则另外的去保护作用可能是必要的。

3.生物合成过程

本发明的化合物还可以借助重组方法加以制备。在这种过程中，向能够产生式I化合物的细胞引入经过修饰的达托霉素非核糖体肽合成酶，培养该细胞，生成式I化合物。达托霉素非核糖体肽合成酶以及这些合成酶的修饰都已有报道(参见国际专利申请No.02/059,322)。

为了更充分地理解本发明，提供下列实施例。这些实施例仅供举例说明，决不被解释为限制发明范围。

实施例1：肽树脂化合物1的合成

反应1

向商业上可得到的甘氨酸2-氯三苯甲基树脂(334mg)加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-苏氨酸(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将混合物摇动1小时，过滤，利用标准Kaiser试验测试几粒珠粒是否存在游离胺(E.Kaiser，et al(1970)Anal.Biochem.，34，595；and AdvancedChemtech Handbook of Combinatorial，Organic and PeptideChemistry 2003-2004 page 208)。Kaiser试验显蓝色，因此重复上述偶联条件。过滤后，将携带产物的树脂用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物2。

反应2

将化合物2在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物3。

反应3

向化合物3加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁酯(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将混合物摇动1小时，过滤，重复偶联条件。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物4。

反应4

将化合物4在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物5。

反应5

向树脂5加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬酰胺δ-N-三苯甲基(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5molN-甲基吡咯烷溶液)。将混合物摇动1小时，过滤，重复偶联条件。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物6。

反应6

将化合物6在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物7。

反应7

向树脂中加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5molN-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将混合物摇动1小时，过滤，重复偶联条件。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物8。

反应8

将化合物8在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到树脂肽化合物1。

实施例2：肽树脂化合物9的合成

反应1

向商业上可得到的4-羟甲基苯氧基树脂(Wang树脂)(5g，0.4mmol/g)的二氯甲烷(60ml)悬液加入1，3-二异丙基碳二亚胺(0.940ml)、4-二甲氨基吡啶(含24mg的N-甲基吡咯烷(1ml))和商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-谷氨酸α-烯丙酯(含2.46g的N-甲基吡咯烷(9ml))。将反应混合物搅拌16小时，过滤，将固体用N-甲基吡咯烷和二氯甲烷洗涤，干燥，得到化合物10。

反应2

将化合物10(526mg)在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物11。

反应3

向树脂11加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-丝氨酸叔丁醚(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将反应混合物摇动1小时，然后过滤，重复偶联。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物12。

反应4

将化合物12在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物13。

反应5

向树脂13加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-甘氨酸(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5molN-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将反应混合物摇动1小时，然后过滤，重复偶联。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物14。

反应6

将化合物14在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物15。

反应7

向树脂15加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁酯(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将反应混合物摇动1小时，过滤，重复偶联。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物16。

反应8

将化合物16在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物17。

向树脂17加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-丙氨酸(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5molN-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将反应混合物摇动1小时，过滤，重复偶联。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物18。

反应10

将化合物18在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物19。

反应11

向树脂19加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁酯(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将反应混合物摇动1小时，过滤，重复偶联。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物20。

反应12

将化合物20在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物21。

反应13

向树脂21加入商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-Nδ-(叔丁氧羰基)-L-鸟氨酸(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2ml 0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)和1-羟基苯并三唑(2ml0.5mol N-甲基吡咯烷溶液)。将反应混合物摇动1小时，过滤，重复偶联。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物22。

反应14

将化合物22在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中搅拌30分钟。将树脂过滤，重新悬浮在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(6ml)中，搅拌30分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤，得到化合物9。

实施例3：肽树脂化合物23的合成

向癸酸五氟苯基酯24(440mg，关于化合物24的制备参见实施例6反应1)的二氯甲烷溶液加入树脂肽1(2g)。将混合物摇动17小时，过滤，利用Kaiser试验判断反应不完全(参见上文)。将癸酸(517mg)、1-羟基苯并三唑(446mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(438μl)溶于N-甲基吡咯烷(8ml)，搅拌1小时。然后向混合物加入树脂，然后搅拌8小时，过滤，用N-甲基吡咯烷(3×6ml)、甲醇(3×6ml)和N-甲基吡咯烷(3×6ml)洗涤。利用Kaiser试验发现反应完全，得到与树脂结合的脂肽23。

实施例4：化合物29的合成

反应1

将L-2-N-(烯丙氧羰基)-4-(2-叠氮基苯基)-4-氧代丁酸25(636mg，见实施例15(参见下文))、4-二甲氨基吡啶(25mg)和N-甲基-2-氯吡啶_碘化物(511mg)用氩充分冲洗，然后悬浮在二氯甲烷(10ml)中。加入三乙胺(560μl)，搅拌反应混合物，得到均匀的溶液。向该溶液加入树脂脂肽23(667mg)，将烧瓶再次用氩冲洗，摇动17小时。取20mg树脂样本，测试反应是否完全(将含20mg树脂的二氯甲烷(0.6ml)用2，2，2-三氟乙醇(0.2ml)和乙酸(0.2ml)处理，搅拌3小时。过滤反应混合物，蒸发溶剂，得到残余物。残余物的液相色谱/质谱分析表明反应不完全)。判断偶联是不完全的，因此将树脂在减压下干燥5天，历经另外17小时重复上述偶联。过滤反应混合物，将固体用二氯甲烷充分洗涤。然后将固体悬浮在二氯甲烷(6ml)、2，2，2-三氟乙醇(2ml)和乙酸(2ml)中，摇动5小时。过滤反应混合物，蒸发滤液，得到粗的所需肽26(44mg)。粗产物经过反相HPLC纯化(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，历经25分钟用20％乙腈/0.5％甲酸：80％水/0.5％甲酸至80％乙腈/0.5％甲酸：20％水/0.5％甲酸梯度洗脱。将携带产物的部分冷冻干燥，得到粗产物26(10.6mg)。

反应2

向化合物26(10.6mg)的N-甲基吡咯烷(0.7ml)溶液加入羟基苯并三唑(5mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(6μl)和肽树脂9(12.3mg)，然后摇动22小时。过滤树脂，利用Kaiser试验判断偶联完全，得到与树脂结合的脂肽27。

反应3

将干燥的树脂27置于氩气氛下，用四(三苯膦)钯(0)(19mg)的二氯甲烷(1.47ml)、乙酸(74μl)与N-甲基吗啉(37μl)溶液处理。将混合物在环境温度下摇动4小时，过滤，将固体用N-甲基吗啉洗涤两次、用甲醇洗涤两次、再次用N-甲基吗啉洗涤两次。向树脂加入1-羟基苯并三唑(0.5ml 0.5mol N-甲基吗啉溶液)和1，3-二异丙基碳二亚胺(0.5ml 0.5mol N-甲基吗啉溶液)。将反应混合物摇动17小时，过滤，用N-甲基吗啉充分洗涤，得到与树脂结合的环化缩肽28。

反应4

将干燥的树脂28悬浮在二氯甲烷(4ml)、三氟乙酸(6ml)、乙二硫醇(250μl)与三异丙基硅烷(250μl)中，将反应混合物在环境温度下搅拌3小时。过滤树脂，合并滤液，在减压下蒸发。然后使粗产物在二乙醚(6ml)与水(3ml)之间分配。将含水层冷冻干燥，得到粗产物。粗产物经过反相HPLC纯化(C18 10μM Jupiter柱250×21.2mm)，历经25分钟用20％乙腈/0.5％甲酸：80％水/0.5％甲酸至80％乙腈/0.5％甲酸：20％水/0.5％甲酸梯度洗脱。合并携带产物的部分，冷冻干燥，得到粗产物29(1.0mg)。

实施例5：化合物33的合成

将商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(95mg)、4-二甲氨基吡啶(6mg)和N-甲基-2-氯吡啶_碘化物(69mg)用氩充分冲洗，然后悬浮在二氯甲烷(2.7ml)中。加入三乙胺(76μl)，搅拌反应混合物，得到均匀的溶液。向该溶液加入树脂脂肽23(200mg)，将烧瓶再次用氩冲洗，然后摇动14小时。然后将所得树脂过滤，用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮在二氯甲烷(6ml)、2，2，2-三氟乙醇(2ml)与乙酸(2ml)中，摇动3小时。过滤树脂，蒸发滤液，得到所需肽30(54mg)，为白色固体。

反应2

向缩肽30(54mg)的N-甲基吗啉(3.8ml)溶液加入1-羟基苯并三唑(26mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(30μl)和肽树脂9(64mg)，将所得混合物摇动22小时。过滤树脂，利用Kaiser试验判断偶联完全，得到与树脂结合的缩肽31。

反应3

将干燥的树脂31置于氩气氛下，用四(三苯膦)钯(0)(含48mg的二氯甲烷(7.63ml))、乙酸(0.38ml)和N-甲基吗啉(0.19ml)处理。将混合物在环境温度下摇动4小时，过滤，将固体用N-甲基吗啉洗涤两次、用甲醇洗涤两次、再次用N-甲基吗啉洗涤两次。将固体树脂悬浮在20％哌啶的N-甲基吗啉溶液(7ml)中达105分钟，过滤，将固体用N-甲基吗啉充分洗涤。向树脂加入1-羟基苯并三唑(0.3ml 0.5mol N-甲基吗啉溶液)和1，3-二异丙基碳二亚胺(0.3ml 0.5mol N-甲基吗啉溶液)。将反应混合物摇动17小时，过滤，将沉淀用N-甲基吗啉充分洗涤，得到与树脂结合的环化缩肽32。

反应4

将干燥的树脂32悬浮在二氯甲烷(4ml)、三氟乙酸(6ml)、乙二硫醇(250μl)与三异丙基硅烷(250μl)中，将反应混合物在环境温度下搅拌3小时。将反应混合物过滤，用二氯甲烷洗涤(2×2ml)，合并滤液，在减压下蒸发。然后使粗产物在二乙醚(6ml)与水(3ml)之间分配。分离含水层，冷冻干燥，得到粗产物33(21.5mg)。粗产物然后经过反相HPLC纯化(C18 10μM Jupiter柱250×21.2mm)，历经25分钟用20％乙腈/0.5％甲酸：80％水/0.5％甲酸至80％乙腈/0.5％甲酸：20％水/0.5％甲酸梯度洗脱。合并携带产物的部分，冷冻干燥，得到粗产物33(1.8mg)。

实施例6：化合物34的合成

反应1

向商业上可得到的癸酸(13.78g)的四氢呋喃(40ml)溶液加入1，3-二异丙基碳二亚胺(13.76ml)。5分钟后，加入五氟苯酚(16.20g)的四氢呋喃(40ml)溶液，将反应混合物搅拌72小时。过滤所得混合物；将残余物用四氢呋喃(40ml)洗涤，合并四氢呋喃滤液。蒸发溶剂，残余物经过硅胶纯化，使用9∶1己烷∶乙酸乙酯作为洗脱剂，得到所需产物24，为油状物(23.49g)。

反应2

将商业上可得到的Boc-L-3-苯并噻吩基丙氨酸35(1.0g)的无水甲醇(20ml)溶液在冰浴中冷却至0℃。滴加亚硫酰氯(1.63ml)，使反应混合物历经16小时温热至环境温度。蒸发溶剂，得到粗产物，在乙酸乙酯与含水碳酸氢钾之间分配。将有机层用含水碳酸氢钾洗涤，用氯化钠饱和，用无水硫酸钠干燥，蒸发，得到产物36(0.66g)。

反应3

向苯并噻吩基丙氨酸甲酯36(0.66g)的四氢呋喃(10ml)溶液加入癸酰基五氟苯酚酯24(1.04g)的四氢呋喃(10ml)溶液。将所得溶液搅拌24小时。将反应混合物倒入乙酸乙酯中，连续用1N盐酸、10％含水碳酸钾和饱和氯化钠洗涤。然后合并有机层，用无水硫酸钠干燥，蒸发，得到产物37(1.40g)，用作下一步反应中的粗原料。

反应4

向化合物37(1.40g)的甲醇(15ml)与水(3ml)溶液加入氢氧化锂一水合物(0.59g)，将反应混合物搅拌1小时。蒸发除去甲醇，将水溶液用1N盐酸酸化至pH1，用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用无水硫酸钠干燥，蒸发，得到产物38。

反应5

向化合物38(200mg)与五氟苯酚(108mg)的四氢呋喃(5ml)溶液加入1，3-二异丙基碳二亚胺(121mg)，将反应混合物搅拌1小时。过滤所得混合物，蒸发溶剂，残余物经过硅胶纯化，使用9∶1己烷∶乙酸乙酯作为洗脱剂，得到较快洗脱的杂质，使用4∶1己烷∶乙酸乙酯作为洗脱剂，得到产物34(80mg)。

实施例7：化合物39的合成

经由上述条件，如下从商业上可得到的40制备化合物39：在实施例6反应2所述条件下，化合物39转化为对应的甲基酯。在实施例6反应3所述条件下酰化甲基酯。然后在实施例6反应4所述反应条件下皂化已酰化的化合物。然后经由实施例6反应5所述条件，皂化产物转化为化合物39。

实施例8：化合物41的合成

反应1

在实施例6反应2所述条件下，商业上可得到的化合物42转化为化合物43。

反应2

向在冰浴中冷却至0℃的氨基酸甲基酯43(440mg)的三乙胺(0.43ml)溶液加入癸酰氯(0.51ml)。使反应物历经3小时温热至环境温度。然后将反应物倒入乙酸乙酯中，连续用水和饱和氯化钠洗涤。然后将有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发，得到产物44。

反应3

经由下述条件，化合物44转化为化合物41。在实施例6反应4所述反应条件下皂化化合物44。然后经由实施例6反应5所述条件，皂化产物转化为化合物41。

实施例9：化合物45的合成

经由上述条件，如下从商业上可得到的46制备化合物45：在实施例6反应2所述条件下，化合物46转化为对应的甲基酯。在实施例8反应2所述条件下酰化甲基酯。然后在实施例6反应4所述反应条件下皂化已酰化的化合物。然后经由实施例6反应5所述条件，皂化产物转化为化合物45。

实施例10：化合物47的合成

反应1

在上述实施例6反应3所述条件下处理商业上可得到的48，得到化合物49。如实施例6反应5所述处理化合物49，得到化合物47。

实施例11：化合物50的合成

在上述实施例6反应3所述条件下，将商业上可得到的51用单一修饰处理，使用N，N’-二甲基甲酰胺溶剂代替四氢呋喃溶剂，得到化合物52。在上述实施例6反应5所述条件下，将化合物52用单一修饰处理，使用N，N’-二甲基甲酰胺溶剂代替四氢呋喃溶剂，得到化合物50。

实施例12：化合物53的合成

反应1

将商业上可得到的吲哚-2-羧酸乙酯54(2g)、碘代癸烷(2.25ml)与碳酸钾(2.92g)的无水二甲基甲酰胺(30ml)溶液搅拌24小时。将反应物倒入乙酸乙酯(200ml)中，用水(300ml)洗涤。然后将有机层用无水硫酸镁干燥，蒸发，得到产物55(2.604g)。

反应2

向化合物55(2.6g)的四氢呋喃(16ml)溶液加入氢氧化锂/水(1.65g)的水(16ml)溶液，搅拌4天。加入乙酸乙酯(20ml)和水(10ml)，将含水层调至pH1，用乙酸乙酯萃取(3×5ml)。合并有机层，干燥，蒸发，得到油状物。水解是不完全的，因此将该油溶于甲醇/水2∶1，加入氢氧化钾(0.88g)。将反应混合物搅拌15小时。加入乙酸乙酯(20ml)和水(10ml)，分离各层，将含水层调至pH1，用乙酸乙酯萃取(3×5ml)。合并有机层，干燥，蒸发，得到粗产物，为油状物，经过硅胶纯化，使用10∶1己烷∶乙酸乙酯作为洗脱剂，得到产物56(0.35g)。

反应3

向化合物56(340mg)与五氟苯酚(227mg)的二氯甲烷(5ml)溶液加入1，3-二异丙基碳二亚胺(206mg)，将反应混合物搅拌15小时。将混合物用己烷猝灭，过滤，蒸发溶剂。产物经过硅胶纯化，用20∶1己烷∶乙酸乙酯洗脱，得到产物53(490mg)。

实施例13：化合物57的合成

反应1

向商业上可得到的色氨酸甲酯58(2.54g)与三乙胺(2.9ml)的二氯甲烷(10ml)溶液加入4-二甲氨基吡啶(0.12g)和乙酸酐(1.03ml)。18小时后，将反应混合物用1N盐酸(10ml)猝灭，含水层用乙酸乙酯萃取(3×10ml)。合并有机层，用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，蒸发，得到粗产物。经过硅胶纯化，用2∶1己烷∶乙酸乙酯洗脱，得到产物59(1.99g)。

反应2

在上述实施例8反应2所述条件下烷基化化合物59，用碳酸钾代替氢氧化钾，得到化合物60。

反应3

利用实施例6反应4所述工艺水解化合物60，得到化合物61。

反应4

利用实施例6反应4所述条件，化合物61转化为化合物57。

实施例14：化合物62的合成

反应1

经由实施例8反应2所述条件，商业上可得到的色氨酸甲酯58转化为化合物63。

反应2

然后利用实施例12反应1所述条件，使用甲基碘代替碘代癸烷，化合物63转化为化合物64。

反应3

利用实施例13反应3所述条件水解化合物64，得到化合物65。

反应4

利用实施例13反应4所述条件，化合物65转化为化合物62。

实施例15：化合物25的合成

反应1

向商业上可得到的L-2-氨基-4-(2-氨基苯基)-4-氧代丁酸A(3.93g)与三乙胺(5.79ml)的四氢呋喃(181ml)溶液加入足量的水，得到均匀的溶液。然后将该溶液在冰浴中冷却至0℃，滴加二碳酸二烯丙酯(3.36ml)。使反应混合物历经16小时温热至环境温度，然后浓缩至原始体积的三分之一。将混合物倒入二氯甲烷(350ml)中，用1N盐酸(3×100ml)和饱和氯化钠(1×100ml)洗涤。合并含水层，用乙酸乙酯反萃取(4×100ml)，合并有机部分，用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂，得到产物B，为黄色固体(5.14g)。

反应2

向-2℃的化合物B(5.00g)的水(130ml)与浓盐酸(43ml)溶液滴加亚硝酸钠(1.30g)的水(3ml)溶液，以便温度维持低于0℃。将反应混合物在-4℃下搅拌135分钟，加入叠氮化钠(3.34g)的水(3ml)溶液。使反应混合物历经16小时温热至环境温度。然后将混合物倒入水(130ml)中，含水相用二氯甲烷萃取(4×80ml)。合并有机层，然后用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂，得到产物25，为橙色泡沫(5.14g)。

实施例16：化合物77的合成

反应1

向商业上可得到的2-氯三苯甲基树脂C(1g)与商业上可得到的2-N-(9-芴基甲氧羰基)-4-N(叔丁氧羰基)-L-2，4-二氨基丁酸D的二氯甲烷(10ml)悬液加入二异丙基乙胺(1.65ml)。将混合物摇动3小时，过滤，将固体用二氯甲烷(10ml)洗涤，然后干燥，得到E。

反应2

将化合物E在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(20ml)中搅拌60分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(20ml)洗涤，得到化合物F。

反应3

向商业上可得到的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(1.23g)、TBTU(0.92g)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液加入二异丙基乙胺(0.5ml)，将所得混合物摇动10分钟。然后向树脂F加入该溶液，摇动1小时，过滤，将固体用N-甲基吡咯烷(10ml)洗涤，得到化合物G。

反应4

将化合物G在20％哌啶的N-甲基吡咯烷溶液(20ml)中搅拌60分钟。然后过滤反应混合物，将固体用N-甲基吡咯烷(20ml)洗涤，得到化合物H。

反应5

向商业上可得到的癸酸(0.50g)、TBTU(0.92g)的N，N-二甲基甲酰胺(15ml)溶液加入二异丙基乙胺(0.5ml)，将所得混合物摇动10分钟。然后向树脂H加入该溶液，摇动1小时，过滤，将固体用N-甲基吡咯烷(10ml)洗涤，得到化合物I。

反应6

将化合物I用二氯甲烷∶2，2，2-三氟乙醇∶乙酸(3∶1∶1)处理，将所得混合物摇动3小时。然后过滤反应混合物，蒸发滤液，得到化合物J，为白色固体(180mg)。

反应7

利用实施例6反应4所述条件，化合物J转化为化合物77。

实施例17：Alloc-保护的达托霉素、即化合物67的合成

在0℃下，向达托霉素66(10g)的无水N，N’-二甲基甲酰胺(40ml)溶液加入1-苯并三唑基碳酸烯丙酯(13.5g)。使反应混合物温热至室温，搅拌18小时。将混合物用水(200ml)稀释，装上Bondesil 40μm C8树脂(400g)，后者已经用甲醇(1L)和水(1L)预先洗涤过。将树脂用水(1L)洗涤，用甲醇(1L)洗脱产物。蒸发甲醇，得到化合物67，为黄色固体(1g)。

实施例18：化合物68的制备

从表达犹他游动放线菌脱酰酶的重组Streptomyces lividans产生脱酰酶制备物。向pH8的化合物67(15g)的水溶液(1.9L)加入酶的含水乙二醇溶液(10ml)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，用1M氢氧化钠调节pH至8。将反应混合物倒在Bondesil 40μM C8树脂(400g)上，后者已经用甲醇(1L)和水(1L)预先洗涤过。用20％乙腈的水溶液(1L)洗脱产物，冷冻干燥，得到化合物68，为黄色固体(9.1g)。

实施例19：除去色氨酸的埃德曼降解

化合物70的制备

反应1

向化合物68(9.1g)的无水N，N’-二甲基甲酰胺(15ml)悬液加入正癸基异硫氰酸酯(1.2ml)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物倒在Bondesil 40μM C8树脂(400g)上，后者已经用甲醇(1L)和水(1L)预先洗涤过。先用水(800ml)洗涤，再用20％乙腈的水溶液(800ml)洗涤，然后用甲醇(800ml)洗脱产物。蒸发甲醇，得到化合物69，为黄色固体(7.3g)。

反应2

在室温下，将化合物69(7.3g)在25％三氟乙酸的无水二氯甲烷溶液(30ml)中搅拌2小时，然后蒸发至干。将残余物溶于水(50ml)，倒在Bondesil 40μM C8树脂(400g)上，后者已经用甲醇(1L)和水(1L)预先洗涤过。用20至40％乙腈的水溶液梯度洗脱产物，冷冻干燥，得到化合物70，为黄色固体(1.05g)。

实施例20：除去天冬酰胺的埃德曼降解

化合物72的制备

反应1

向化合物70(0.57g)的无水N，N’-二甲基甲酰胺(5ml)悬液加入正癸基异硫氰酸酯(0.16ml)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，然后蒸发至干。用二乙醚(5ml)研制残余物，得到化合物71，为黄色固体(0.54g)。

反应2

将化合物71(0.54g)在50％三氟乙酸的无水二氯甲烷溶液(4ml)中搅拌2小时，然后蒸发至干。将残余物溶于水(25ml)，倒在Bondesil40μM C8树脂(50g)上，后者已经用甲醇(100ml)和水(100ml)预先洗涤过。先用水(100ml)洗涤，然后用20％乙腈的水溶液洗脱产物。将洗脱液蒸发至干，得到化合物72，为黄色固体(0.40g)。

实施例21：除去天冬氨酸的埃德曼降解

化合物74的制备

反应1

向化合物72(1.0mmol)的无水N，N’-二甲基甲酰胺(5ml)悬液加入苯基异硫氰酸酯(1mmol)。将反应物在环境温度下搅拌18小时，然后蒸发至干。用二乙醚(5ml)研制残余物，得到产物73。

反应2

将化合物73在二氯甲烷(2ml)与三氟乙酸(2ml)中搅拌2小时，然后蒸发至干，得到产物，为三氟乙酸盐74。

实施例22：化合物76的制备

反应1

向脱酰化、脱色氨酸的达托霉素70(500mg)与二异丙基乙胺(2-3滴)的N，N’-二甲基甲酰胺(5ml)溶液加入化合物50(397mg)。借助分析型反相HPLC监测反应(用含5％至95％乙腈/0.1％甲酸的水/0.1％甲酸梯度洗脱，柱子为luna C18 5μM 150×3mm)，搅拌16小时后观察到化合物70被完全消耗。蒸发除去溶剂，粗产物75(631mg)直接用于下一步。

反应2

向化合物75(631mg)与N-甲基吗啉(631μl)的二_烷(10ml)与1N盐酸(6.31ml)溶液加入四(三苯膦)钯(0)(631mg)。搅拌16小时后，过滤反应物，经过反相HPLC纯化，使用C18 10μM Jupiter柱250×21.2mm，历经25分钟用乙腈∶水∶甲酸30∶70∶0.1至乙腈∶水∶甲酸90∶10∶0.1梯度洗脱。蒸发携带产物的部分，得到产物76(44mg)。

实施例23：化合物79的合成

反应1

向脱酰化、脱色氨酸、脱天冬酰胺的达托霉素72(1.0mmol)与二异丙基乙胺(2-3滴)的无水二甲基甲酰胺(5ml)溶液加入化合物77(1.2mmol，见实施例16(参见上文))。将反应物在环境温度下搅拌，直至根据分析型反相HPLC的测定，所有原料均被消耗(用含5％至95％乙腈/0.1％甲酸的水/0.1％甲酸梯度洗脱，柱子为luna C18 5μM 150×3mm)。将混合物蒸发至干，用乙醚(5ml)研制残余物，得到所需产物78。

反应2

向化合物78(1mmol)的0.5M盐酸(1ml)与二_烷(3ml)溶液加入N-甲基吗啉(0.1ml)和四(三苯膦)钯(0)(100mg)。将反应物在氩下搅拌24小时，过滤，浓缩，得到粗的半固体。将残余物溶于无水二氯甲烷(4ml)。加入三异丙基硅烷(0.1ml)和三氟乙酸(1ml)，将反应物搅拌2小时，然后蒸发至干。残余物然后经过制备型HPLC纯化，柱子为250×21.2mm.Jupiter 10μm C8柱，使用含30-80％乙腈的0.1％含水甲酸梯度作为洗脱剂。从携带产物的部分中蒸发溶剂，得到所需产物79。

实施例24

生物学活性

按照由National Committee for Clinical LaboratoryStandards所描述的标准工艺(NCCLS document M7-A5，Vol.20，No.2，2000)测试了根据式I的化合物对抗一组生物的抗微生物活性，所有测试都是在37℃下进行的。将化合物溶于100％二甲基亚砜，在微生物生长培养基中稀释至最终反应浓度(0.1μg/ml-100μg/ml)。在所有情况下，与细胞一起培育的二甲基亚砜的最终浓度小于或等于1％。关于最小抑制浓度(MIC)的计算，向在最终体积100μl的培养基(补充有50mg/L Ca²⁺的Mueller-Hinton肉汤)中含有5×10⁴细菌细胞的微量滴定板小孔加入化合物的2倍稀释液。利用商业化的平板读数器测量细菌细胞的光密度(OD)，它反映细菌细胞的生长和增殖。MIC值被定义为抑制供试生物生长的最低化合物浓度。本发明代表性化合物的MIC列在表III中(以μg/ml计)。

表III：式I化合物的生物学活性

SA399是甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌。

SA42是野生型金黄色葡萄球菌。

EF14是野生型屎肠球菌。

EF201是野生型粪肠球菌。

其中“+++”表示化合物的MIC(μg/ml)为1μg/ml或以下，或者ED₅₀为1mg/kg或以下；

“++”表示化合物的MIC(μg/ml)或ED₅₀分别大于1μg/ml或1mg/kg，但是分别小于或等于10μg/ml或10mg/kg；

“+”表示化合物的MIC(μg/ml)大于10μg/ml，或者ED₅₀大于10mg/kg。

实施例25

体内活性

小鼠保护试验是测量供试化合物体内功效的工业标准(关于这种模型的实例参见J.J.Clement，et al.，Antimicrobial Agents andChemotherapy，38(5)，1071-1078，(1994))。如下所述，本试验用于证明本发明化合物对抗细菌的体内功效。

体内抗菌活性是这样建立的，将体重19-23g的雌性CD-1小鼠(Charles River Lab，MA)以腹膜内方式用甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)接种体感染。从甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(ATCC43300)制备接种体。将MRSA接种体在37℃ Mueller-Hinton(MH)肉汤中培养18小时。测定1∶10稀释液培养过夜的600nm光密度(OD₆₀₀)。向20ml含有5％猪胃粘蛋白(Sigma M-2378)的磷酸盐缓冲盐水(SigmaP-0261)加入细菌(8×10⁸cfu)。向所有动物注射0.5ml接种体，相当于2×10⁷cfu/小鼠，这是导致未治疗动物约100％死亡的剂量。

将供试化合物溶于10.0ml 50mM磷酸盐缓冲液，得到1mg/ml的溶液(pH＝7.0)。将该溶液连续用载体稀释4倍(1.5ml至6.0ml)，得到0.25、0.063和0.016mg/ml溶液。将所有溶液用0.2m Nalgene注射滤器过滤。在细菌接种后立即向第1组动物皮下(sc)注射缓冲液(没有供试化合物)，向第2至5组动物sc给以供试化合物，剂量分别为10.0、2.5、0.63和0.16mg/kg。第6组动物sc接受10mg/kg供试化合物(或者给定化合物的最高治疗剂量)，仅供监测急性毒性。在各组接种后4小时重复一次这些注射。每次的注射体积为10ml每千克体重。在接种后7天仍存活的小鼠数量的基础上计算50％保护剂量(PD₅₀)。

本说明书引用的所有出版物和专利申请均结合在此作为参考，如同每篇独立的出版物或专利申请被具体和单独地结合作为参考。尽管出于清楚理解的目的，已经借助举例说明和实施例详细描述了前述发明，不过鉴于本发明的教导，对本领域普通技术人员来说显而易见的是可以对其进行某些改变和修饰，且不背离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (30)

1.化合物，用下式表示

或其盐；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁵独立地是氢或甲基；

(c)R²是甲基或-CH₂CH₂CH₂R⁸；

(d)R³是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；

(e)R⁴是氢或甲氧基；

(f)R⁵是羟基或羰酰氨基；

(g)每个R⁷、R⁸和R⁹独立地是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

(h)其条件是

(1)若R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸，则R⁷不是

其中R¹⁰是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

(2)若R²是甲基，则R⁷不是

其中每个R¹¹和R¹²是氢、C₆-C₁₈未取代的烷酰基、C₈-C₁₈未取代的烯酰基、C₈-C₁₈未取代的烷基或C₈-C₁₈有选择取代的烷基；或者作为替代选择，R¹¹和R¹²一起是C₈-C₁₈亚烷基。

2.权利要求1的化合物，其中R是2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；每个R¹和R⁴是氢；R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸；每个R³和R⁶是甲基；R⁵是羟基。

3.权利要求1的化合物，其中R是异丙基或2-丁基；每个R¹和R²是甲基；R³是-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；R⁴是甲氧基；R⁵是碳酰氨基。

4.权利要求1的化合物，其中R⁷是

其中每个R^aa1、R^aa2和R^aa3独立地是氨基酸侧链，其中R¹³是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

5.权利要求4的化合物，其中R是2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；每个R¹和R⁴是氢；R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸；每个R³和R⁶是甲基；R⁵是羟基。

6.权利要求4的化合物，其中R是异丙基或2-丁基；每个R¹和R²是甲基；R³是-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；R⁴是甲氧基；R⁵是碳酰氨基。

7.化合物，用下式表示

或其盐；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁶独立地是氢或甲基；

(c)R⁴是氢或甲氧基；

(d)R⁵是羟基或碳酰氨基；

(e)R¹⁵是氢；

其中：R¹⁸是氨基或羟基；R¹⁹是氢或羟基；R²⁰是碳酰氨基或羧甲基；

(f)R¹⁶是甲基或-CH₂CH₂CH₂R²¹；

(g)R¹⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R²²；

其中每个R²¹和R²²独立地是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

8.权利要求7的化合物，其中每个R²¹和R²²独立地是-NHR²³，其中R²³是氨基保护基团。

9.权利要求8的化合物，该化合物是

其中每个R⁶和R¹⁴独立地是氢或甲基。

10.药物组合物，包含权利要求1的化合物和可药用载体和/或稀释剂和/或辅料和/或赋形剂。

11.权利要求10的组合物，其中R是2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；每个R¹和R⁴是氢；R²是-CH₂CH₂CH₂R⁸；每个R³和R⁶是甲基；R⁵是羟基。

12.权利要求10的组合物，其中R是异丙基或2-丁基；每个R¹和R²是甲基；R³是-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；R⁴是甲氧基；R⁵是碳酰氨基。

13.权利要求10的组合物，其中R⁷是

其中每个R^aa1、R^aa2和R^aa3独立地是氨基酸侧链，其中R¹³是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基。

14.权利要求1的化合物在制备治疗细菌感染者的药物中的应用。

15.权利要求1的化合物或其盐的制备方法，

该方法包含从式XVII化合物：

或其盐中除去氨基保护基团，

其中R²⁸是甲基或-CH₂CH₂CH₂NHP；R²⁹是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NHP；P是氨基保护基团；其余基团的定义与权利要求1相同；其条件是R²⁸或R²⁹至少有一个不是甲基。

16.权利要求15的方法，进一步包含将式XVI化合物：

或其盐用改性剂处理，得到式XVII化合物或其盐，

其中，上述改性剂为：

(a)醛或酮，获得氨基、单取代或双取代氨基；

(b)活化酯、内酯或酰氯，获得酰氨基；

(c)异氰酸酯，获得脲基；

(d)胍基化剂，获得胍基；

(e)碳酸酯、氯甲酸酯或氰基甲酸酯，获得氨甲酰基；

(f)磺酰氯或活化磺酰胺，获得磺酰氨基；

(g)硫代酸酯，获得硫代酰氨基；

(h)硫代异氰酸酯，获得硫脲基；

(i)亚氨酸酯，获得亚氨基氨基；

(j)磷酰氯或氨基磷酸酯，获得膦酰氨基。

17.权利要求16的方法，进一步包含从式XV化合物：

或其盐中除去末端氨基酸残基，其中R¹⁸是氨基或羟基；R¹⁹是氢或羟基；得到式XVI化合物或其盐。

18.权利要求17的方法，进一步包含从式XIV化合物：

或其盐中除去末端氨基酸残基，其中R²⁰是碳酰氨基或羧甲基；得到式XV化合物或其盐。

19.权利要求18的方法，进一步包含从式XIII化合物：

或其盐中除去色氨酸氨基酸残基，得到式XIV化合物或其盐。

20.权利要求19的方法，进一步包含脱酰化式XII化合物：

或其盐，其中R²⁵是烷基；得到式XIII化合物或其盐。

21.权利要求20的方法，进一步包含保护式XI化合物：

或其盐的游离氨基，其中R²⁶是甲基或-CH₂CH₂CH₂NH₂；R²⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂；其余基团的定义与权利要求1相同；得到式XII化合物或其盐。

22.权利要求1的化合物或其盐的制备方法，

该方法包含将式Ia化合物

或其盐用改性剂处理，其中R^2a是甲基或-CH₂CH₂CH₂NH₂；R^3a是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂；其余基团的定义与权利要求1相同；其条件是R^2a和R^3a至少有一个不是甲基，

其中，改性剂定义同权利要求16。

23.权利要求1的化合物或其盐的制备方法，

该方法包含将式XXVIII化合物

或其盐用改性剂处理，其中R³⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂R⁸；R³⁸是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂R⁹；其余基团的定义与权利要求1相同；其条件是R³⁷和R³⁸至少有一个不是甲基，进一步的条件是每个R⁸和R⁹都不是氨基，

其中，改性剂定义同权利要求16。

24.权利要求23的方法，进一步包含从式XXVII化合物：

或其盐中除去末端氨基酸残基，其中R¹⁸是氨基或羟基；R¹⁹是氢或羟基；得到式XXVIII化合物或其盐。

25.权利要求24的方法，进一步包含从式XXVI化合物：

或其盐中除去末端氨基酸残基，其中R²⁰是碳酰氨基或羧甲基；得到式XXVII化合物或其盐。

26.权利要求25的方法，进一步包含从式XXV化合物：

或其盐中除去色氨酸氨基酸残基，得到式XXVI化合物或其盐。

27.权利要求26的方法，进一步包含脱酰化式XXIV化合物：

或其盐，其中R²⁵是烷基；得到式XXV化合物或其盐。

28.权利要求27的方法，进一步包含将式XI化合物：

或其盐的游离氨基用改性剂处理，其中R²⁶是甲基或-CH₂CH₂CH₂NH₂；R²⁷是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂；得到式XXV化合物或其盐，

其中，改性剂定义同权利要求16。

29.式XXXII化合物：

或其盐的制备方法；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁶独立地是氢或甲基；

(c)R⁴是氢或甲氧基；

(d)R⁵是羟基或碳酰氨基；

(e)R¹⁸是氨基或羟基；

(f)R¹⁹是氢或羟基；

(g)R²⁰是碳酰氨基或羧甲基；

(h)R²⁸是甲基或-CH₂CH₂CH₂NHP；

(i)R²⁹是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NHP；

(j)P是氨基保护基团；

(k)R³⁹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

该方法包含将式XIV化合物

或其盐用改性剂处理，上述改性剂定义同权利要求16。

30.制备式XXXIV化合物：

或其盐的方法；其中：

(a)R是2-丁基、异丙基或2-(2′-氨基苯甲酰甲基)；

(b)每个R¹和R⁶独立地是氢或甲基；

(c)R⁴是氢或甲氧基；

(d)R⁵是羟基或碳酰氨基；

(e)R¹⁸是氨基或羟基；

(f)R¹⁹是氢或羟基；

(g)R²⁸是甲基或-CH₂CH₂CH₂NHP；

(h)R²⁹是甲基或-CH₂CH₂CH₂CH₂NHP；

(i)P是氨基保护基团；

(j)R³⁹是氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰基氨基、脲基、胍基、氨甲酰基、磺酰氨基、硫代酰基氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦酰氨基；

该方法包含将式XV化合物

或其盐用改性剂处理，

上述改性剂定义同权利要求16。