CN100351390C - 银杏内生真菌的分离筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了银杏内生真菌的分离筛选方法，属于微生物技术领域。该方法包括：银杏组织的准备、表面消毒与无菌检测、银杏组织内生真菌的分离培养、适用发酵培养基的配制、内生真菌培养及菌株筛选等步骤。本发明为实现由微生物发酵法取代从银杏植物组织中提取杀菌活性物质的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法及一批有效的出发菌株。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及从银杏组织中分离筛选出，经发酵能产生抑制植物真菌病害病原菌代谢产物的内生真菌的方法。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)又名白果，是我国特有的世界珍稀名贵树种，是冰川运动遗留的孑遗植物，被称为活化石。属银杏科，是银杏属现存的唯一生存种。现为广泛栽培树种，具有极高的研究开发价值。银杏各组织含有抑菌物质，据报道，银杏根、茎、叶、果肉(外种皮)及果仁的提取物对供试的植物病原菌有抑制作用。但植物资源量是限制植物源杀菌剂发展规模的主要因素之一。根据宿主植物与其内生微生物由于长期的共同生活而具有相同或相似的次生代谢产物合成途径的“内共生理论”，从银杏中分离筛选到产黄酮的内生真菌已有报道(王梅霞等，南京师大学报，2003，26(1))，这主要涉及医药方面的研究。但从银杏中分离筛选内生真菌，并通过发酵获得对植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代谢产物，这在国内外还未见有研究报道。
发明内容
本发明目的是提出一种从银杏组织中，分离筛选出其代谢产物对植物真菌病害病原菌有明显抑制作用的内生真菌的方法，以达到由微生物发酵法取代从植物中提取杀菌活性物质的传统方法。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现。
一种银杏内生真菌的分离筛选方法，该方法包括以下步骤：
(1)银杏组织的准备：采集银杏根、茎、叶、果肉、果仁；
(2)银杏组织的表面消毒与无菌检测；将步骤(1)银杏组织经表面消毒后，直接种植于PDA培养基平皿上，置26℃～28℃恒温箱培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；
(3)银杏组织内生真菌的分离培养：将步骤(2)的无菌组织在无菌条件下切割成小片移植于PDA培养基上，置26℃～28℃恒温箱培养，至样品周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基备用；
(4)内生真菌液体发酵培养基的配制：每升培养基中各组分的质量为蛋白胨0-5.5g、玉米粉1-8g、麸皮0-10g、可溶性淀粉0-10g、葡萄糖1-8g、黄豆饼粉1-9g、CaCO30.5-2.5g、NH4NO30.1-1.2g、MgSO40.1-0.9g、KH2PO40.1-0.9g；
(5)内生真菌发酵培养：将步骤(4)液体发酵培养基分装在三角瓶中，用接种钩挑取少许经步骤(3)分离纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置26℃～28℃摇床，200r/min，振荡培养4～5天，发酵液经5000r/min离心10min，取发酵上清液；
(6)有效菌株筛选：取步骤(5)各上清液与冷却至50℃的PDA培养基按毫升体积1∶9混匀于无菌培养皿内，凝固后在每个培养基平面放1个直径为4mm的供试菌饼，置28℃培养箱培养后，计算各菌株代谢产物对供试病原菌的抑制率；
(7)菌种的保藏：将步骤(6)筛选出的高效抑制率内生真菌菌株进行保藏，备用。
所述的液体发酵培养基可优化为，每升培养基中各组分的质量为蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麸皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黄豆饼粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g；
本发明步骤(2)和(3)所述培养基为PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)，其组分与含量为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1L。
本发明步骤(6)所述供试菌饼的植物病原菌为番茄早疫病菌(Alternariasolani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)或黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)中的一种或一种以上(均系《病原植物真菌学》中描述的与农业植物病害关系密切的病原菌)。
本发明的有益效果，一是本发明根据“内共生理论”从银杏中筛选出其代谢产物与宿主植物提取物相同或相似的，对植物真菌病害病原菌具有抑制作用的内生真菌，这为实现由植物中提取杀菌活性物质到微生物发酵法生产杀菌活性物质的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法；二是本发明跟踪测定了分离到的各内生真菌菌株代谢产物对供试植物病原菌的抑制作用，从而获得有效菌株，为微生物农药的进一步研制和开发提供了一批出发菌株；三是本发明重视了对植物组织的前期无菌检测，并研制了银杏内生真菌适用的液体发酵培养基，提高了对内生真菌分离筛选的成功率与效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明银杏内生真菌的分离筛选方法作进一步描述。
实施例1：
从浙江长兴银杏长廊采集银杏茎组织，按下列程序进行表面消毒：自来水冲洗，75％酒精漂洗5min，无菌水冲洗5次，再用升汞浸泡4min，无菌水冲洗4次；表面消毒后的茎组织直接种植于PDA培养基平皿上，置28℃恒温箱内培养，从中选出表面无任何菌种生长的茎组织；
将经无菌检测的茎(取韧皮部)组织，在超净工作台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片种植于PDA培养基平板上，置28℃恒温箱培养；当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基，备用；
将上述分离得的银杏内生真菌各菌株进行液体发酵培养，其每升培养基中各组分的质量为：蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麸皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黄豆饼粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g；
将500mL液体发酵培养基分装在300mL的三角瓶中，每瓶装液量为50mL；用接种钩挑取少许斜面培养菌丝接种于培养瓶中，置于28℃摇床，200r/min，振荡培养4天；发酵液5000r/min离心10min，取上清液，弃菌丝体；
发酵液抑菌活性测定：取上述各菌株发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置28℃培养箱中培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：
结果表明：编号为3、64、73、121、303、431、528、555、597、820、847、920、1012、1028菌株的代谢产物对黄瓜立枯病菌的抑制率分别为25％、36％、45％、26％、42％、47％、39％、41.5％、37.3％、54％、19.5％、59％、46％、68％。
实施例2：
取银杏叶，按下列程序表面消毒：自来水冲洗，75％酒精漂洗5min，无菌水冲洗5次，再用升汞浸泡4min，无菌水冲洗3次；表面消毒后的叶组织直接种植于PDA培养基平皿上，置27℃恒温箱内培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；
将经无菌检测的叶片在超净工作台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片种植于PDA平板上，置27℃恒温箱培养。当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基，备用。
将上述分离得的银杏内生真菌各菌株进行液体发酵培养：液体发酵培养基其每升培养基中各组分的质量为：蛋白胨5.5g、玉米粉1g、麸皮10g、葡萄糖8g、黄豆饼粉1g、CaCO30.5g、NH4NO31.2g、MgSO40.4g、KH2PO40.1g；将培养基分装在300mL的三角瓶中，每瓶装液量为50mL；用接种钩挑取少许斜面培养菌丝接种于培养瓶中，置于27℃摇床，200r/min，振荡培养5天，发酵液5000r/min离心10min，取上清液，弃菌丝体；
发酵液抑菌活性测定：取上述各菌株发酵液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌番茄早疫病菌(Alternaria solani)的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置28℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次。采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率，计算方法同实施例1。
结果表明：编号为256、383、604、618、918菌株的代谢产物对番茄早疫病菌的抑制率分别为56％、38％、67％、20％、42％。
实施例3：
取银杏果肉(外种皮)，按下列程序表面消毒：自来水冲洗，75％酒精漂洗5min，无菌水冲洗5次，再用升汞浸泡4分钟，无菌水冲洗3次；表面消毒后的果肉组织直接种植于PDA培养基平皿上，置26℃恒温箱内培养，从中选出表面无任何菌种生长的果实组织；
将经无菌检测的果肉在超净工作台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片种植于PDA平板上，置26℃恒温箱培养；当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基备用；
将上述分离得的银杏内生真菌各菌株进行液体发酵培养：液体发酵培养基其每升培养基中各组分的质量为：玉米粉8g、葡萄糖1g、可溶性淀粉10g、黄豆饼粉9g、CaCO32.5g、NH4NO30.1g、MgSO40.9g、KH2PO40.9g；
将500mL培养基分装在300mL的三角瓶中，每瓶装液量为50mL；用接种钩挑取少许斜面培养菌丝接种于培养瓶中，置于26℃摇床，200r/min，振荡培养5天；发酵液5000r/min离心10min，取上清液，弃菌丝体；
发酵液抑菌活性测定：取上述菌株发酵液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置28℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率，计算方法同实施例1；
结果表明：编号为78、207、305、391、634、1002菌株的代谢产物对葡萄炭疽病菌的抑制率分别为25.3％、61％、64.6％、43.4％、50.9％、61.3％。
试验例：
采用生长速率法测定了菌株代谢产物与银杏组织提取液对供试菌的抑制作用；
其中：
920、1028菌株代谢产物为各按实施例1的工艺和配方发酵4天所得上清液；
604菌株代谢产物为按实施例2的工艺和配方发酵5天所得上清液；
305菌株代谢产物为按实施例3的工艺和配方发酵5天所得上清液；
从表1可见，所选菌株代谢产物与银杏组织提取液对供试菌的抑制作用基本相仿或略优；
表1菌株代谢产物与银杏组织提取液的抑制率(％)对比试验
| 供试病原菌 | 银杏叶提取液 | 银杏外种皮提取液 | 1028菌株代谢产物 | 604菌株代谢产物 | 920菌株代谢产物 | 305菌株代谢产物 |
| 番茄早疫病菌 | 58 | 55 | - | 67 | - | - |
| 葡萄炭疽病菌 | 45 | - | 37 | - | - | 64.6 |
| 黄瓜立枯病菌 | - | 60 | 68 | - | 59 | - |
| 水稻纹枯病菌 | - | 50 | 57 | - | - | - |
“-”表示未试验。
Claims (2)
1、一种用于防治黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)或葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的银杏内生真菌的分离筛选方法，其特征是包括以下步骤：
(1)银杏组织的准备：采集银杏根、茎、叶、果肉、果仁；
(2)银杏组织的表面消毒与无菌检测；将步骤(1)银杏组织经表面消毒后，直接种植于PDA培养基平皿上，置26℃～28℃恒温箱培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；
(3)银杏组织内生真菌的分离培养：将步骤(2)的无菌组织在无菌条件下切割成小片移植于PDA培养基上，置26℃～28℃恒温箱培养，至样品周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基备用；
(4)内生真菌液体发酵培养基的配制：每升培养基中各组分的质量为蛋白胨0-5.5g、玉米粉1-8g、麸皮0-10g、可溶性淀粉0-10g、葡萄糖1-8g、黄豆饼粉1-9g、CaCO3 0.5-2.5g、NH4NO3 0.1-1.2g、MgSO4 0.1-0.9g、KH2PO4 0.1-0.9g；
(5)内生真菌发酵培养：将步骤(4)液体发酵培养基分装在三角瓶中，用接种钩挑取少许经步骤(3)分离纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置26℃～28℃摇床，200r/min，振荡培养4～5天，发酵液经5000r/min离心10min，取发酵上清液；
(6)有效菌株筛选：取步骤(5)各上清液与冷却至50℃的PDA培养基按毫升体积1∶9混匀于无菌培养皿内，凝固后在每个培养基平面放1个直径为4mm的黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)或葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的供试菌饼，置28℃培养箱培养后，计算各菌株发酵液对供试病原菌的抑制率；
(7)菌种的保藏：将步骤(6)筛选出的对各供试病原菌具有高效抑制率的内生真菌菌株进行保藏，备用。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的液体发酵培养基其每升培养基中各组分的质量为蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麸皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黄豆饼粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g。
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| 一株产黄酮银杏内生真菌的分离鉴定与培养介质的初步研究 王梅霞，陈双林，闫淑珍，霍娟.南京师大学报(自然科学版)，第26卷第1期 2003 * |
| 银杏内生真菌抗真菌活性菌株的分离和筛选 郭建新，孙广宇，张荣，李琦，权淑静，郭井泉.西北农业学报，第14卷第4期 2005 * |
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