CN100345540C - 蛇葡萄素在制备与醛糖还原酶相关疾病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防和/或治疗与醛糖还原酶相关疾病的药物，其含有预防和/或治疗与醛糖还原酶相关疾病的有效量的蛇葡萄素和药学可接受赋形剂，其中所述与醛糖还原酶相关疾病包括高血糖并发症，高血糖并发症包括糖尿病并发症。本发明还公开了所述药物在制备预防和/或治疗与醛糖还原酶相关疾病的药物中的用途。
Description
发明领域
本发明属于天然药物领域。
发明背景
随着生活水平的提高，糖尿病和其他高血糖病有逐年上升的明显趋势，1985年全世界患糖尿病人数为3000万人，1995年为1.35亿人，预计2005年超过2亿人，我国现有糖尿病人数约4000万人。糖尿病与癌症、心血管病并称世界三大疾病，一旦患病终生均需治疗。由糖尿病并发症(diabetic chronic complications，DCC)引起的死亡数在发达国家名列第三名，目前尚无根治的药物。单纯控制糖尿病患者的血糖浓度并不能解决患者的所有问题，糖尿病并发症才是糖尿病人至残和早亡的主要原因，也是现在药物开发攻克的一重要方向。大量数据表明，醛糖还原酶和糖尿病并发症有密切关系。在血糖浓度升高时，己糖激酶被葡萄糖饱和，大量葡萄糖经醛糖还原酶转变为山梨醇，由于山梨醇转化为果糖的速率低于山梨醇生成的速率，且山梨醇分子不易透过细胞膜进到血液循环，因而在细胞内大量储积而引起细胞内高渗效应、细胞水肿、细胞膜通透性发生变化，导致一系列病理变化，从而诱发糖尿病并发症，如：白内障、视网膜病变、神经病变、肾脏病变等。因此，抑制多元醇途径中的关键酶—AR(aldose reductase)是防止和改善DCC的有效方法，国外已有多种此类药物进入临床，如索比尼尔、托瑞司他，后因严重的副作用或疗效等原因又终止了临床实验或退出了市场。依帕司他是现临床上使用的较好的醛糖还原酶抑制剂ARI(aldosereductase inhibitor)，其于1996年在日本上市，其疗效较好，毒副作用相对较小，但是，依帕司他仍然有如下副作用：约1％肝功能指数(ALT，AST或Y GT)上升，其他反应则包括腹泻，皮肤红疹，水疤。血浆Greatinine浓度上升等。糖尿病患者是需要终身服用药物的，寻找疗效更好、副作用更低的药物是急需解决的问题。
本发明的详细描述
本发明的目的是提供一种新的疗效较好、副作用更低的预防和/或治疗与醛糖还原酶相关的疾病的药物。
本发明的另一目的是提供一种新的疗效较好、副作用更低的预防和/或治疗高血糖并发症包括糖尿病并发症的药物。
本申请人令人惊奇地发现蛇葡萄素在预防和/或治疗高血糖病并发症包括糖尿病并发症的制药领域具有较好的用途。尤其是其疗效好、副作用低的特点，有望成为极具竞争力的预防和/或治疗高血糖病并发症包括糖尿病并发症的药物。
醛糖还原酶(AR)是聚醇代谢通路中的关键酶，它催化己糖的还原反应，将葡萄糖和半乳糖转化为相应的还原产物山梨醇和半乳糖醇，山梨糖醇再在山梨醇脱氢酶的作用下氧化成果糖。在正常生理情况下，聚醇代谢途径一般不起作用。但是，人体在高血糖的情况下，醛糖还原酶被激活，促使体内的葡萄糖转化为山梨醇，半乳糖醇转化为半乳糖醇，山梨醇脱氢酶和半乳糖脱氢酶的活力并未成比例的相应增加，导致山梨醇和半乳糖醇的聚集。大量研究证实，山梨糖醇的聚集和糖尿病并发症如眼部组织病变、神经病变、肾脏病等密切相关。临床上已经证实，抑制醛糖还原酶的活性，降低山梨醇的积累，是治疗糖尿病并发症和其他高血糖病的有效方法之一。
本发明的另一目的是寻找一种与现有用药不同类型的AR抑制剂，现在临床上使用的是Carboxylic acids和Hydantoins，后者因为有过敏反应停用，前者是目前使用较好的一类药，典型代表是Epalrestat和Tolrestat。但是，Carboxylic acids的抑制剂不仅仍有副作用，且对糖尿病并发症的治疗作用仍然有一定局限性，如依帕司他仅仅对视网膜病变程度较轻微者，服用Epalrestat后，病变恶化的程度要比病变严重者为缓和，对其他并发症则几无效果；Tolrestat的情况类似，发现麻木感与运动神经功能服用Tolrestat组要比控制组改善为多，但疼痛感与感觉神经功能则无多大进步。
本发明的原理是：寻找一种醛糖还原酶抑制剂，由于其抑制了醛糖还原酶的活性，因此由醛糖还原酶引起的疾病即可能得到控制，如细胞内山梨醇浓度的聚集导致的白内障、视网膜病变、神经病变、肾脏病变等，细胞内肌纤维醇浓度下降导致的高血糖并发症，如神经病变等，NADPH与NAD+等辅酶缺乏引起的需要NADPH与NAD+等辅酶的生理反应，细胞内Na+大幅升高，K+，ATP、游离胺基酸与还原态Glutathione的浓度下降，Na+与CI-的浓度上升，导致细胞渗透压增高，导致高血糖并发症。
本发明采用的方法是：以还原辅酶-II为辅酶，以依帕司他作为阳性对照，检测蛇葡萄素对醛糖还原酶的抑制效果。从实验中发现，蛇葡萄素是一种较好的AR抑制剂。且随着蛇葡萄素含量的增加，其抑制活性也增加；见表1和表2。
本发明还令人惊奇的发现蛇葡萄素不仅不会导致转氨酶升高，正相反，它对降低
转氨酶具有明显的疗效。
本发明还发现通过蛇葡萄素和依帕司他的酶动力学的比较，蛇葡萄素对AR的抑制机理不同于依帕司他，依帕司他属于反竞争型抑制，蛇葡萄素属于竞争-反竞争的混合型抑制，见图1。这也预示着蛇葡萄素对依帕司他无效的糖尿病并发症有效。
(1)由不加抑制剂的直线方程知：1/Vmax＝79.36，1/Km＝7.87×106。(2)依帕司他为反竞争抑制1/V′max＝1/Vmax(1+[I0]/Ki)，[I0]为2×10-6M，从y＝163.42+1.0×10-5x知V′max＝163.42，将1/V′max、1/Vmax[I0]代入方程计算知依帕司他的抑制常数Ki为1.89×10-6M
(3)显齿蛇葡萄素为混合型抑制，1/V′max＝1/Vmax(1+[I0]/K′i)，[I0]为20×10-6M，从y＝111.47+3×10-5x知1/K′m＝3.72×1061/V′max＝111.47，将1/V′max、1/Vmax[I0]代入方程[49]计算知显齿蛇葡萄素的抑制常数K′i为4.94×10-5M
由1/K′m＝1/Km×(1+[I0]/K′i)/(1+[I0]/Ki)计算知显齿蛇葡萄素Ki为1.01×10-5M；由K′i＞Ki知蛇葡萄素为竞争-非竞争型抑制
本发明提供了蛇葡萄素在制备预防和/或治疗高血糖疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括糖尿病并发症。根据本发明，蛇葡萄素可以制备成预防和/或治疗糖尿病并发症和高血糖病药。根据本发明，蛇葡萄素本身可以直接药用，也可以通过药物领域常规配制技术和载体，配制成药物组合物。本发明组合物可以制成针剂、片剂、冲剂、滴丸、口服液、缓释药物、颗粒剂，胶囊，外用药。但是本领域技术人员也可以根据需要用本领域公知的技术和载体配制成其它剂型。优选蛇葡萄素对人施用的剂量是0.1mg-100mg/千克体重/天，但是也可以根据具体情况而定，不局限于此范围。
实施例1：不同蛇葡萄素浓度对醛糖还原酶的抑制活性：
以依帕司他作为阳性对照药，醛糖还原酶(AP)作为酶，还原型辅酶-II(NADPH)作为辅酶，样品溶解液为：0.1Mol的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，5mmol的巯基乙醇，0.5Mol的Li2SO4，250μMol的NADPH，75μg/l的AP。阴性对照为不加任何抑制剂的溶液，阳性对照为不同浓度的依帕司他，试验样品为蛇葡萄素，将上述溶液配好后，加入终浓度为0.5mmol的底物DL-甘油醛，混匀，测定波长为340nm的吸光度，每分钟检测一次，连续记录10分钟。
测定的结果见表1：
表1、不同样品浓度对醛糖还原酶的抑制活性
| 样品 | 样品浓度/活性 | 样品浓度/活性 | 样品浓度/活性 | 样品浓度/活性 | 样品浓度/活性 | 样品浓度/活性 |
| 阳性对照 | 10-8M/10.66 | 10-7M/11.16 | 10-6M/7.27 | 2×10-6M/4.71 | 5×10-6M/2.89 | 10-8M/2.24 |
| 蛇葡萄素 | 10-7M/11.72 | 10-6M/11.69 | 10-5M/10.53 | 2×10-5M/6.53 | 5×10-5M/5.61 | -- |
由表1结果可知：蛇葡萄素对AP具有明显的抑制活性，且随浓度的提高，其抑制活性越强。因此蛇葡萄素对与AR相关的疾病具有预防和治疗作用。
实施例2：不同底物浓度时蛇葡萄素对醛糖还原酶的抑制活性：
以依帕司他作为阳性对照药，醛糖还原酶(AP)作为酶，还原型辅酶-II(NADPH)作为辅酶，样品溶解液为：0.1Mol的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，5mmol的巯基乙醇，0.5Mol的Li2SO4，250μMol的NADPH，75μg/l的AP。阴性对照为不加任何抑制剂的溶液，阳性对照为不同浓度的依帕司他，试验样品为蛇葡萄素，将上述溶液配好后，加入不同浓度的底物DL-甘油醛，混匀，测定波长为340nm的吸光度，每分钟检测一次，连续记录10分钟。
测定的结果见表2：
表2、不同底物浓度时样品对醛糖还原酶的抑制活性
| 样品 | 底物浓度(mmol)/活性 | 底物浓度(mmol)/活性 | 底物浓度(mmol)/活性 | 底物浓度(mmol)/活性 | 底物浓度(mmol)/活性 | 底物浓度(mmol)/活性 |
| 阴性对照 | 5/12.79 | 4/11.91 | 2/12.19 | 1/11.68 | 0.5/9.27 | 0.1/5.59 |
| 阳性对照(2×10-6M) | 5/9.58 | 4/8.06 | 2/7.67 | 1/6.53 | 0.5/6.00 | 0.1/5.19 |
| 蛇葡萄素(20×10-6M) | 5/6.76 | 4/6.35 | 2/6.20 | 1/4.71 | 0.5/4.27 | 0.1/3.45 |
结论：蛇葡萄素在不同底物浓度时，都具有对AR的抑制活性。
实施例3：将实施例1和实施例2得到的结果进行酶动力学分析，得到了图1的动力学曲线，由图1的结果可知，蛇葡萄素的抑制类型不同于依帕司他，蛇葡萄素为竞争-非竞争型抑制。推理见“本发明的详细描述”。
实施例4：蛇葡萄素对四氯化碳引起的小鼠试验性肝损伤的影响：
将动物随机分为六组：正常对照组、阳性对照组、模型对照组、蛇葡萄素组三组：100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg。正常对照组是动物不给任何药，只给溶剂；阳性对照组为联苯双酯200mg/kg，qdx6，po，联苯双酯为常用的肝炎治疗药，以联苯双酯治疗模型动物，观察疗效，作为对照；模型对照组为检验药效，动物必须先制成肝炎模型，使动物患肝炎；蛇葡萄素组是在上述模型基础上，再给蛇葡萄素，以观察疗效，三组都为Bidx6 po。各组动物分组给药，每组10只小鼠，一日两次，服用体积0.5ml/20g小鼠，连续服用六天，末次给药后1小时腹腔注射1％四氯化碳油溶液0.2ml/只小鼠，空腹16小时后由眼眶静脉采血，分离血清，测定血清的SGPT(ALT)、SGOT(AST)含量和血清总胆红素(T-BIL苯甲酸钠咖啡因比色法)含量，并与阳性对照组、正常对照组、模型对照组比较，模型对照组服用等量相应溶剂，阳性对照组采用联苯双酯200mg/kg，pox6，每日一次。结果见表3。
表3.蛇葡萄素对四氯化碳引起小鼠肝损伤的血清SGOT的变化
| 组别 | 剂量mg/kg | 血清SGPT(U)X±SD | 血清SGOT(U)X±SD | T-BIL |
| 模型对照组 | 0Bidx6po | 109.2±9.8 | 83.7±4.6 | 5.78±2.91 |
| 蛇葡萄素 | 50Bidx6po | 108.3±10.12 | 79.4±10.3 | |
| 蛇葡萄素 | 100Bidx6po | 85.3±4.34 | 71.0±10.4 | 4.24±2.11 |
| 蛇葡萄素 | 200Bidx6po | 68.3±4.89* | 68.4±9.2** | 3.42±1.32 |
| 联苯双酯 | 200qdx6po | 63.6±4.10** | 61.2±4.2** | 3.12±1.24 |
*P＜0.05 **P＜0.01与模型组比较
从表3的数据可以看出蛇葡萄素具有极好的治疗肝炎的作用。以及降低T-BIL含量，显示蛇葡萄素用明显的降酶退黄的保肝作用，且各种转氨酶的指数下降。
实施例5：蛇葡萄素对D-半乳糖胺致小鼠肝损伤的保护作用
将动物随机分为六组，阳性对照组、模型对照组、正常对照组、蛇葡萄素组分为三组：100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg，各组的意义同上述实施例4。正常对照组、模型对照组服用相应的溶剂，阳性对照组腹腔注射200mg/kg，pox6，qd，末次给药后1小时D-半乳糖胺100mg/kg，16小时后由眼眶取血，分离血清，测定血清SGPT，血清SGOT的变化，结果见表4：
表4蛇葡萄素对D-半乳糖胺致小鼠肝损伤的血清SGPT，SGOT的变化
| 组别 | 剂量mg/kg | 血清SGPT(U)X±SD | 血清SGOT(U)X±SD |
| 正常对照组 | 相应溶剂 | ＜40 | 33.7±4.7 |
| 模型对照组 | 相应溶剂 | 90.7±17.3 | 58.3±15.5 |
| 蛇葡萄素 | 50Bidx6po | 48 | 50 |
| 蛇葡萄素 | 100Bidx6po | 34±12.8 | 41.2±11.0 |
| 蛇葡萄素 | 200Bidx6po | 22.4** | 31.8* |
| 联苯双酯 | 200qdx6po | 23.6±3.9** | 33.8±15.2* |
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较
从表4的数据可以看出蛇葡萄素具有极好的保肝作用，且各种转氨酶的指数下降。
实施例6：蛇葡萄素的急性毒性研究：
取小鼠预试后，另选取20只小鼠，雌雄各半，以蛇葡萄素的最大浓度和最大体积给小鼠灌胃给药，24h给药3次，连续观察7d，记录小鼠活动行为、大小便和饮食等情况。结果：观察7天，未见动物有行为异常、死亡等情况，体重正常增长。计算其最大灌胃量为26.0g·kg-1。
Claims (6)
1.蛇葡萄素在制备醛糖还原酶抑制剂药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述醛糖还原酶抑制剂药物包括治疗高血糖病并发症。
3.根据权利要求2的用途，其中所述高血糖病并发症包括糖尿病并发症。
4.根据权利要求3的用途，其中所述糖尿病并发症包括白内障、视网膜病变、神经病变、肾脏病变。
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述药物是药学中可接受的常规剂型。
6.根据权利要求5的用途，其中所述剂型包括片剂，胶囊，冲剂，颗粒剂，针剂，滴丸，口服液，缓释药物。
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