CN100334945C - 一种野牛草成熟种子的灭菌方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种野牛草成熟种子的灭菌方法，主要步骤包括：将野牛草种子从果颖中取出，用稀释的洗涤剂洗涤，并在流动的自来水中冲洗，进行常规灭菌预处理。在无菌条件下，70～75%乙醇溶液对种子灭菌30～60s后，用高浓度NaClO溶液对其振荡灭菌20～30min，然后用无菌水冲洗5～10次，种子去污染率达95%以上。

Description

一种野牛草成熟种子的灭菌方法
技术领域：
本发明涉及一种野牛草成熟种子的灭菌方法，属于生物技术领域。
背景技术：
植物材料的灭菌是植物组织培养工作中的重要环节，是取得植物组织培养成功的最基本的重要前提和根本保证。它既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。而不同的植物材料所带的菌种类及带菌量存在很大的区别，因此对不同的外植体均需通过大量试验探索其合适的灭菌方式。
目前常用的植物材料的杀菌剂有如下几种：
(1)乙醇。由于乙醇具有脱水作用和一定的溶脂性，所以它能使蛋白质脱水、变性、沉淀及质膜破损、透性增加，使微生物致死，是一种常用的外植体表面杀菌剂。70％(w/v)的乙醇对细胞具有很强的穿透性和杀伤力，故用乙醇作杀菌剂，灭菌时间不宜过长，约30s即可杀死外植体表面的绝大部分微生物。因植物材料不同，一般控制在5～60s之间，种子的灭菌可适当延长。延长灭菌时间会增加外植体损伤的程度。
(2)升汞。升汞(二氯化汞，HgCl2)是重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。HgCl2具有极强的杀菌能力，10-6HgCl2溶液在37℃下，2小时可完全杀死50亿个农杆菌/毫升。在室温下，通过用0.1％HgCl2灭菌10min左右可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及芽抱，是一种极有效的杀菌剂，具有广谱性。
(3)新洁尔灭。新洁尔灭是一种广谱表面活性灭菌剂。它对绝大多数植物外植体伤害很小，效果很好。通常使用1∶200的稀释液，刷洗、浸泡外植体30min，甚至可更长些时间。
(4)次氯酸盐。次氯酸盐是一种强氧化剂，具有杀菌作用。常用的次氯酸盐有钠盐和钙盐。次氯酸钠通常为微黄色或无色的澄清液体，含有效氯约5％，应用广泛。次氯酸盐在水中形成次亚氯酸(HClO)，次亚氯酸分解后形成盐酸和新生态氧(O-)，具有极强的氧化性，故具有杀菌作用。组培中使用的次氯酸盐浓度以有效氯计算，通常在0.5～2.5％之间，灭菌时间在5-15min。次氯酸钠最后分解成氯和氧气排入大气中，灭菌处理后易于除去，不留残毒，在组织培养工作中应用较为广泛。
(5)抗生素类杀菌剂。抗生素是生物代谢的产物，一般是通过阻断微生物的正常代谢途径使微生物致死。常用的有链霉素、青霉索、庆大霉素、金霉素、四环素和杀真菌剂(fungicide)、多菌灵等生化类物质。但由于抗生素杀菌剂对外植体的生长也有明显的的抑制作用，在植物组织培养中的应用不多见。
不同的外植体类型，其灭菌方法存在很大的区别：
(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒。消毒时先用75％酒精浸泡10～30S，以无菌水冲洗2～3次后，按材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，分别采用有效氯为0.2％～1％的NaClO溶液或0.1％HgCl2浸泡10～15min；若材料表面再用无菌水冲洗3～4次即可。
(2)果实和种子的消毒。视果实和种子的洁净程度，用自来水充分冲洗后，再用70％酒精迅速漂洗一次。果实灭菌一般用有效率为0.2％NaClO溶液浸10min，后用无菌蒸馏水冲洗2～3次后，就可取出果实内的种子或组织进行培养。种子则先要用2％NaClO溶液浸泡20～30min，对难以消毒的还可以用0.1％升汞或1％～2％溴水消毒5min。
(3)根及地下部器官的消毒。一般用0.1％～0.2％升汞浸5～10min或2％NaClO溶液浸泡10～15min，然后以无菌水冲洗3次，即可达到灭菌效果。
对污染严重的外植体，尤其由内源细菌引起的污染，无论用何种表面消毒方法都不能彻底消除，可以在培养基中加入杀菌剂。但通常对植物材料的生长产生明显的抑制作用。
野牛草原产北美中部温带和亚热带半干旱地区。是一种生长缓慢，耐寒、耐热、抗旱性强的暖季型多年生低矮草坪草。能在低等护养水平下保持优良品质。极具抗旱性是其最突出的特征之一，它能在极端干旱时进入休眠状态，一旦条件适宜又迅速恢复生长。野牛草匍匐茎发达，有时也有根茎发生。其匍匐茎的侵占性、生长习性及草皮的致密特性使其具有较强的水土保持能力。
长期以来，培育绿期长的新品种是人们的育种重点之一，但遗憾的是，到目前为止，绿期明显延长的野牛草新品种仍未培育成功。究其原因，可能是由于传统育种方法对这一性状的改良存在局限性。因此，寻找新的育种技术对这一性状进行改良势在必行。现代生物技术，如细胞工程、基因工程等在水稻等农作物育种中的成功应用为利用现代生物技术对野牛草进行品种改良提供重要借鉴。而利用现代生物技术进行品种改良的前提是建立其高频、稳定的再生体系。
野牛草离体培养及植株再生的研究已有个别报道，外植体均为幼穗或叶片基部，且再生率较低，难以满足遗传转化的需要。野牛草种子相比幼穗等类型外植体，易收集、耐贮藏，目前为止，以其为外植体获得再生植株未见成功报道。其中一个重要影响因素之一是，野牛草成熟种子伴有内生菌，且带菌量大，采用上述灭菌方法难以建立理想的无菌体系，一些学者对其灭菌方式进一步进行了探索，如采用70％的乙醇与0.1％升汞组合灭菌，当70％的乙醇处理时间至60s，0.1％升汞处理10～20min时，去污染率平均约为33％，种子萌芽率为83％；当70％的乙醇处理时间延长至90s，0.1％升汞处理延长至30min时，去污染率平均约为61％，仍未达到理想效果，而种子受到严重损伤，种子萌芽率仅为60％。
发明内容
鉴于现有技术研究进展及其存在的不足，本发明以野牛草成熟种子为试验材料，对种子进行灭菌预处理后将然后在无菌条件下，用70～75％酒精及高浓度NaClO溶液灭菌20～30min，无菌水冲洗5～10次后，去菌率达95％以上，有效地建立了以野牛草成熟种子为外植体的无菌体系。且方法简单易行，便于推广应用。
本发明以野牛草成熟种子为外植体，提供了一种建立其无菌体系的方法。
本发明中所述的野牛草成熟种子包括野牛草属的所有品种。
本发明中野牛草成熟种子含大量真菌及其它种类菌，对种子化学解除休眠处理后，仍带有大量菌。采用常规灭菌方法很难达到理想灭菌效果。
本发明是所述的常规灭菌方法是指多年来在植物组织培养中经常采用的外植体灭菌方式，主要包括：(1)70％的乙醇与0.1％升汞组合灭菌，(2)70％的乙醇与有效氯为0.2～2％NaClO溶液组合灭菌，(3)稀释的新洁尔灭灭菌，(4)培养基中添加抗生素及杀菌剂。(5)高低温处理等物理方法灭菌。
本发明中所述的灭菌预处理是指将野牛草成熟种子从其果颖中取出后，用稀释的洗涤剂对其洗涤后，流动的自来水充分冲洗并浸泡6～48小时。
本发明中所采用的70～75％乙醇溶液灭菌方式是将经灭菌预处理的种子转入无菌容器内，倒入70～75％乙醇溶液至没过种子，灭菌过程不断振荡，计时从倒入容器开始，将容器内乙醇溶液倒出后计时结束，时间为30～60s。
本发明中采用的高浓度NaClO溶液是指有效氯在5％～10％以上，是常规用量的2倍以上，灭菌时间为20～30min，是常规灭菌时间的2～3倍。灭菌方式是将用70～75％乙醇溶液灭菌处理过的种子转入无菌容器，向容器内倒入有效氯为5～10％的NaClO溶液充分振荡灭菌，20～30min时，倒出NaClO溶液，并迅速用无菌水冲洗灭菌过的种子5～10次。
本发明所述方法的具体步骤为：(1)将野牛草成熟种子用一定浓度的洗涤剂溶液洗涤后，用流动的自来水充分冲洗6～48小时，完成灭菌预处理，(2)将灭菌预处理后的种子在无菌条件下转入灭菌过的容器，向容器内倒入70～75％的乙醇溶液，不断振荡灭菌，30～60s后，将该容器内的乙醇溶液倒出，在原容器内或将种子再转移到无菌新容器内，(3)倒入有效氯在5％以上的NaClO溶液，不断振荡，保证材料灭菌充分，20～30min后，将容器内的NaClO溶液倒出，(4)然后，迅速向该容器内倒入灭菌过的无菌水，振荡洗涤1～3分钟，倒出，如此重复5～10次后，即可接种到培养基或作其它处理，从而建立野牛草成熟种子的无菌体系。
具体实施方式：
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1：
将野牛草成熟种子用一定浓度的洗涤剂溶液洗涤后，用流动的自来水充分冲洗24小时，种子充分吸胀，将灭菌预处理后的种子在无菌条件下转入灭菌过的容器，向容器内倒入70～75％的乙醇溶液，不断振荡灭菌，60s后，将该容器内的乙醇溶液倒出，在原容器内倒入有效氯为5％的NaClO溶液，不断振荡，保证材料灭菌充分，20min后，将容器内的NaClO溶液倒出，然后，迅速向该容器内倒入灭菌过的无菌水，振荡洗涤1～3分钟，倒出，如此重复5～10次后，接种到培养基，培养1周后，调查污染情况种子生活力，结果为种子去污染率为96.34％，种子萌芽率达87.75％。
实施例2：
野牛草成熟种子的灭菌预处理及灭菌过程均按实施例1进行，不同之处在于，预处理过程流动自来水的冲洗时间为12小时，有效氯为5％的NaClO溶液对种子灭菌的时间为25min，调查结果为种子的去污染率为98.79％，种子萌芽率达85.48％。
实施例3：
野牛草成熟种子的灭菌预处理及灭菌过程均按实施例1进行，不同之处在于，预处理过程流动自来水的冲洗时间为36小时，有效氯为5％的NaClO溶液对种子灭菌的时间为30min，调查结果为种子的去污染率为99.41％，种子萌芽率达88.78％。
实施例4：
野牛草成熟种子的灭菌预处理及灭菌过程均按实施例1进行，不同之处在于，预处理过程流动自来水的冲洗时间为24小时，有效氯为7％的NaClO溶液对种子灭菌的时间为20min，调查结果为种子的去污染率为98.42％，种子萌芽率达88.55％。
实施例5：
野牛草成熟种子的灭菌预处理及灭菌过程均按实施例1进行，不同之处在于，预处理过程流动自来水的冲洗时间为24小时，有效氯为7％的NaClO溶液对种子灭菌的时间为25min，调查结果为种子的去污染率为99.35％，种子萌芽率达80.69％。
实施例6：
野牛草成熟种子的灭菌预处理及灭菌过程均按实施例1进行，不同之处在于，预处理过程流动自来水的冲洗时间为24小时，有效氯为7％的NaClO溶液对种子灭菌的时间为30min，调查结果为种子的去污染率为99.55％，种子萌芽率达72.25％。

Claims (2)

1.一种野牛草成熟种子的灭菌方法，其特征在于将野牛草成熟种子清洗干净，用70～75％乙醇溶液灭菌30～60s，用有效氯在5％～10％的NaClO溶液灭菌20～30min。
2.按照权利要求1的方法，具体步骤为：(1)将野牛草成熟种子用一定浓度的洗涤剂溶液洗涤后，用自来水充分冲洗浸泡6～48h，(2)经预处理后的种子在无菌条件下，70～75％的乙醇溶液灭菌30～60s，用有效氯在5～10％的NaClO溶液灭菌20～30min，(3)用灭过菌的无菌水充分冲洗种子5～10次后，即可用于接种或其它处理。
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