CH705287A2

CH705287A2 - Dividing drops at microfluidic junction comprising supply channel, first and second discharge channels, comprises supplying drops to microfluidic junction, and controlling ratio of flow rates by pumping or aspirating continuous liquid

Info

Publication number: CH705287A2
Application number: CH8342012A
Authority: CH
Inventors: Slawomir Jakiela; Tomasz Kaminski; Krzystof Churski; Piotr Garstecki
Original assignee: Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2011-07-27
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2013-01-31
Also published as: PL395778A1; CH705287B1

Abstract

Dividing drops at a microfluidic junction comprising a supply channel, a first discharge channel having an additional channel, and a second discharge channel, comprises (a) supplying the drops to the microfluidic junction through the supply channel (2) by flowing continuous liquid through the channel, the first discharge channel (5) and the second discharge channel (6), and (b) controlling the ratio of the flow rates in the discharge channels by pumping or aspirating the continuous liquid through the additional channel (9). Dividing drops at a microfluidic junction comprising a supply channel, a first discharge channel having an additional channel, and a second discharge channel, comprises (a) supplying the drops to the microfluidic junction through the supply channel (2) by flowing continuous liquid through the channel, the first discharge channel (5) and the second discharge channel (6), and (b) controlling the ratio of the flow rates in the discharge channels by pumping or aspirating the continuous liquid through the additional channel (9), at least until the time point, when the portion of the drops present in the first discharge channel (5) separates from the portion of the drops present in the second discharge channel.

Description

[0001] Der Gegenstand der Erfindung sind technische Lösungen zur Teilungen von Tropfen nach Bedarf (engl, on demand droplets) an einer mikrofluidischen Kreuzung, d.h. ein Verfahren zur Teilung von Tropfen mit bekannter Zusammensetzung in zwei Tropfen in einstellbaren Verhältnissen sowie automatisierte Techniken zur bedarfsgemässen Teilung der Tropfen in einem solchen Mikrofluidiksystem. The subject of the invention are technical solutions for the division of drops on demand (engl, on demand droplets) at a microfluidic intersection, i. a method for dividing drops of known composition into two drops in adjustable ratios and automated techniques for dividing the drops as required in such a microfluidic system.

[0002] Die erfindungsgemässen Lösungen, in Verbindung mit den Modulen, die in vorhergehenden Patentanmeldungen der Arbeitsgruppe von Doz. Piotr Garstecki (bisher unveröffentlichte polnische Anmeldungen Nr. P-390 250, P-390 251, P-393 619 und internationale Anmeldung Nr. PCT/PL2011/050 002) beschrieben sind, können bei langfristiger Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen, oder auch zur Durchführung von chemischen Analysen innerhalb der Tropfen sowie zur Ablesung der Ergebnisse dieser Reaktionen in der Abhängigkeit von der kontrollierten chemischen Zusammensetzung der Fluidproben und deren Position in den mikrofluidischen Systemen, verwendet werden. Besonders bevorzugte Systeme gemäss der Erfindung können bei langfristigen Untersuchungen des Wachstums der Mikroorganismen unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen benutzt werden, d.h. bei verschiedenen Nährbodenkonzentrationen oder in Gegenwart wachstumshemmender Mittel, z.B. Antibiotika, und auch anderer Substanzen, die die Physiologie der Mikroorganismen beeinflussen. Die Grundlage für eine langfristige Kultivierung ist die zyklische Beseitigung eines Teils der Kultur und Zusetzen einer genau festgelegten Portion neuen Nährbodens. The solutions according to the invention, in connection with the modules, which are in previous patent applications of the working group of Doz. Piotr Garstecki (previously unpublished Polish applications No. P-390 250, P-390 251, P-393 619 and international application No. PCT / PL2011 / 050 002) can be used for long-term cultivation of microorganisms or cell cultures, or for performing chemical analyzes within the drops and for reading the results of these reactions, depending on the controlled chemical composition of the fluid samples and their position in the microfluidic systems. Particularly preferred systems according to the invention can be used in long-term studies of the growth of the microorganisms under various cultivation conditions, i. at different nutrient media concentrations or in the presence of growth inhibiting agents, e.g. Antibiotics, as well as other substances that affect the physiology of microorganisms. The basis for long-term cultivation is the cyclical removal of part of the culture and the addition of a precisely defined portion of new nutrient medium.

[0003] Immer zahlreichere Mitteilungen über die Anwendung der mikrofluidischen Systeme in biologischen Wissenschaften erlauben eine sehr schnelle Entwicklung der Lab-on-a-Chip-Technologie in nächster Zukunft vorzusehen. Besonders versprechend ist die Verwendung der in den Mikrokanälen zu erzeugenden Tropfen als miniaturisierte Reaktoren wegen ihrer kleinen Volumina von Mikrolitern, durch Nanoliter bis Pikoliter. The increasing number of communications about the application of microfluidic systems in biological sciences allow a very rapid development of the lab-on-a-chip technology to be provided in the near future. The use of the droplets to be generated in the microchannels as miniaturized reactors is particularly promising because of their small volumes from microliters, from nanoliters to picoliters.

[0004] Die tropfenbasierten Mikrosysteme zeichnen sich normalerweise durch eine Vielzahl von mikrofluidischen Kanälen mit ihren Einlassen und Auslässen aus, die innerhalb des Systems sich verbinden können und in denen Tropfen erzeugt werden, die mit einer mit den Tropfen nicht mischbaren kontinuierlichen Phase umgeben sind. Weiterhin, können die Tropfen in den Mikrosystemen vereinigt, entlang der Kanäle bei Durchmischen ihres Gehalts transportiert, unter fixierten oder variablen Bedingungen festgehalten oder letztendlich an Kanalkreuzungen sortiert oder geteilt und aus dem System zurückgewonnen werden. Die Verwendung der Mikrolabors bei der Durchführung von chemischen und biochemischen Reaktionen innerhalb der Mikrotropfen hat folgende Vorteile [H. Song, D. L. Chen and R. F. Ismagilov, Ang, Chem. Int. Ed., 2006, 45, 7336-7356]: i) keine Zeitdispersion der Aufenthaltsdauer des Fluids im Kanal, ii) schnelle Durchmischung, iii) Möglichkeit einer einfachen Kontrolle über die Reaktionskinetik, iv) parallele Durchführung vieler Reaktionen möglich, v) reduzierter Verbrauch von Reagenzien vi) schnellerer Nachweis von Reaktionsergebnissen (durch kleines Tropfenvolumen erreichen die Reaktionsprodukte schneller eine messbare Konzentration). The drop-based microsystems are usually characterized by a large number of microfluidic channels with their inlets and outlets, which can connect within the system and in which drops are generated that are surrounded by a continuous phase that is immiscible with the drops. Furthermore, the droplets can be combined in the microsystems, transported along the channels when their content is mixed, held under fixed or variable conditions or finally sorted or divided at channel intersections and recovered from the system. The use of the micro-laboratories in carrying out chemical and biochemical reactions within the microdroplets has the following advantages [H. Song, D. L. Chen and R. F. Ismagilov, Ang, Chem. Int. Ed., 2006, 45, 7336-7356]: i) no time dispersion of the length of stay of the fluid in the channel, ii) rapid mixing, iii) possibility of simple control of the reaction kinetics, iv) parallel execution of many reactions possible, v) reduced consumption of reagents vi) faster detection of reaction results (due to the small drop volume, the reaction products reach a measurable concentration more quickly).

[0005] Hinsichtlich dieser Eigenschaften können die tropfenbasierten Mikrosysteme ein wertvolles Werkzeug für analytische Chemie, Biochemie, Mikrobiologie, medizinische Diagnostik oder auch molekulare Diagnostik darstellen. With regard to these properties, the drop-based microsystems can represent a valuable tool for analytical chemistry, biochemistry, microbiology, medical diagnostics or also molecular diagnostics.

[0006] Eine der unerlässlichen, in tropfenbasierten mikrofluidischen Systemen durchzuführenden Operationen ist die Teilung der Tropfen. Im Stand der Technik gibt es einige Verfahren zur Aufteilung der Tropfen an einer T-Kreuzung in einem mikrofluidischen System, wo die kontinuierliche (Kanalwände benetzende) Phase eine Flüssigkeit ist [D. R. Link, S. L. Anna, D. A. Weitz, and H. A. Stone. Phys. Rev. Lett 2004, 92, 4] [J. Nie and R. T. Kennedy, Anal. Chem. 2010, 82, 7852-7856]. Mithilfe entsprechender Geometrie ist es möglich, einen Tropfen im umgekehrt proportionalen Verhältnis zu Flusswiderständen an jedem der zwei Abzweigungen einer T-Kreuzung zu zerspalten. Eine ungünstige Eigenschaft dieser Lösung ist es jedoch, dass die Proportion der Teilung durch die Geometrie des mikrofluidischen Systems im Voraus definiert sind sowie die Tatsache, dass sich die Teilungsproportion über eine kontrollierbare Änderung beim Systembetriebs nicht steuern lässt. [0006] One of the essential operations to be carried out in drop-based microfluidic systems is the division of the drops. In the prior art there are some methods for dividing the drops at a T-junction in a microfluidic system where the continuous (channel walls wetting) phase is a liquid [D. R. Link, S. L. Anna, D. A. Weitz, and H. A. Stone. Phys. Rev. Lett 2004, 92, 4] [J. Nie and R. T. Kennedy, Anal. Chem. 2010, 82, 7852-7856]. With the help of appropriate geometry, it is possible to split a drop in inverse proportion to the flow resistance at each of the two branches of a T-junction. An unfavorable property of this solution, however, is that the proportion of the division is defined in advance by the geometry of the microfluidic system and the fact that the division proportion cannot be controlled by a controllable change in system operation.

[0007] Im Stand der Technik gibt es viele Beispiele für durchgeführte Untersuchungen und Bestimmungen von Zellkulturen (Bakterien, Hefen und Säugerzellen) innerhalb der Tropfen in einem mikrofluidischen System [J. Q. Boedicker, L. Li, T. R. Kline, and R. F. Ismagilov, Lab Chip 2008, 8,1265-1272] [C. H. J. Schmitz, A. C. Rowat, S. Köster, and D. A Weitz, Lab Chip 2009, 9, 44-49][J. Clausell-Tormos, D. Lieber, J. C. Baret, A. El-Harrak, O. J. Miller, L. Frenz, J. Blouwolff, K. J. Humphry, S. Köster, H. Duan, C. Holtze, D. A. Weitz, A. D. Griffiths, and C. A. Merten, Chemistry & Biology 2008,15, 427-437]. Die mit diesen Systemen durchgeführten Messungen betrafen jedoch in der Regel nicht die Analyse der Zellenphysiologie in einer langen Zeitspanne. Die Analyse in einer langen Zeitspanne erfordert, dass die Bedingungen des Zellenwachstums konstant bleiben. Bei der Kultivierung der Mikroorganismen werden die Nährsubstanzen schon nach einigen Stunden knapp, die Kultur wird gesättigt und das Wachstum gehemmt. Durch zyklische oder permanente Beseitigung von Kulturteilen und Zugabe von frischem Nährboden können ein gleichmässiges Tempo und nach Möglichkeit gleichmässige Bedingungen des Wachstums eingehalten werden. Im Stand der Technik gibt es eine Vorrichtung - das Chemostat [A. Novick and L Szilard, Science 1950,112, 715-716], das über die Fähigkeit verfügt, einen Teil der Kultur kontinuierlich mit einem frischen Nährmedium zu ersetzen, wobei die Rate des Austausches einstellbar sein kann. Im Stand der Technik gibt es einige Lösungen, die eine Miniaturisierung des Chemostats ermöglichen: i) Systeme, die auf multilagigen Elastomer-Systemen basieren [F. K. Balagadde, L. You, C. L. Hansen, F. H. Arnold, S. R. Quake, Science 2005, 309, 137] ii) miniaturisierte Systeme, deren Ausführung den in der Makroskala verwendeten Chemostaten ähnlich ist [N. Szita, P. Boccazzi, Z. Zhang, P. Boyle, A. J. Sinskey, K. F. Jensen, Lab Chip 2005, 5, 819] iii) Systeme, die Tropfenbewegung auf der Elektrodenoberfläche ausnutzen, sog. «digitale Mikrofluidik» [S. H. Au, S. C. C. Shih, A. R. Wheeler, Biomed. Microdevices 2011,13,41]. In the prior art there are many examples of tests and determinations of cell cultures (bacteria, yeasts and mammalian cells) carried out within the drops in a microfluidic system [J. Q. Boedicker, L. Li, T. R. Kline, and R. F. Ismagilov, Lab Chip 2008, 8, 1265-1272] [C. H. J. Schmitz, A. C. Rowat, S. Köster, and D. A Weitz, Lab Chip 2009, 9, 44-49] [J. Clausell-Tormos, D. Lieber, JC Baret, A. El-Harrak, OJ Miller, L. Frenz, J. Blouwolff, KJ Humphry, S. Köster, H. Duan, C. Holtze, DA Weitz, AD Griffiths, and CA Merten, Chemistry & Biology 2008, 15, 427-437]. The measurements carried out with these systems, however, usually did not concern the analysis of cell physiology over a long period of time. Analysis over a long period of time requires that the conditions of cell growth remain constant. When the microorganisms are cultivated, the nutrients become scarce after a few hours, the culture becomes saturated and growth is inhibited. By cyclical or permanent removal of parts of the culture and the addition of fresh nutrient medium, a steady pace and, if possible, even conditions for growth can be maintained. In the prior art there is a device - the chemostat [A. Novick and L Szilard, Science 1950, 112, 715-716], which has the ability to continuously replace part of the culture with a fresh nutrient medium, and the rate of replacement can be adjustable. In the state of the art there are some solutions that allow miniaturization of the chemostat: i) Systems based on multilayer elastomer systems [F. K. Balagadde, L. You, C. L. Hansen, F. H. Arnold, S. R. Quake, Science 2005, 309, 137] ii) miniaturized systems whose design is similar to the chemostats used in the macro scale [N. Szita, P. Boccazzi, Z. Zhang, P. Boyle, A. J. Sinskey, K. F. Jensen, Lab Chip 2005, 5, 819] iii) systems that utilize the movement of drops on the electrode surface, so-called "digital microfluidics" [p. H. Au, S.C.C. Shih, A.R. Wheeler, Biomed. Microdevices 2011, 13, 41].

[0008] Im Stand der Technik gibt es kein Verfahren, das eine bedeutende Vervielfachung der Anzahl von Chemostaten ermöglicht und erlaubt, sowie gleichzeitig die Kulturzüchtung in jedem der Chemostaten ermöglicht. In allen genannten Beispielen ist die Vervielfachung der Anzahl von Chemostaten mit einer bedeutenden Erhöhung der Systemkomplexität verbunden, und die Anzahl von Schlüsselelementen in der Chiparchitektur nimmt in linearer Proportion zu der Anzahl von Chemostaten zu. In the prior art, there is no method that enables and allows a significant multiplication of the number of chemostats, and simultaneously enables culture in each of the chemostats. In all of the examples cited, the multiplication of the number of chemostats is associated with a significant increase in system complexity, and the number of key elements in the chip architecture increases in linear proportion to the number of chemostats.

[0009] Es ist ratsam, dass Zwei-Phasen-Mikroflüssen, d.h. Mikrotropfen, die sich in Mikrokanälen mit einem Durchmesser von einigen bis einigen hundert Mikrometer bewegen, als eine bei einer langfristigen Züchtung von Mikroorganismen nutzbare Technologie, verwendet werden. It is advisable that two-phase microflows, i.e. Microdrops that move in microchannels with a diameter of several to several hundred micrometers can be used as a technology useful in long-term cultivation of microorganisms.

[0010] Unerwartet haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bemerkt, dass es möglich ist, ein die Führung und Beobachtungen einer langfristigen Kultivierung von Mikroorganismen erlaubendes Mikrofluidiksystem so zu konstruieren, dass jeder Tropfen als getrenntes Chemostat funktioniert. Ferner hat es sich herausgestellt, dass ein gemäss der Erfindung gefertigtes System die Kultivierung von Mikroorganismen unter variablen Bedingungen erlaubt, insbesondere bei variabler Konzentration der Substanzen, die das Wachstum der Mikroorganismen beeinflussen, z.B., Antibiotika, sowie auch bei variabler Verdünnungsrate (D), d.h. bei variablem Tempo der Beseitigung der gesättigten Kultur und der Zugabe des frischen Nährmediums. Unexpectedly, the inventors of the present invention have found that it is possible to construct a microfluidic system allowing long-term cultivation of microorganisms to be guided and monitored so that each drop functions as a separate chemostat. Furthermore, it has been found that a system manufactured according to the invention allows the cultivation of microorganisms under variable conditions, in particular with a variable concentration of the substances that influence the growth of the microorganisms, e.g. antibiotics, as well as with a variable dilution rate (D), i. at a variable rate of removing the saturated culture and adding the fresh nutrient medium.

[0011] Gemäss der Erfindung, zeichnet sich das Verfahren zur Teilung von Tropfen an einer mikrofluidischen Kreuzung, umfassend einen Zufuhrkanal, einen ersten Abfuhrkanal ausgerüstet mit einem zusätzlichen Kanal und einem zweiten Abfuhrkanal, dadurch aus, dass es die folgenden Etappen umfasst: a.<sep>Zuführung des Tropfens an die mikrofluidische Kreuzung durch den Zufuhrkanal mithilfe einer Strömung einer kontinuierlichen Flüssigkeit durch den Kanal sowie den ersten Abfuhrkanal und den zweiten Abfuhrkanal, b.<sep>Steuerung mit dem Verhältnis der Flussraten in den Abfuhrkanälen durch Fördern oder Absaugen der kontinuierlichen Flüssigkeit durch den zusätzlichen Kanal, mindestens bis zum Zeitpunkt, wenn der sich im ersten Abfuhrkanal befindende Teil des Tropfens von dem sich im zweiten Abfuhrkanal befindenden Teil des Tropfens abreisst.According to the invention, the method for dividing droplets at a microfluidic junction, comprising a supply channel, a first discharge channel equipped with an additional channel and a second discharge channel, is characterized in that it comprises the following stages: a. < sep> supply of the drop to the microfluidic junction through the supply channel with the aid of a flow of a continuous liquid through the channel as well as the first discharge channel and the second discharge channel, b. <sep> control with the ratio of the flow rates in the discharge channels by conveying or sucking off the continuous Liquid through the additional channel, at least until the point in time when that part of the drop located in the first discharge channel breaks away from the part of the drop located in the second discharge channel.

[0012] Vorzugsweise werden die Strömungen automatisch mit einem Sensor, bevorzugt mit einer Kamera gesteuert, wobei der Sensor in der Nähe der mikrofluidischen Kreuzung angebracht und unmittelbar oder mittelbar mit dem Ventil verbunden ist, über das die Strömung in dem zusätzlichen Kanal kontrolliert wird. The flows are preferably controlled automatically with a sensor, preferably with a camera, the sensor being attached near the microfluidic junction and being directly or indirectly connected to the valve via which the flow in the additional channel is controlled.

[0013] In einer bevorzugten Ausführungsvariante, ist die mikrofluidische Kreuzung eine T-Kreuzung, d.h. eine Kreuzung, in der der Zufuhrkanal, der Abfuhrkanal und der zweite Zufuhrkanal miteinander die Winkel von entsprechend 90°, 180° und 90° bilden. In a preferred embodiment variant, the microfluidic junction is a T-junction, i.e. an intersection in which the supply channel, the discharge channel and the second supply channel form the angles of 90 °, 180 ° and 90 ° with each other.

[0014] In einer anderen bevorzugten Ausführungsvariante, ist die mikrofluidische Kreuzung eine Y-Kreuzung, d.h. die Kreuzung, in der der Zufuhrkanal, der erste Abfuhrkanal und der zweite Abfuhrkanal miteinander die Winkel von entsprechend 150°, 60° und 150° bilden. In another preferred embodiment variant, the microfluidic intersection is a Y intersection, i.e. the intersection in which the supply channel, the first discharge channel and the second discharge channel form the angles of 150 °, 60 ° and 150 ° with each other.

[0015] In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsvariante, ist die mikrofluidische Kreuzung eine Kreuzung, in der der Zufuhrkanal, der erste Abfuhrkanal und der zweite Abfuhrkanal miteinander die Winkel von entsprechend 120°, 120° und 120° bilden. In yet another preferred embodiment variant, the microfluidic intersection is an intersection in which the supply channel, the first discharge channel and the second discharge channel form the angles of 120 °, 120 ° and 120 ° with one another.

[0016] Vorzugsweise, gemäss der Erfindung, wird der Tropfen im Volumenverhältnis von 1:9 bis 9:1, mehr bevorzugt von 1:99 bis 99:1, und am meisten bevorzugt von 1:999 bis 999:1, geteilt. Preferably, according to the invention, the drop is divided in a volume ratio of 1: 9 to 9: 1, more preferably 1:99 to 99: 1, and most preferably 1: 999 to 999: 1.

[0017] In der nachfolgenden Beschreibung wird ein Verfahren zur Teilung von Tropfen mittels einer kontrollierten Tropfenpositionierung und Steuerung der Öffnungszeit der Ventile, die den Abfluss der Flüssigkeit aus den Armen einer T-Kreuzung verschliessen, dargestellt. Die T-Kreuzung wird hier als eine beispielhafte und nicht einschränkende Ausführung der Erfindung diskutiert. Als eine T-Kreuzung wird im Fall der vorliegenden Erfindung eine Verbindung von drei Kanälen definiert, wobei einer von denen die Fluide zur Kreuzung zuführt, und die zwei übriggebliebenen die Fluide abführen. Charakteristisch ist, dass die die Flüssigkeit aus der T-Kreuzung abführenden Kanäle sich bedeutsam durch die Widerstände voneinander unterscheiden - der Unterschied kann sich beispielweise, aber nicht einschränkend, aus verschiedenen Querschnittflächen der Kanäle oder aus verschiedenen Kanallängen ergeben. Die Arme einer T-Kreuzung sind unter den Winkeln entsprechend von 90°, 90° und 180° zueinander positioniert. Die Fachkundigen werden doch leicht bemerken, dass die vorgestellten Verfahren bei beliebigen anderen Winkeln direkt anwendbar sind. In the following description, a method for dividing drops by means of a controlled drop positioning and control of the opening time of the valves that close the outflow of the liquid from the arms of a T-junction is shown. The T-junction is discussed here as an exemplary and non-limiting embodiment of the invention. In the case of the present invention, a T-junction is defined as a connection of three channels, one of which feeds the fluids to the junction and the two remaining channels discharge the fluids. It is characteristic that the channels discharging the liquid from the T-junction differ significantly from one another due to the resistances - the difference can, for example, but not be limiting, result from different cross-sectional areas of the channels or from different channel lengths. The arms of a T-junction are positioned at angles corresponding to 90 °, 90 ° and 180 ° to one another. Those skilled in the art will easily notice that the methods presented are directly applicable at any other desired angles.

[0018] Unerwartet haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bemerkt, dass es möglich ist, ein Mikrofluidsystem zu konstruieren, das die Tropfen in einem sehr breiten und variablen Verhältnis so zu teilen erlaubt, dass das Teilungsverhältnis für die nacheinander zu teilenden Tropfen verschieden sein kann. Ähnlich unerwartet haben die Erfinder dieser Erfindung bemerkt, dass man das Ventil im zusätzlichen Kanal, das die kontinuierliche Phase zu einem der die kontinuierliche Phase aus der T-Kreuzung abführenden Abfuhrkanäle zuführt, zu dem Zeitpunkt öffnen kann, wenn sich der zu teilende Tropfen an der T-Kreuzung befindet, oder bevor der Tropfen die Kreuzung eintritt. Dieses Verfahren reduziert den Unterschied der Widerstände zwischen den zwei Kanälen, die Flüssigkeiten aus der Kreuzung abführen. Es ist charakteristisch, dass die Tropfenposition sowie die den partiellen Ausgleich erzeugende Öffnungszeit des Ventils über die Volumina der zwei neu zu erzeugenden Tropfen entscheiden. Das Teilungsverhältnis hängt gewissermassen von der Geometrie des Systems ab, es hat sich aber unerwartet herausgestellt, dass es möglich ist, das Volumenverhältnis von zwei neu entstehenden Tropfen mithilfe entsprechender Tropfenpositionierung und an der T-Kreuzung, und anschliessend durch Erhöhung des Widerstands in einem der die Flüssigkeit aus der T-Kreuzung abführenden Kanäle, zu manipulieren. Es ist charakteristisch, dass der Unterschied der Widerstände bei dem geschlossenen Ventil im zusätzlichen Kanal das maximale Teilungsverhältnis eines Tropfens mit einem Volumen von 1 µl, für eine beispielhafte Geometrie einer T-Kreuzung, bestimmt (ein Einlasskanal mit Abmessungen grösser als 100 × 100 µm, bei Auslasskanälen mit einem Durchmesser von 100 × 100 µm erlaubt die Tropfen in einem beliebigen Volumenverhältnis von 1:999 bis 999:1 zu teilen). The inventors of the present invention have unexpectedly noticed that it is possible to construct a microfluidic system which allows the drops to be divided in a very broad and variable ratio so that the division ratio for the drops to be divided one after the other can be different. Similarly, unexpectedly, the inventors of this invention have noticed that the valve in the additional channel that feeds the continuous phase to one of the discharge channels discharging the continuous phase from the T-junction can open at the time when the drop to be divided opens at the T-junction is located or before the drop enters the junction. This procedure reduces the difference in resistances between the two channels draining fluids from the intersection. It is characteristic that the drop position as well as the opening time of the valve generating the partial equalization determine the volumes of the two new drops to be generated. The division ratio depends to a certain extent on the geometry of the system, but it has unexpectedly been found that it is possible to determine the volume ratio of two newly formed drops with the aid of appropriate drop positioning and at the T-junction, and then by increasing the resistance in one of the Manipulate fluid from the T-junction draining channels. It is characteristic that the difference in resistances with the closed valve in the additional channel determines the maximum division ratio of a drop with a volume of 1 µl, for an exemplary geometry of a T-junction (an inlet channel with dimensions greater than 100 × 100 µm, with outlet channels with a diameter of 100 × 100 µm, the droplets can be divided in any volume ratio from 1: 999 to 999: 1).

Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

[0019] Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nun in Bezug auf die beigelegten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1<sep>Schematische Darstellung eines erfindungsgemässen Mikrosystems, das zur Teilung der Tropfen an einer T-Kreuzung verwendet ist; Fig. 2<sep>Schematische Darstellung eines Mikrosystem gemäss der Erfindung, das zur Realisierung eines vervielfachten Chemostats innerhalb der Tropfen verwendet ist; Fig. 3<sep>Diagrammdarstellung der Tropfenvolumina nach einer asymmetrischen Teilung mit relativen Abweichungen des Tropfenvolumens; Fig. 4<sep>Diagrammdarstellung der Änderung der Farbstoffkonzentration im gegebenen Tropfen infolge seiner Teilung und Ergänzung des Anfangsvolumens des Tropfens mit dem vorgegebenen Fluid; Fig. 5<sep>Diagrammdarstellung der in der Zeit zunehmenden optischen Dichte in einem vervielfachten Chemostat in der Abhängigkeit von der Konzentration der Antibiotika; Fig. 6<sep>Diagrammdarstellung der in der Zeit zunehmenden optischen Dichte in 9 ausgewählten Mikrotropfen, die 3 verschiedene Konzentrationen der Antibiotika enthalten; Fig. 7<sep>Diagrammdarstellung der zyklisch zunehmenden optischen Dichte in der Zeit im gegebenen Tropfen infolge seiner Teilung und Ergänzung des Anfangsvolumens des Tropfens mit dem vorgegebenen Fluid bei mangelnder Zunahme der optischen Dichte im Kontrolltropfen, der keine Bakterien enthält, und Fig. 8<sep>Diagrammdarstellung der optischen Dichte für alle Tropfen des vervielfachten Chemostats an zwei ausgewählten Messpunkten.Preferred embodiments of the invention will now be explained in more detail with reference to the accompanying drawings. 1 shows a schematic representation of a microsystem according to the invention which is used to divide the drops at a T-junction; 2 shows a schematic representation of a microsystem according to the invention, which is used to implement a multiplied chemostat within the drops; 3 <sep> diagram representation of the drop volumes after an asymmetrical division with relative deviations in the drop volume; 4 shows a diagram of the change in the dye concentration in the given drop as a result of its division and supplementation of the initial volume of the drop with the given fluid; 5 shows a diagram of the optical density increasing over time in a multiplied chemostat as a function of the concentration of the antibiotics; 6 shows a diagram of the optical density increasing over time in 9 selected microdrops which contain 3 different concentrations of the antibiotics; Fig. 7 <sep> Diagram representation of the cyclically increasing optical density in time in the given drop as a result of its division and supplementation of the initial volume of the drop with the given fluid in the case of a lack of increase in the optical density in the control drop, which does not contain any bacteria, and FIG. 8 < sep> Diagram showing the optical density for all drops of the multiplied chemostat at two selected measuring points.

Beispiel 1example 1

[0020] In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der im Mikrokanal befindliche Tropfen in zwei Tropfen mit einstellbarem Volumenverhältnis an einer T-Kreuzung geteilt. In dem in Fig. 1a schematisch dargestellten Beispiel wird der im Kanal 2 befindliche Tropfen 1 zur T-Kreuzung 3 mithilfe einer mit dem Ventil 4 einstellbaren Strömung der kontinuierlichen Flüssigkeit verlagert. Vorzugsweise besitzt eine T-Kreuzung zwei Abfuhrkanäle 5, 6, mit verschiedenen hydrodynamischen Widerständen. Vorzugsweise zeichnet sich der Kanal 5 durch einen wesentlich kleineren hydrodynamischen Widerstand als der hydrodynamische Widerstand der Leitung 6 aus. Durch eine solche Widerstandsverteilung fliesst das die Kreuzung 3 eintretende Fluid in die Kanäle 5 und 6 mit verschiedenen volumetrischen Flussraten ein. Insbesondere ist das Verhältnis des volumetrischen Flusses im Kanal 5 zu dem volumetrischen Fluss im Kanal 6 umgekehrt proportional zu dem Verhältnis der hydrodynamischen Widerstände der Kanäle 5 und 6. Ein die Kreuzung 3 eintretender Tropfen wird in zwei Tropfen zerreisst, wobei das Verhältnis des Volumens des Tropfen, der in den Kanal 5 einfloss zu dem Volumen des gebildeten Tropfens, der in den Kanal 6 einfloss in einer sehr guten Annäherung dem Verhältnis der volumetrischen Flüsse durch die Kanäle gleich ist. Um das Verhältnis der zu entstehenden Tropfen einstellen zu können, ist der Kanal 5 mit einem zusätzlichen Einlauf 9 mit dem durch das Ventil 8 einstellbaren Fluss ausgerüstet. Der Kanal 5 teilt sich in zwei Segmenten: der Segment 10 - von der Kreuzung 3 bis zur Kreuzung mit dem Kanal 9, sowie der Segment 11 - hinter der Kreuzung mit dem Kanal 9. Wenn das Ventil 8 geöffnet ist, ändert das aus dem Kanal 9 in den Kanal 5 ausfliesende Fluid das volumetrische Verhältnis der Flussraten in den Kanälen 11 und 6. Dadurch wird der Tropfen in einem von der Tropfenposition zum Zeitpunkt, in dem das Ventil 8 im zusätzlichen Kanal 9 geöffnet wird, und von der Öffnungszeit dieses Ventils abhängigen Verhältnis geteilt. Anschliessend wird das Ventil 8 gesperrt, und die neugebildeten Tropfen mit den festgelegten Volumina 12, 13 werden in einen weiteren Teil des Systems verlagert. In einem bevorzugten Beispiel, ist über/unter der Kreuzung 3 ein Sensor 14 angebracht, der die elektronische Vorrichtung (nicht gezeigt in der Abbildung) über den Fluss der Tropfen informiert. In einer bevorzugten Ausführung, aber nicht einschränkend, ist es ein optischer oder ein elektrischer Sensor. In dem Beispiel schaltet die elektronische Vorrichtung die Ventile 4, 8 so um, dass es möglich ist, verschiedene Teilungsverhältnisse der Tropfen zu erzielen. Vorzugsweise ist die Länge des zu teilenden Tropfens gleich einigen Kanalbreiten - dies kann durch die Verengung des Kanals vor der T-Kreuzung erzielt werden. In a preferred embodiment, the drop located in the microchannel is divided into two drops with an adjustable volume ratio at a T-junction. In the example shown schematically in FIG. 1 a, the drop 1 located in the channel 2 is displaced to the T-junction 3 with the aid of a flow of the continuous liquid that can be adjusted with the valve 4. A T-junction preferably has two discharge channels 5, 6 with different hydrodynamic resistances. The channel 5 is preferably distinguished by a significantly smaller hydrodynamic resistance than the hydrodynamic resistance of the line 6. Through such a resistance distribution, the fluid entering the junction 3 flows into the channels 5 and 6 at different volumetric flow rates. In particular, the ratio of the volumetric flow in channel 5 to the volumetric flow in channel 6 is inversely proportional to the ratio of the hydrodynamic resistances of channels 5 and 6. A drop entering junction 3 is torn into two drops, the ratio of the volume of the drop that flowed into the channel 5 to the volume of the formed drop that flowed into the channel 6 is equal to a very good approximation to the ratio of the volumetric flows through the channels. In order to be able to adjust the ratio of the drops to be produced, the channel 5 is equipped with an additional inlet 9 with the flow that can be adjusted by the valve 8. Channel 5 is divided into two segments: segment 10 - from intersection 3 to the intersection with channel 9, and segment 11 - behind the intersection with channel 9. When valve 8 is open, this changes from the channel 9 fluid flowing out into channel 5 shows the volumetric ratio of the flow rates in channels 11 and 6. As a result, the drop is dependent on the drop position at the time when valve 8 in additional channel 9 is opened and on the opening time of this valve Ratio shared. The valve 8 is then closed and the newly formed droplets with the specified volumes 12, 13 are shifted to a further part of the system. In a preferred example, a sensor 14 is attached above / below the intersection 3 which informs the electronic device (not shown in the figure) about the flow of the drops. In a preferred embodiment, but not by way of limitation, it is an optical or an electrical sensor. In the example, the electronic device switches the valves 4, 8 so that it is possible to achieve different division ratios of the drops. The length of the drop to be divided is preferably equal to a few channel widths - this can be achieved by narrowing the channel in front of the T-junction.

Beispiel 2Example 2

[0021] In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel eines vervielfachten Chemostats innerhalb der Tropfen in einem Mikrofluidiksystem wird eine Bakterienkulturen enthaltende Tropfensequenz 15 in das System eingeführt und zwecks Inkubation und Beobachtung des Wachstums der Mikroorganismen 16 hin und zurück rezirkuliert (Fig. 2a). Nach einer vorgegebenen Zeit T werden die Tropfen bedarfsgemäss 17 geteilt und ein Teil der Kultur 18 (Fig. 2b) beseitigt. Diese Teilung kann in verschiedenen, im Voraus vorgegebenen oder von den Messergebnissen der Konzentration der Mikroorganismen (gemessen an optischer Dichte, Turbidität, Lumineszenz oder an einem anderen Marker des Wachstums und der Lebendigkeit der Mikroorganismen) abhängigen Verhältnissen durchgeführt werden. Die Häufigkeit der Teilungen und das Volumen der zu beseitigenden Fraktion entscheiden über die Verdünnungsrate D: In a preferred embodiment of a multiplied chemostat within the drops in a microfluidic system, a sequence of drops 15 containing bacterial cultures is introduced into the system and recirculated back and forth for the purpose of incubation and observation of the growth of the microorganisms 16 (FIG. 2a). After a predetermined time T, the drops are divided as required 17 and part of the culture 18 (FIG. 2b) is eliminated. This division can be carried out in different proportions, predetermined in advance or depending on the measurement results of the concentration of the microorganisms (measured by optical density, turbidity, luminescence or another marker of the growth and vitality of the microorganisms). The frequency of the divisions and the volume of the fraction to be removed determine the dilution rate D:

wo D die Verdünnungsrate und F die in aufeinanderfolgenden Verdünnungen zu ersetzende Fraktion bedeuten, und T der Zeitraum zwischen den aufeinanderfolgenden Verdünnungen ist. Die nächste Stufe ist die Ergänzung der Tropfen 19 mit einer Portion frischen Nährbodens 20, dessen Volumen dem der beseitigten Zuchtkultur 18 gleich ist (Fig. 2c). Dieser Zyklus kann theoretisch beliebig viele male wiederholt werden. where D is the dilution rate and F is the fraction to be replaced in successive dilutions, and T is the time between successive dilutions. The next stage is to supplement the drops 19 with a portion of fresh nutrient medium 20, the volume of which is the same as that of the cultivated culture 18 that has been removed (FIG. 2c). In theory, this cycle can be repeated any number of times.

Beispiel 3Example 3

[0022] In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Teilung der Tropfen ist eine hochgenaue Tropfenteilung möglich, worin der Fehler 1% nicht überschreitet und für grosse Tropfen kleiner ist. Ein beispielhaftes Diagramm stellt das Volumen eines 2-µl-Tropfens nach der Teilung vor. Es ist charakteristisch, dass die Teilung des Tropfens von der vom Operator vorgegebenen Teilung nicht abweicht, und, wie schon erwähnt, dass der relative Fehler zwischen dem gewünschten und dem erzielten Volumen nicht grösser als 1% ist. In a preferred exemplary embodiment of the division of the drops, a highly precise drop division is possible, in which the error does not exceed 1% and is smaller for large drops. An exemplary diagram shows the volume of a 2 µl drop after division. It is characteristic that the division of the drop does not deviate from the division specified by the operator, and, as already mentioned, that the relative error between the desired and the volume achieved is not greater than 1%.

Beispiel 4Example 4

[0023] In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Teilung der Tropfen (Fig. 4) ist es möglich, einen Farbstoff enthaltenden Tropfen zu teilen, und anschliessend einen der neu entstandenen Tropfen mit einem Farbstoff nicht enthaltenden Tropfen oder einem Farbstoff enthaltenden Tropfen so zu vereinigen, das die Farbstoffkonzentration in demselben Tropfen durch sehr viele Teilungen erhöht oder reduziert werden kann. Ein beispielhaftes Diagramm stellt die Änderung der Farbstoffkonzentration im gegebenen Tropfen (in diesem Fall 1 µm) infolge deren Teilung und Ergänzung des Tropfenanfangsvolumens mit dem vorgegebenen Fluid vor. Sowohl die bevorzugte Auswirkung der Teilung des Tropfens wie auch das Verfahren zur Tropfenvereinigung haben zur Folge, dass sich die Konzentration innerhalb des Tropfens wesentlich ändert, und zwar nach einem vorher festgelegten, mit der vorgegebenen Tropfenteilung völlig gebundenen Schema. Die bevorzugte Wiederholbarkeit dieses Phänomens, dessen relative Abweichung (zwischen der vom Operator des Mikrofluidiksystems vorgegebenen und der tatsächlich erzielten Konzentration) in der zu beschreibenden Erfindung unter 1% liegt, erweist sich als entscheidend, insbesondere bei präziser Kontrolle der Tropfenzusammensetzung. In a preferred embodiment of the division of the drops (Fig. 4), it is possible to divide a drop containing dye, and then to combine one of the newly formed drops with a drop not containing dye or a drop containing dye so that the dye concentration in the same drop can be increased or reduced by very many divisions. An exemplary diagram shows the change in the dye concentration in the given drop (in this case 1 µm) as a result of its division and supplementation of the initial volume of the drop with the specified fluid. Both the preferred effect of the division of the droplet and the method for combining the droplets have the consequence that the concentration within the droplet changes significantly, namely according to a previously established scheme which is completely bound to the predetermined droplet spacing. The preferred repeatability of this phenomenon, the relative deviation of which (between the concentration specified by the operator of the microfluidic system and the concentration actually achieved) in the invention to be described is less than 1%, proves to be decisive, especially with precise control of the droplet composition.

Beispiel 5Example 5

[0024] In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel kann ein System gemäss der Erfindung bei einer langfristigen Züchtung von Mikroorganismen zum Einsatz kommen (Fig. 5), darunter bei der Kultivierung von Bakterien E.coll in Gegenwart von Antibiotika oder anderen, das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussenden Substanzen. In dem Beispiel, in einer zum System (Fig. 2) analogischen Anordnung, wurden langfristig Mikroorganismen bei 6 verschiedenen Konzentrationen von Antibiotikum Tetracyclin kultiviert, wobei jede Konzentration in mindestens drei Tropfen, jeder von denen ein Mikrochemostat war (Fig. 6), geprüft wurde. In gleichen Zeitabständen war das Wachstum von Bakterien in einer spektrophotometrischen Messung mit einem mit dem System integrierten Lichtleiter verfolgt. Unerwartet haben die Erfinder bemerkt, dass es möglich ist, Bakterienwachstumskurven für verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums zu bestimmen. Ähnlich unerwartet stellte es sich heraus, dass sich die Kurven durch eine hohe Reproduzierbarkeit auszeichnen. In another preferred embodiment, a system according to the invention can be used in a long-term cultivation of microorganisms (FIG. 5), including in the cultivation of bacteria E.coll in the presence of antibiotics or others that influence the growth of microorganisms Substances. In the example, in an arrangement analogous to the system (FIG. 2), microorganisms were cultivated for a long time at 6 different concentrations of the antibiotic tetracycline, each concentration being tested in at least three drops, each of which was a microchemostat (FIG. 6) . The growth of bacteria was followed at equal time intervals in a spectrophotometric measurement with a light guide integrated with the system. Unexpectedly, the inventors found that it is possible to determine bacterial growth curves for different concentrations of the antibiotic. Similarly, unexpectedly, it turned out that the curves are characterized by a high level of reproducibility.

Beispiel 6Example 6

[0025] Ähnlich ist es möglich, dasselbe System zur Kultivierung einschliesslich der Kulturverdünnung (Fig. 7) einzusetzen. In dem dargestellten Beispiel wurde der Tropfen nach einem gewissen Zeitraum des kontinuierlichen Wachstums mit der in dem vorliegenden Antrag beschriebenen Erfindung asymmetrisch geteilt, wodurch 70% des Tropfenvolumens beseitigt und die übriggebliebenen 30% des Anfangstropfen mit einem Tropfen des frischen Nährmediums, mit einem Volumen gleich der beseitigten Portion der Zuchtkultur, vereinigt wurden. Dadurch bekamen die Bakterien neue Quellen von Nährsubstanzen und konnten ihr Wachstum fortsetzen. Unerwartet haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bemerkt, es kommt zu keiner unvorteilhaften Kreuzkontamination zwischen den Bakterien enthaltenden Tropfen und den allein das Nährmedium enthaltenden Kontrolltropfen, die keinen nachweisbaren Wachstum von Mikroorganismen zeigten (Fig. 8). It is similarly possible to use the same system for cultivation including the culture dilution (FIG. 7). In the example shown, after a certain period of continuous growth with the invention described in the present application, the drop was divided asymmetrically, eliminating 70% of the drop volume and the remaining 30% of the initial drop with a drop of fresh nutrient medium, with a volume equal to eliminated portion of the cultivated culture. This gave the bacteria new sources of nutrients and allowed them to continue growing. Unexpectedly, the inventors of the present invention have noticed that there is no disadvantageous cross-contamination between the drops containing bacteria and the control drops containing only the nutrient medium, which showed no detectable growth of microorganisms (FIG. 8).

Claims

1. A method for dividing droplets at a microfluidic junction, comprising a supply channel, a first discharge channel with an additional channel and a second discharge channel, characterized in that it comprises the following stages: a. <sep> supply of the drop (1) to the microfluidic junction (3) through the supply channel (2) with the help of a flow of the continuous liquid through the channel (2) and the first discharge channel (5) and the second discharge channel (6), b. <sep> control with the ratio of the flow rates in the discharge channels (5) and (6) by conveying or sucking off the continuous liquid through the additional channel (9), at least until the point in time when the part of the drop (1) located in the first discharge channel (5) of the one in the second discharge channel (6) located part of the drop tears off.

2. The method according to claim 1, characterized in that the flows are automatically controlled with a sensor (14), preferably with a camera, the sensor being attached in the vicinity of the microfluidic intersection (3) and directly or indirectly with a valve ( 8) via which the flow in the additional channel (9) is controlled.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the microfluidic intersection is a T-intersection, i. E. the intersection (3), in which the supply channel (2), the first discharge channel (5) and the second discharge channel (6) form the angles of 180 °, 90 ° and 90 ° with each other.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the microfluidic intersection is a Y-intersection, i.e. the intersection in which the supply channel (2), the first discharge channel (5) and the second discharge channel (6) form the angles of 150 °, 60 ° and 150 ° with each other.

5. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the microfluidic intersection is an intersection in which the supply channel (2), the first discharge channel (5) and the second discharge channel (6) with each other the angles of 120 °, 120 Form ° and 120 °.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the drop (1) in a volume ratio of 1: 9 to 9: 1, preferably 1:99 to 99: 1, and most preferably 1: 999 to 999 : 1, is shared.