CH679399A5

CH679399A5 -

Info

Publication number: CH679399A5
Application number: CH4035/89A
Authority: CH
Inventors: Eran Dr Hadas; Rela Dr Koppel; Gideon Dr Fleminger
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1992-02-14
Also published as: FR2639357A1; FR2639357B1; IT8967810A0; GB2225017B; IT1233901B; SE8903726L; GB8925240D0; GB2225017A; SE8903726D0; DE3839020A1

Description

5 5

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20 20th

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30 30th

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CH 679 399 A5 CH 679 399 A5

Beschreibung description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Fixierung von Proteinen an festen Trägern unter weitgehender Erhaltung von deren biologischer Aktivität. The invention relates to an improved method for fixing proteins to solid carriers while largely maintaining their biological activity.

Für die Fixierung biologischer signifikanter Materie an festen Trägern sind vielerlei Methoden vorgeschlagen worden (vgl. z.B. K. Buchholz, «Characterization of Immobilized Biocatalysts in Dechema-Mo-nographie» Bd. 84, Nr. 1724-1731, Verlag Chemie 1979). Various methods have been proposed for the fixation of biologically significant matter on solid supports (see e.g. K. Buchholz, "Characterization of Immobilized Biocatalysts in Dechema-Monography", vol. 84, no. 1724-1731, Verlag Chemie 1979).

Als feste Träger eignen sich sowohl anorganische als organische Materialien. Teils wird von in der Natur vorkommenden Materialien ausgegangen teils von synthetisch erzeugten. Both inorganic and organic materials are suitable as solid supports. Some are based on materials found in nature, some are synthetically produced.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt das Interesse den funktionalisierten Trägern, insbesondere solchen mit reaktiven Gruppen, die mit den nucleophilen Gruppen von biologisch signifikanter Materie wie Enzymen, Zellen u.a. reagieren und somit eine kovalente Bindung eingehen. Viele aus der präparativen organischen Chemie bekannte reaktive funktionelle (elektrophile) Gruppen, die mit den (nucleophilen) Amino-, Thio- oder Hydroxyfunktionen der biologisch signifikanten Materie unter biologisch akzeptablen Bedingungen reagieren, sind mit mehr oder weniger gutem Erfolg zur kovalenten Fixierung angewendet worden (wobei die zu deren Anbindung am Träger zur Verfügung stehenden Gruppen limitierend wirken können. Detaillierte Angaben finden sich bei K. Buchholz loc.cit; vgl. ferner Ullmann's Encyclopédie der techn. Chemie, 4. Auflage Bd. 10, S. 539-545, Verlag Chemie 1975; Ulimann's Encyclopedia of Industriai Chemistry, fifth Ed. Vol. A9, pg. 382-383, Verlag Chemie 1988). Oft angewendete Aktivierungsmethoden sind beispielsweise bei Trägern mit -OH-Gruppen die Reaktion mit Bromcyan zu den Imiden oder die Umsetzung mit halogenierten s-Triazinen, bei Trägern mit -NH2-Gruppen die Diazotierung oder die Reaktion mit Glutardialdehyd, bei Trägern mit -COOH-Gruppen die Umsetzung zu Säureazidgruppen oder die aus der Peptidsynthese bekannten Aktivierungen mit z.B. Carbodiimid. Within the scope of the present invention, the interest is focused on the functionalized carriers, in particular those with reactive groups, which interact with the nucleophilic groups of biologically significant matter such as enzymes, cells and the like. react and thus form a covalent bond. Many reactive functional (electrophilic) groups known from preparative organic chemistry, which react with the (nucleophilic) amino, thio or hydroxy functions of the biologically significant matter under biologically acceptable conditions, have been used with more or less good success for covalent fixation ( The groups available for their connection to the carrier can have a limiting effect. Detailed information can be found at K. Buchholz loc.cit; see also Ullmann's Encyclopédie der techn. Chemie, 4th edition, vol. 10, pp. 539-545, Verlag Chemie 1975; Ulimann's Encyclopedia of Industriai Chemistry, fifth Ed.Vol.A9, pg. 382-383, Verlag Chemie 1988). Activation methods that are often used are, for example, the reaction with cyanide groups to react with cyanogen bromide to give the imides or the reaction with halogenated s-triazines, with supports with -NH2 groups diazotization or the reaction with glutardialdehyde, with supports with -COOH groups the conversion to acid azide groups or the activations known from peptide synthesis with, for example Carbodiimide.

Träger mit z.B. Anhydrid- oder Epoxyfunktionen sind zur unmittelbaren Reaktion mit den vorkommenden Nucleophilen, insbesondere den Aminofunktionen von Proteinen geeignet. Carrier with e.g. Anhydride or epoxy functions are suitable for direct reaction with the nucleophiles that occur, in particular the amino functions of proteins.

Die kovalente Fixierung von biologisch signifikantem Material hat eine Reihe von Vorzügen gegenüber anderen Bindungsmethoden. Zu nennen wäre u.a. das Nicht-Ausbiuten des Materials, die leichte Zugänglichkeit der allgemein an der Trägeroberfläche fixierten aktiven Strukturen und nicht selten eine erhöhte thermische Stabilität. Andererseits hat man aber auch gelegentlich gewisse Nachteile in Kauf zu nehmen z.B.: The covalent fixation of biologically significant material has a number of advantages over other binding methods. To name a few the non-development of the material, the easy accessibility of the active structures generally fixed to the support surface and not infrequently increased thermal stability. On the other hand, you also have to accept certain disadvantages from time to time, for example:

a) Beeinträchtigung der biologischen Aktivität durch partielle Modifikation der aktiven Zentren b) zu starke Interaktion zwischen Träger und fixiertem Material, die dessen Beweglichkeit und Zugänglichkeit einschränkt c) diffizile Suche nach den optimalen Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit von der Natur des biologischen Materials. (Vgl. Ullmanns Encyclopedia of Industriai Chemistry 5th Ed. Vol., A.9. loc.cit, pg. 384). a) Impairment of biological activity by partial modification of the active centers b) Too strong interaction between carrier and fixed material, which limits its mobility and accessibility c) Difficult search for the optimal reaction conditions depending on the nature of the biological material. (See Ullmanns Encyclopedia of Industriai Chemistry 5th Ed. Vol., A.9. Loc.cit, pg. 384).

Ulimann führt als weiteren Nachteil der kovalenten Fixierung neben der Nicht-Regenerierbarkeit der Träger die Nicht-Anwendbarkeit der Methode auf ganze Zellen an. In der Tat können in bestimmten Fällen insbesondere die unter a) und b) aufgeführten Folgen der kovalenten Immobilisierung ein ernstzunehmendes Handicap für diese Methode bedeuten. As a further disadvantage of covalent fixation, Ulimann cites the non-regenerability of the carrier and the non-applicability of the method to whole cells. In fact, in certain cases, the consequences of covalent immobilization listed under a) and b) can mean a serious handicap for this method.

Dies sei am konkreten Beispiel erläutert: This is explained using the concrete example:

Bei der Immobilisierung der verschiedensten Proteinarten hat sich ein Trägersystem bestehend aus einem vernetzten Copolymeren des (Meth)acrylamids mit Glycidyl(meth)acrylat, vorzugsweise in Perlform hervorragend bewährt. (Handelsprodukt ®EUPERGIT C, vgl. DE-C 2 722 751, US-A 4 190 713, US-A4 511 694). A carrier system consisting of a crosslinked copolymer of (meth) acrylamide with glycidyl (meth) acrylate, preferably in the form of pearls, has proven itself extremely well in the immobilization of a wide variety of protein types. (Commercial product ®EUPERGIT C, cf. DE-C 2 722 751, US-A 4 190 713, US-A4 511 694).

Die hauptsächliche Interaktion zwischen diesem Trägersystem und Proteinen findet zwischen den Epoxid-Gruppen und den freien Aminogruppen der Proteine statt. Diese Interaktion braucht sich jedoch nicht auf eine oder einige wenige Anbindungsstellen zu beschränken, sondern sie kann an zahlreichen weiteren Stellen stattfinden. Im Endeffekt läuft dann die kovalente Fixierung auf eine Inaktivierung des gebundenen Proteins hinaus. Auch die Blockierung der für die Wirkung essentiellen Aminogruppen kann bei Reaktionen mit dem Träger zur Inaktivierung des gebundenen Proteins führen. The main interaction between this carrier system and proteins takes place between the epoxy groups and the free amino groups of the proteins. However, this interaction need not be limited to one or a few connection points, but can take place at numerous other points. In the end, the covalent fixation amounts to inactivation of the bound protein. Blocking the amino groups essential for the effect can also lead to inactivation of the bound protein in reactions with the carrier.

Es bestand daher die Aufgabe, Wege zu finden, die eine kovalente Fixierung biologisch signifikanter Materie möglichst mit Hilfe bewährter Trägersysteme gestatten, ohne die geschilderten Nachteile, insbesondere die völlige oder partielle biologische Inaktivierung. It was therefore the task of finding ways that covalently fix biologically significant matter, if possible with the aid of proven carrier systems, without the disadvantages described, in particular the complete or partial biological inactivation.

Die vorliegende Erfindung betrifft das im Anspruchsteil definierte Verfahren. Es umfasst die Verfahren zur kovalenten Fixierung von biologisch signifikanten Materialien mit Proteinstruktur des Standes der Technik, wobei aber deren biologische Aktivität erhalten bleibt. The present invention relates to the method defined in the claims. It encompasses the methods for the covalent fixation of biologically significant materials with a protein structure of the prior art, while maintaining their biological activity.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur kovalenten Fixierung von biologisch aktiven Proteinen P an festen funktionellen Gruppen FG aufweisenden Trägern T besteht darin, dass in einem ersten Reaktionsschritt die aktivsten Aminogruppen des Proteins P mit einem Reagenz R modifiziert werden, das sich unter kontrollierten Bedingungen reversibel entfernen lässt, in einem zweiten Reaktionsschritt die The method according to the invention for the covalent fixation of biologically active proteins P on carriers TG having solid functional groups FG consists in that in a first reaction step the most active amino groups of the protein P are modified with a reagent R which can be reversibly removed under controlled conditions, in a second reaction step

2 2nd

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10 10th

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Reaktion mit den funktionellen Gruppen FG des Trägers T durchgeführt wird, in einem weiteren Reaktionsschritt die verbliebenen funktionellen Gruppen FG des Trägers T chemisch blockiert werden und schliesslich der die Aminogruppen des Proteins P modifizierende Rest R' des Reagenzes R in kontrollierter Weise entfernt wird. Reaction with the functional groups FG of the carrier T is carried out, in a further reaction step the remaining functional groups FG of the carrier T are chemically blocked and finally the residue R 'of the reagent R modifying the amino groups of the protein P is removed in a controlled manner.

Als modifizierendes Reagenz R, das sich unter kontrollierten Bedingungen reversibel entfernen lässt, eignet sich speziell Dimethylmaleinsäureanhydrid. Dimethyl maleic anhydride is particularly suitable as a modifying reagent R, which can be reversibly removed under controlled conditions.

Die Trägermaterialien The carrier materials

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Prinzip bei alien Trägermaterialien T anwendbar, bei denen die geschilderte Aufgabe manifest werden kann, d.h. wenn eine zu starke Interaktion zwischen Träger und zu fixierendem Objekt eintritt bzw. wenn die Fixierung an Stellen der biologisch signifikanten Materie erfolgt, die für eben diese biologische Wirkung bedeutsam sind und deren Blockierung eine Minderung oder Aufhebung der biologischen Wirkung bedeutet. Diese Gefahr mag für einzelne eine kovalente Haftung bewirkende reaktive Gruppe und für verschiedenartige Träger unterschiedlich gross sein, aber sie besteht im Prinzip immer, insbesondere bei genügend hoher Dichte und bei - an sich nicht unerwünschter - Reaktionsfreudigkeit der elektrophilen funktionellen Gruppen unter biologisch akzeptablen Bedingungen (vgl. K. Buchholz loc.cit. pg. 49-63; Ulimann, 4. Auflage Bd. 10, loc.cit, S. 540). Als solche Gruppen können z.B. Säurederivate wie z.B. Säurehalogenide, Azide, aktivierte Ester, Imidoester, Säureanhydride, im weiteren Sinne auch Imidocarbonate, Isothiocyanate, ferner halogenierte Triazine, sowie Aziridin- und insbesondere Epoxid-(Oxiran)-Funktionen erwähnt werden. In principle, the method according to the invention can be used with all carrier materials T in which the described task can be manifested, i.e. if there is too much interaction between the wearer and the object to be fixed or if the fixation takes place at places of biologically significant matter that are important for this biological effect and whose blocking means a reduction or abolition of the biological effect. This risk may be different for individual reactive groups causing covalent adhesion and for different types of carriers, but in principle it always exists, in particular if the density is sufficiently high and if the electrophilic functional groups are not, in themselves, undesirable, under biologically acceptable conditions (cf. K. Buchholz loc.cit.pg. 49-63; Ulimann, 4th edition vol. 10, loc.cit, p. 540). As such groups e.g. Acid derivatives such as Acid halides, azides, activated esters, imido esters, acid anhydrides, in the broader sense also imidocarbonates, isothiocyanates, furthermore halogenated triazines, as well as aziridine and in particular epoxy (oxirane) functions.

Als Beispiel sei wiederum das im übrigen hervorragend geeignete Trägersystem aus einem vernetzten Copolymeren des Methacrylamids mit Glycidylmethacrylat (siehe vorstehend ®EUPERGIT C) aufgeführt. Untersuchungen über Struktur und Aktivität dieses Trägersystems führen zu der Annahme einer Epoxy-Gruppen-Dichte an der Oberfläche, die durch einen 5 Ä-Abstand charakterisiert wird bei gleichzeitig hoher Permeabilität der Systeme. Es leuchtet unmittelbar ein, dass unter solchen Bedingungen mit bestimmten zu fixierenden Materialien, was im Regelfall bedeutet: mit gewissen Proteinen P ein «Multi Point Attachment» eintritt, das die geschilderten, negativen Effekte im Gefolge hat. As an example, the carrier system consisting of a crosslinked copolymer of methacrylamide with glycidyl methacrylate (see above ®EUPERGIT C) is also outstandingly suitable. Studies on the structure and activity of this carrier system lead to the assumption of an epoxy group density on the surface, which is characterized by a 5 Å distance with a high permeability of the systems. It is immediately obvious that under such conditions with certain materials to be fixed, which usually means: with certain proteins P, a “multi point attachment” occurs which has the negative effects described.

Es sei indessen nochmals betont, dass auch bei anderen Trägersystemen, sofern eine genügend hohe Dichte der funktionellen Gruppen FG und hinreichende Strukturverhältnisse, d.h. auch ausreichende Zugänglichkeit vorliegen, der Effekt des «Multi Point Attachments» eintritt, der negative Folgen haben kann. Unter diesem Gesichtspunkt können weder anorganische Träger, wie z.B. oberflächenmodifiziertes, insbesondere silanisiertes Glas, Silicagel, Tone wie Bentonit und Hydroxyapatit, Metalle bzw. Metallverbindungen wie Nickel, Nickeloxid, Titandioxid, Zirkondioxid u.ä., (vgl. E. Katchalski-Katzir, L. Goldstein Ed. Applied Biochemistry and Bioengineering Vol. 1, pg. 23 ff; H.H. Weetall Ed. Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides, Marcel Dekker, New York 1975, pg 1 ff) noch (modifizierte) natürlich vorkommende oder synthetisch erzeugte organische Polymere ausgenommen werden. It should be emphasized again, however, that also with other carrier systems, provided that there is a sufficiently high density of the functional groups FG and sufficient structural relationships, i.e. there is also sufficient accessibility, the effect of the multi-point attachment occurs, which can have negative consequences. From this point of view, neither inorganic carriers such as e.g. Surface-modified, in particular silanized glass, silica gel, clays such as bentonite and hydroxyapatite, metals or metal compounds such as nickel, nickel oxide, titanium dioxide, zirconium dioxide and the like, (see E. Katchalski-Katzir, L. Goldstein Ed. Applied Biochemistry and Bioengineering Vol . 1, pg. 23 ff; HH Weetall Ed. Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides, Marcel Dekker, New York 1975, pg 1 ff) or (modified) naturally occurring or synthetically produced organic polymers.

Als Beispiele für die ersteren seien insbesondere Polysaccharide genannt, die durch Umsetzung mit Bromcyan zum cyclischen Imid, mit Chloressigsäure zum Carboxylmethylderivat bzw. zum Azid, durch Einführung einer diazotierbaren Aminogruppe, oder durch Einführung einer Glycidyi(ether)gruppe funk-tionisiert werden können. (Vgl. K. Buchholz, Characterization of Immobilized Biocatalysts, loc. cit. pg. 52-54). Examples of the former include, in particular, polysaccharides which can be functionalized by reaction with cyanogen bromide to form the cyclic imide, with chloroacetic acid to give the carboxylmethyl derivative or azide, by introducing a diazotizable amino group, or by introducing a glycidyl (ether) group. (See K. Buchholz, Characterization of Immobilized Biocatalysts, loc. Cit. Pg. 52-54).

Wie leicht einzusehen, besteht die grösste Variabilität bei Trägern auf Basis synthetischer organischer Polymeren. Einerseits werden Polymere angewendet, in die nachträgliche durch polymeranaloge Reaktionen reaktive Gruppen eingeführt werden, andererseits lassen sich auch polymere Träger durch Copolymerisation reaktive Einheiten enthaltende Monomeren herstellen. Ausser der Anwesenheit funktioneller Gruppen FG wird von dem Trägermaterial T ausreichende mechanische Belastbarkeit, physikalische, chemische und biologische Stabilität und toxikologische Unbedenklichkeit erwartet. As is easy to see, there is the greatest variability in supports based on synthetic organic polymers. On the one hand, polymers are used, into which groups reactive through polymer-analogous reactions are subsequently introduced; on the other hand, polymeric supports can also be prepared by monomers containing reactive units by copolymerization. In addition to the presence of functional groups FG, the carrier material T is expected to have sufficient mechanical strength, physical, chemical and biological stability and toxicological harmlessness.

Die Aktualität der vorliegenden Erfindung sei am Beispiel eines epoxigruppenhaltigen Trägers T erläutert: The actuality of the present invention is explained using the example of a carrier T containing epoxy groups:

Als Prototyp kann dabei das bereits erwähnte vernetzte Copolymerisat aus Acrylamid bzw. Meth-acrylamid und Glycidylacrylat bzw. -methacrylat gelten, das vorzugsweise aus periförmigen Partikeln besteht. Derartige Trägerpolymerisate werden in der DE-C 2 722 751 bzw. US-A 4 190 713 sowie der US-A 4 511 694 beschrieben. Die Perlen besitzen in der Regel einen Durchmesser von 5-1000 um, insbesondere 30-1000 um und weisen einen inneren Hohlraum (Hohlperlen) auf. Als Anhalt für den Gehalt an Giy-cidylgruppen im Trägerpolymerisat T, die zur Reaktion gebracht werden können, sei ein Wert von 0,8-2,5 |j.Mol pro mg trockenes Trägermaterial genannt. Weitere Kenndaten für ein handelsübliches Matrixpolymerisat (EUPERGIT C der Röhm GmbH) das für Trägerpolymerisate T des angegebenen Typs repräsentativ ist, lassen sich der folgenden Tabelle entnehmen. The crosslinked copolymer of acrylamide or methacrylamide and glycidyl acrylate or methacrylate mentioned above, which preferably consists of pearl-shaped particles, can be considered as a prototype. Such carrier polymers are described in DE-C 2 722 751 or US-A 4 190 713 and US-A 4 511 694. The beads generally have a diameter of 5-1000 μm, in particular 30-1000 μm, and have an internal cavity (hollow beads). As a guide to the content of glycidyl groups in the carrier polymer T that can be reacted, a value of 0.8-2.5 | mol per mg of dry carrier material should be mentioned. Further characteristics for a commercially available matrix polymer (EUPERGIT C from Röhm GmbH), which is representative of carrier polymers T of the specified type, can be found in the following table.

3 3rd

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 679 399 A5 CH 679 399 A5

Kenndaten Characteristics

Dimension dimension

Ausschlussgrenze = Mum: Bindungsaktive Oberfläche: Epoxidgehalt: Wasseraufnahme: Limit of exclusion = Mum: binding surface: epoxy content: water absorption:

Dichte = d420: Schüttdichte: Density = d420: bulk density:

Mittiere Komgrösse: Porendurchmesser: Middle grain size: pore diameter:

140-180 um 40 nm 140-180 around 40 nm

2,105Daitons 180 m2/g (trocken) 800-1000 mmol/g (trocken) 2,3 mi/g (trocken) Daitons 180 m2 / g (dry) 800-1000 mmol / g (dry) 2.3 mi / g (dry)

1,20 1.20

0,34 g/ml 0.34 g / ml

Bindungskapazität: (bei üblichen Bedingungen) Binding capacity: (under normal conditions)

Humanaibumin: Humanaibumin:

Human IgG: Human IgG:

Queliverhaiten gegenüber Wasser. Queliverhaiten against water.

48 mg/g (feucht) 48 mg / g (moist)

34 mg/g (feucht) 34 mg / g (moist)

1:1,4 1: 1.4

1 ml (trocken) ergibt 1,4 ml (feucht) 1 ml (dry) gives 1.4 ml (moist)

Löslichkeit (in Wasser, Puffern und organischen Solubility (in water, buffers and organic

Lösungsmitteln: Solvents:

Druckstabilität: Pressure stability:

300 bar unlöslich 300 bar insoluble

Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man die makroporöse Struktur der Perlen mit Kanälen und Hohlräumen, die einen Durchmesser von 0,1-2,5 um (1000-25 000 Â) besitzen, so dass Enzym- bzw. Substratmoleküle mit einer Grösse von 10-100 Â das gesamte Innere der makroporösen Matrix erreichen können. The macroporous structure of the beads with channels and cavities, which have a diameter of 0.1-2.5 µm (1000-25 000 Â), can be seen under the electron microscope, so that enzyme or substrate molecules with a size of 10-100 Â can reach the entire interior of the macroporous matrix.

Die biologisch signifikanten Materialien The biologically significant materials

Die biologisch signifikanten Materialien, auf deren möglichst optimale Fixierung an Trägern T die vorliegende Erfindung gerichtet ist, sind bereits vorstehend (Stand der Technik) charakterisiert worden. The biologically significant materials, on the best possible fixation on carriers T of which the present invention is directed, have already been characterized above (prior art).

Sie weisen in der Regel nucleophile Gruppen, speziell Aminogruppen auf, die mit den funktionellen Gruppen FG der Träger T unter biologisch akzeptablen Bedingungen reagieren. Insbesondere handelt es sich dabei um Proteine. Genannt seien Biokatalysatoren wie Enzyme, sowie Zellen, Organellen und immunologisch aktive Materialien und Strukturen, insbesondere Antikörper. Die immobilisierten Biokatalysatoren können z.B. zur Produktion bzw. der Umwandlung sehr verschiedenartiger Substrate wie Aminosäuren, Peptide und Enzyme, von Zuckern, organischen Säuren, Antibiotika, Steroiden, Nucleosi-den und Nucleotiden, Lipiden, Terpenoiden und organischen Grundchemikalien dienen (vgl. Ullmann 5. Auflage, Bd. 9A, loc.cit. S. 389-390. They generally have nucleophilic groups, especially amino groups, which react with the functional groups FG of the carrier T under biologically acceptable conditions. In particular, these are proteins. Biocatalysts such as enzymes and cells, organelles and immunologically active materials and structures, in particular antibodies, may be mentioned. The immobilized biocatalysts can e.g. serve for the production or conversion of very different substrates such as amino acids, peptides and enzymes, of sugars, organic acids, antibiotics, steroids, nucleosides and nucleotides, lipids, terpenoids and basic organic chemicals (cf. Ullmann 5th edition, Vol. 9A , loc.cit. pp. 389-390.

Als immunologisch aktive Strukturen seien z.B. Mikroorganismen, wie gram-positive und gram-negative Bakterien, Spirochäten, Mycoplasma, Mycobacterien, Vibrionen, Actinomyceten, Protozoen, wie intestinale Protozoen, Amöben, Flageliaten, Sporozoen, intestinale Nematoden und Gewebenematoden (Würmer), Trematoden (Schistosomen, Egel), Cestoden, Toxoplasma, sowie Pilze, wie Sporotrichum, Cyptocoecus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides, Candida, Viren und Rickettsien, wie Hunde-Hepatitis, Shope-Papillome, Influenza A + B, Hühnerpest, Herpes-Simplex, Adenoviren, Polyane, Rous-Sarkom, Impfpocken, Poliovirus, Masern, Hundestaupe, Leukämie, Mumps, Newcastle-Krankheit, Sen-dai, ECHO, Maul- und Klauenseuche, Psittacosis, Rabies, Extromelia, Baumviren, weiter Gewebe-Anti-gene, Enzyme, wie Pancreas-Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase, Glucose-Oxidase, Lactatdehy-drogenase, Uricase, Aminosäure-Oxidase, Urease, Asparaginase, Proteasen, Blutzellen-Antigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene, wie Blutplättchen, Leucozyten, Plasma-Proteine, Milch-Proteine, Speichel-Proteine, Urin-Proteine, Antikörper, einschliesslich Auto-Antikörper genannt. Erwähnt seien insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen Antigene beispielsweise der folgenden Art gerichtet sind. As immunologically active structures, e.g. Microorganisms, such as gram-positive and gram-negative bacteria, spirochetes, mycoplasma, mycobacteria, vibrions, actinomycetes, protozoa, such as intestinal protozoa, amoebas, flageliates, sporozoa, intestinal nematodes and tissue nematodes (worms), trematodes (schistosomes, leeches), celebrons , Toxoplasma, as well as fungi, such as Sporotrichum, Cyptocoecus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides, Candida, viruses and Rickettsia, such as dog hepatitis, Shope papillomas, influenza A + B, chicken pest, herpes simplex, adenoviruses, polyans, Rous sarcoma , Smallpox, poliovirus, measles, canine distemper, leukemia, mumps, Newcastle disease, Sen-dai, ECHO, foot and mouth disease, psittacosis, rabies, extromelia, tree viruses, further tissue anti-genes, enzymes, such as pancreatic chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, uricase, amino acid oxidase, urease, asparaginase, proteases, blood cell antigens, blood group substances and other isoantigens, such as platelets, leucocytes, pla sma proteins, milk proteins, saliva proteins, urine proteins, antibodies, including auto-antibodies. Monoclonal antibodies which are directed against antigens, for example of the following type, should be mentioned in particular.

4 4th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 679 399 A5 CH 679 399 A5

Antigen-Klasse Antigen class

Antigen antigen

Bakteriell Bacterial

Viral Viral

Autoimmun Autoimmune

Tumor tumor

Gewebe/Blut Tissue / blood

Andere Other

Tetanus-Toxoid Tetanus toxoid

H. influenza Typ b Polysaccharid Diphtherie-Toxin Chlamydia trachomatis M. leprae H. influenza type b polysaccharide diphtheria toxin Chlamydia trachomatis M. leprae

Lipopolysaccharid/Endotoxin Lipopolysaccharide / endotoxin

Pneumokokken Pneumococcal

LPS von P. aeruginosa LPS from P. aeruginosa

Exotoxin von P. aeruginosa P. aeruginosa exotoxin

Streptokokken Gruppe A Kohlehydrat Streptococcal group A carbohydrate

X31 Infiuenza-Virus-Nukleoprotein X31 Infiuenza virus nucleoprotein

Masern-Virus Measles virus

HSV Glykoprotein D HSV glycoprotein D

Masern-Virus, Nukleocapsid Measles virus, nucleocapsid

Zytomegalie-Virus Cytomegaly virus

Influenza A-Viren Influenza A viruses

Röteln-Virus-Antigene Rubella virus antigens

HTLVJ HTLVJ

Varizella-Zoster HBsAg doppelsträngige DNA Varicella zoster HBsAg double-stranded DNA

Inselzellen (Diabetes mellitus) Islet cells (diabetes mellitus)

Myasthenia gravis, Antiidiotypen Myasthenia gravis, anti-idiotypes

Thyreotropin-Rezeptor Thyrotropin receptor

Rheuma-Faktor Rheumatism factor

Acetylcholin-Rezeptor Acetylcholine receptor

Schilddrüse thyroid

Sperma sperm

Mamma-Ca Mom Approx

Prostaia-Ca Prostaia-ca

Lungen-Ca Lung approx

Magen-Ca Gastric approx

Melanom Melanoma

BD2 (humanes Melanom) BD2 (human melanoma)

Gliom Glioma

Rectum-Ca Rectum approx

Leukämie leukemia

Cervix-Ca Cervix-ca

Rhesus D Rhesus D

Blutgnjppenantigen A HLA-A,B,C,DR Intermediäre Filamente Malaria Blood graft antigen A HLA-A, B, C, DR Intermediate filament malaria

Forssman-Antigen Forssman antigen

Schaferythrozyten Sheep erythrocytes

Nitrophenol Nitrophenol

Dinitrophenol Dinitrophenol

Trinitrophenol Trinitrophenol

Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Keyhole limpet hemocyanin (KLH)

Rheumafaktor Rheumatoid factor

Insulin insulin

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 679 399 A5 CH 679 399 A5

Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens Implementation of the method according to the invention

Bei dem Verfahren werden in einem ersten Reaktionsschritt die jeweils aktivsten nukleophilen Gruppen, in der Praxis regelmässig die Aminogruppen des Proteins P mit einem Reagenz R modifiziert, das sich unter kontrollierten Bedingungen, d.h. möglichst ohne negative Konsequenzen für die Aktivität des Proteins reversibel entfernen lässt. Ais Reagentien R kommen vorzugsweise solche der folgenden Struktur worin R für Methyl und In the process, the most active nucleophilic groups, in practice the amino groups of the protein P, are modified in a first reaction step with a reagent R, which reacts under controlled conditions, i.e. can be reversibly removed if possible without negative consequences for the activity of the protein. As reagents R preferably come those of the following structure wherein R is methyl and

R' für Wasserstoff oder Methyl stehen, und worin A und A' entweder für Methylgruppen stehen oder eine Doppelbindung symbolisieren, in Frage. R 'is hydrogen or methyl, and where A and A' are either methyl groups or symbolize a double bond.

Genannt seien insbesondere das Dimethylmaleinsäure-Anhydrid und das Citraconsäureanhydrid. Die Anwendung des Reagenzes 2,3-Dimethylmaleinsäureanhydrid ist zur kovalenten Modifikation von Antikörpern an ihren Aminogruppen bereits beschrieben worden (vgl. N. Endo, N. Umemoto, Y. Kato, Y. Ta-keda, u. T. Hara; J. Immunol. Methods 104 (1-2) 253-258,1987). Es wird dabei so vorgegangen, dass die für das Antigen-Bindungsvermögen verantwortlichen Aminogruppen mit dem Reagenz blockiert werden, danach die verbleibenden Aminogruppen modifiziert werden und schliesslich die Dimethylmaleyl-Schutz-gruppe durch Hydrolyse entfernt wird. Die Methode wurde für die kovalente Konjugation von Methotrexat (MTX) mit zwei monoclonalen Antikörpern mittels des MTX-N-Succinimidylesters angewendet. In ähnlicher Weise wurden monoclonale Anti-Melanoma-Antikörper mit Dimethyl-Maleinsäureanhydrid und anschliessend mit N-Acetylhomocystein-thiolacton zur Einführung von reaktionsfähigen Thiolgrup-pen umgesetzt, die wiederum unter S-S-Verknüpfungen weiterreagieren können (vgl. PCT-Anmeldung WO 87/4171). In dieser Weise wurde eine Reaktion mit Thiopropyl-Sepharose 4B erreicht. Particularly worth mentioning are dimethyl maleic anhydride and citraconic anhydride. The use of the reagent 2,3-dimethyl maleic anhydride for the covalent modification of antibodies on its amino groups has already been described (cf. N. Endo, N. Umemoto, Y. Kato, Y. Ta-keda, and T. Hara; J. Immunol. Methods 104 (1-2) 253-258, 1987). The procedure is such that the amino groups responsible for the antigen binding capacity are blocked with the reagent, then the remaining amino groups are modified and finally the dimethylmaleyl protective group is removed by hydrolysis. The method was used for the covalent conjugation of methotrexate (MTX) with two monoclonal antibodies using the MTX-N-succinimidyl ester. In a similar manner, monoclonal anti-melanoma antibodies were reacted with dimethyl-maleic anhydride and then with N-acetylhomocysteine thiolactone to introduce reactive thiol groups, which in turn can react further under SS linkages (cf. PCT application WO 87/4171) . In this way a reaction with Thiopropyl-Sepharose 4B was achieved.

Die vorliegende Erfindung ist darin zu sehen, dass die Fixierung von biologisch signifikanter Materie unmittelbar über die verbleibenden nucleophilen Gruppen, insbesondere deren Aminogruppen erfolgen kann, wofür überraschenderweise trotz eines hohen Überschusses an Reagenz noch eine ausreichende Zahl dieser Gruppen mit einer für die Fixierung hinreichenden sterischen Zugänglichkeit zur Verfügung steht. The present invention is to be seen in the fact that the fixation of biologically significant matter can take place directly via the remaining nucleophilic groups, in particular their amino groups, for which, surprisingly, despite a large excess of reagent, a sufficient number of these groups with sufficient steric accessibility for the fixation is available.

Die Modifizierung bzw. Aktivierung der nach der Blockierung mit den Reagentien R übriggebliebenen Aminogruppen zum Zwecke der Anbindung an den Träger T ist somit nicht erforderlich, was einen wesentlichen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik bedeutet. The modification or activation of the amino groups remaining after the blocking with the reagents R for the purpose of connection to the support T is therefore not necessary, which means a significant advance over the prior art.

Im allgemeinen kann bei dem erfindungsgemässen Verfahren wie folgt vorgegangen werden: In general, the process according to the invention can be carried out as follows:

Man stellt eine Lösung, vorzugsweise unter Verwendung eines Puffers zweckmässig im alkalischen Bereich (beispielsweise pH 8,7) und mit einem Gehalt an NaCl her, der die biologisch signifikante Materie, in der Regel ein Protein beispielsweise einen Antikörper enthält, her, mischt vorzugsweise mit einem Überschuss am Reagenz R (ca. 200-500 mol) das in einem geeigneten, vorzugsweise mit Wasser mischbaren Lösungsmittel insbesondere Dimethylformamid (DMF) gelöst worden war, wobei der Gehalt an dem Lösungsmittel zweckmässig unterhalb 5 Gew.-% bezogen auf die Lösung gehalten wird. A solution is prepared, preferably using a buffer, suitably in the alkaline range (for example pH 8.7) and containing NaCl, which contains the biologically significant material, usually a protein, for example an antibody, and is preferably mixed an excess of the reagent R (about 200-500 mol) which had been dissolved in a suitable, preferably water-miscible solvent, in particular dimethylformamide (DMF), the content of the solvent advantageously being kept below 5% by weight, based on the solution becomes.

Man inkubiert dann zweckmässig unter Kühlung, beispielsweise in einem Eisbad 45 + 15 Minuten lang, wobei die gewünschte Modifikation der biologisch signifikanten Materie eintritt. The incubation is then expediently carried out with cooling, for example in an ice bath for 45 + 15 minutes, the desired modification of the biologically significant matter occurring.

Dann überführt man diese erhaltene Flüssigkeit in ein geeignetes Gefäss (beispielsweise ein Zentrifugenglas) das das Trägermaterial T enthält und inkubiert, beispielsweise zunächst für einige Stunden (Anhaltspunkt ca. 4 Stunden) und anschliessend eine wesentlich längere, beispielsweise die vierfache Zeit, bei reduzierter Temperatur jedoch oberhalb 0°C, beispielsweise bei 4°C. The liquid obtained is then transferred to a suitable vessel (for example a centrifuge glass) which contains and incubates the carrier material T, for example initially for a few hours (approx. 4 hours) and then for a considerably longer time, for example four times as long, but at a reduced temperature above 0 ° C, for example at 4 ° C.

Danach wird die Blockierung der nicht zur Reaktion gekommenen funktionellen Gruppen FG des Trägers T mittels chemischer Reagentien vorgenommen; im Falle von epoxigruppenhaltigen Trägem, beispielsweise durch Reaktion mit 2-MercaptoethanoI, etwa in Form einer 0,2 M-Lösung und bei Raumtemperatur. In der Regel genügt auch hier eine mehrstündige, etwa 4stündige Einwirkung. Anschliessend wird das beladene Trägermaterial gewaschen, beispielsweise mit Phosphat-Standardpuffer (PBS). Die Abspaltung der Schutzgruppen (die als Reagenz R aufgebracht worden waren) wird vorzugsweise hydrolytisch in einem zweckmässigen pH-Bereich, beispielsweise im schwach sauren Bereich, etwa bei pH 5,5 vorgenommen, wobei eine Hydrolysedauer von ca. 1 Stunde als Anhaltspunkt dienen kann. The functional groups FG of the carrier T which have not reacted are then blocked by means of chemical reagents; in the case of carriers containing epoxy groups, for example by reaction with 2-mercaptoethanoI, approximately in the form of a 0.2 M solution and at room temperature. As a rule, a multi-hour, approximately 4-hour exposure is sufficient. The loaded carrier material is then washed, for example with standard phosphate buffer (PBS). The protective groups (which had been applied as reagent R) are preferably removed hydrolytically in a suitable pH range, for example in the weakly acidic range, for example at pH 5.5, a hydrolysis time of about 1 hour serving as a reference point.

Abschliessend wird das Trägermaterial noch einmal mit PBS gewaschen. Finally, the carrier material is washed again with PBS.

O O

6 6

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

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50 50

55 55

60 60

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CH 679 399 A5 CH 679 399 A5

Bestimmung der Immuno-Kapazität von erfindungsgemäss fixierten Antikörpern Determination of the immuno-capacity of antibodies fixed according to the invention

Die Bindungskapazität der erfindungsgemäss immobilisierten Antikörper wird bestimmt durch Messung der Antigene insbesondere von Enzymen wie z.B. der Anti-Carboxypeptidase (CPA) die sich an die Antikörper binden. Zu diesem Zweck wird beispielsweise CPA in gleichbleibenden Quantitäten im PBS zu Reagenzgläsern gegeben, die jeweils 100 mg des beladenen Trägermaterials T aber mit verschiedener Beladung an immobilisierten monoklonalen Antikörpern tragen. Der an die Antikörper des Matrixpolymerisats gebundene CPA-Anteil wurde wie folgt bestimmt: The binding capacity of the antibodies immobilized according to the invention is determined by measuring the antigens, in particular of enzymes such as e.g. the anti-carboxypeptidase (CPA) that bind to the antibodies. For this purpose, for example, CPA is added in constant quantities in the PBS to test tubes which each carry 100 mg of the loaded carrier material T but with different loads of immobilized monoclonal antibodies. The proportion of CPA bound to the antibodies of the matrix polymer was determined as follows:

a) durch Bestimmung der Differenz des jeweiligen Proteingehalts mittels des BRADFORD-Tests und die enzymatische Aktivität, die in der Ausgangslösung und schliesslich in der Restlösung vorhanden war, a) by determining the difference in the respective protein content using the BRADFORD test and the enzymatic activity which was present in the starting solution and finally in the residual solution,

ß) durch Bestimmung der enzymatischen Aktivität des an die Träger-Perlen T immobilisierten Enzyms, bei EPA z.B. mit Hilfe der Ninhydrin-Methode. β) by determination of the enzymatic activity of the enzyme immobilized on the carrier beads T, in EPA e.g. with the help of the ninhydrin method.

Die Bestimmung über die Enzymaktivität ist in all den Fällen angebracht, wo Antikörper vorhanden sind, welche die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen. The determination of the enzyme activity is appropriate in all cases where antibodies are present which do not impair the enzyme activity.

Es erweist sich, dass die erfindungsgemäss am Trägermaterial fixierten Antikörper ihre volle immunologische Aktivität zur Bindung des Enzyms, beispielsweise CPA, beibehalten. It has been shown that the antibodies fixed to the support material according to the invention retain their full immunological activity for binding the enzyme, for example CPA.

Das molare Verhältnis von monoclonalem Antikörper zu CPA bewegt sich im Rahmen 2:1 bis 1:1. The molar ratio of monoclonal antibody to CPA ranges from 2: 1 to 1: 1.

Vorteilhafte Wirkungen Beneficial effects

Die vorteilhaften Wirkungen des erfindungsgemässen Verfahrens seien wiederum anhand einer Ausführungsform beschrieben, bei der Antikörper an epoxygruppenhaltigem Trägermaterial T fixiert worden waren. The advantageous effects of the method according to the invention are again described using an embodiment in which antibodies had been fixed to carrier material T containing epoxy groups.

Beim Vergleich von Antikörpern, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren und die nach dem Verfahren des Standes der Technik am gleichen Trägersystem T («®EUPERGIT C») fixiert worden waren, wurden (bei einer Antikörperbeladung von 10 mg/g EUPERGIT C) die in der Tabelle wiedergegebenen Resultate erzielt. When comparing antibodies that had been fixed according to the inventive method and according to the prior art method on the same carrier system T (“®EUPERGIT C”), the (in the case of an antibody loading of 10 mg / g EUPERGIT C) the in the Results shown in the table achieved.

Die Aktivität aller Antikörper, die erfindungsgemäss immobilisiert worden waren, hatte sich gesteigert. Der Aktivitätszuwachs bei den verschiedenen Antikörpern bewegte sich zwischen dem 3- und dem 10,7fachen, anscheinend in Abhängigkeit von den spezifischen Charakteristiken individueller Antikörper. Soweit die bisherigen Ergebnisse eine Aussage erlauben, erbrachte lediglich der Anti-Meerrettich-Peroxidase mAB, HRP2-Antikörper keine gesteigerte Aktivität nach Immobilisierung mittels des erfindungsgemässen Verfahrens im Vergleich mit der Standardmethode. The activity of all antibodies that had been immobilized according to the invention had increased. The increase in activity for the various antibodies ranged between 3 and 10.7 times, apparently depending on the specific characteristics of individual antibodies. As far as the previous results allow a statement, only the anti-horseradish peroxidase mAB, HRP2 antibody did not show any increased activity after immobilization by means of the method according to the invention in comparison with the standard method.

Der Einfiuss des Reagenzes R wurde mit verschieden grosser Beladung an Antikörper pro Gramm periförmigem Trägermaterial T bestimmt. Um die Voraussetzungen für einen unmittelbaren Vergleich zwischen den beiden Methoden zu erfüllen, wurde derselbe Antikörper (CPAB) nach beiden Verfahren im gleichen Experiment immobilisiert. Es wurde gefunden, dass der höchste Aktivitätszuwachs bei den immobilisierten Antikörpern dann beobachtet wurde, wenn die Beladung mit Antikörpern gering war. The inflow of reagent R was determined with a different loading of antibody per gram of bead-like carrier material T. To meet the requirements for a direct comparison between the two methods, the same antibody (CPAB) was immobilized in both experiments in the same experiment. It was found that the greatest activity increase in the immobilized antibodies was observed when the loading with antibodies was low.

Tabelle table

Vergleich der Aktivitäten von Anti-CPA-Antikörpem, die nach der Standardmethode und nach dem erfin-dungsgemässen Verfahren mit Dimethylmaleinsäureanhydrid an EUPERGIT C immobilisert worden waren. Comparison of the activities of anti-CPA antibodies which had been immobilized on EUPERGIT C using dimethyl maleic anhydride using the standard method and the method according to the invention.

Antikörper-Aktivität* Monoclonale Antikörper Antibody activity * Monoclonal antibodies

Standardmethode Standard method

Erfindungsgemässes Verfahren Method according to the invention

Steigerungsfaktor Increase factor

CPA1 CPA1

0,040 0.040

0,362 0.362

9,0 9.0

CPA8 CPA8

0,060 0.060

0,216 0.216

3,6 3.6

CPA9 CPA9

0,082 0.082

0,242 0.242

3,0 3.0

CPA14 CPA14

0,102 0.102

0,300 0.300

3,0 3.0

CPA18 CPA18

0,030 0.030

0,322 0.322

10,7 10.7

* Die Antikörperaktivität wird ausgedrückt durch die Aktivität der CAP, die vom Antikörper immobilisiert wurde. Die CPA-Aktivität wurde mittels der Ninhydrin-Methode bestimmt Die Werte in der Tabelle stellen die Netto-Absorption bei 550 nm nach Abzug des Blindwerts dar. * Antibody activity is expressed by the activity of the CAP immobilized on the antibody. The CPA activity was determined using the ninhydrin method. The values in the table represent the net absorption at 550 nm after deduction of the blank value.

Die günstigen Resultate bei der Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens erlauben es, eine Vorstellung von der Wirkweise der an ®EUPERGIT C immobilisierten Antikörper zu entwickeln, die jedoch ohne Einfiuss auf die Tragweite der vorliegenden Erfindung sein soll. Der Erfolg des Verfahrens The favorable results when using the method according to the invention make it possible to develop an idea of the mode of action of the antibodies immobilized on ®EUPERGIT C, which, however, should have no influence on the scope of the present invention. The success of the process

7 7

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

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45 45

50 50

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CH 679 399 A5 CH 679 399 A5

beruht primär auf der Blockierung der freien Oxiran-Funktionen bevor die Konzentration am Reagenz R abgenommen hat. Verläuft das Verfahren in dieser Weise, dann kann mit dem Wirksamwerden zweier Mechanismen gerechnet werden. Erstens unterliegen diejenigen Aminogruppen, die für die Antikörper-Bindung essentiell sind und die durch die Reaktion mit dem Reagenz R vor der Anbindung an den Träger geschützt worden waren, nicht der Modifizierung und können daher ihre Aktivität entfalten. is based primarily on the blocking of the free oxirane functions before the concentration of the reagent R has decreased. If the procedure proceeds in this way, two mechanisms can be expected to take effect. First, those amino groups that are essential for antibody binding and that were protected from binding to the support by the reaction with the reagent R are not subject to modification and can therefore develop their activity.

Zweitens dürfte die Zahl der Fixierungspunkte zwischen Antikörpern und dem Trägermaterial T relativ klein sein, verglichen mit der Zahl, die man bei der Interaktion mit nicht-vorbehandelten Antikörpern erwarten sollte. Darüber hinaus sollte nicht vergessen werden, dass ungeachtet der Tatsache, dass die hauptsächlichen Bindungsstellen aus der Interaktion der Oxirangruppen mit der Amino-Funktion des Ly-sins stammen dürften, dennoch auch andere Gruppen, wie z.B. die Sulfhydrylgruppen von Cystein-Re-sten, sowie die Hydroxylgruppen des Tyrosins, Serins u. Tyrosins involviert sein könnten. Möglicherweise trägt auch die reversible Blockierung dieser Hydroxygruppen zu dem zusätzlichen Aktivitätsanstieg der immobilisierten Antikörper bei. Second, the number of fixation points between antibodies and the carrier material T should be relatively small compared to the number that should be expected when interacting with non-pretreated antibodies. In addition, it should not be forgotten that despite the fact that the main binding sites are likely to result from the interaction of the oxirane groups with the amino function of the lysine, other groups such as e.g. the sulfhydryl groups of cysteine residues, and the hydroxyl groups of tyrosine, serine and the like. Tyrosins could be involved. The reversible blocking of these hydroxyl groups may also contribute to the additional increase in activity of the immobilized antibodies.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung: The following examples serve to illustrate the invention:

BEISPIELE Beispiel 1 EXAMPLES Example 1

Allgemeine Vorschrift. General rule.

0,5 mg Trägerperlen (©EUPERGIT C der Fa. Röhm GmbH) werden in Beckman-Zentrifugenröhren mit einem Volumen von 5-10 nl eingebracht. 0.5 mg carrier beads (© EUPERGIT C from Röhm GmbH) are placed in Beckman centrifuge tubes with a volume of 5-10 nl.

Eine Lösung der Antikörper (5-10 (ig pro Probe, 0,3-1,3 jj.g/p.1 5-30 (j.1) in 25 mM Natriumborat-Puffer von pH 8,7 der 1 M NaCI enthält wird mit einem Überschuss (x 400 mol/mol) Dimethylmaleinsäureanhy-drid in Dimethylformamid (DMF) gemischt, wobei die entstehende DMF-Konzentration 5 Gew.-% nicht überschreiten soll. Nachdem die Lösung in einem Eisbad 30-60 Minuten inkubiert worden war, werden die modifizierten Antikörper zu den Trägerperien T hinzugegeben und anschliessend 4 Stunden bei Raumtemperatur und dann noch 16 Stunden bei 4°C gehalten. A solution of the antibodies (5-10 (ig per sample, 0.3-1.3 jj.g / p.1 5-30 (j.1) in 25 mM sodium borate buffer of pH 8.7 of 1 M NaCl is mixed with an excess (x 400 mol / mol) of dimethyl maleic anhydride in dimethylformamide (DMF), the resulting DMF concentration not to exceed 5% by weight after the solution has been incubated in an ice bath for 30-60 minutes , The modified antibodies are added to the carrier beads T and then kept at room temperature for 4 hours and then at 4 ° C. for a further 16 hours.

Noch vorhandene Oxiran(Epoxid)-Grupppen werden dann chemisch blockiert, indem man das Träger-Antikörper-Konjugat mit 2-Mercaptoethanol-Lösung behandelt. (0,2 M, 4 Stunden bei Raumtemperatur) Die Perlen werden dann mit Standard-Phosphatpuffer (PBS) gewaschen. Die Abspaltung der aus Dime-thylmaleinsäureanhydrid gebildeten Schutzgruppen von den Antikörpern wird durch Inkubieren mit 50 mM Citratpuffer, pH 5,5 (1 Stunde bei Raumtemperatur) vorgenommen. Zum Abschluss wäscht man die Perlen gründlich mit Standard-Phosphatpuffer. Existing oxirane (epoxy) groups are then chemically blocked by treating the carrier-antibody conjugate with 2-mercaptoethanol solution. (0.2 M, 4 hours at room temperature) The beads are then washed with standard phosphate buffer (PBS). The protective groups formed from dimethyl maleic anhydride are cleaved from the antibodies by incubation with 50 mM citrate buffer, pH 5.5 (1 hour at room temperature). Finally, the beads are washed thoroughly with standard phosphate buffer.

Als Antikörper sind beispielhaft eingesetzt worden: The following have been used as examples of antibodies:

1) Murine monoclonale Antikörper spezifisch für Carboxypeptidase A. 1) Murine monoclonal antibodies specific for carboxypeptidase A.

2) Murine monoclonale Antikörper spezifisch für menschliches Choriogonadotropin. 2) Murine monoclonal antibodies specific for human choriogonadotropin.

3) Murine monoclonale Antikörper spezifisch für Humaninsulin. 3) Murine monoclonal antibodies specific for human insulin.

4) Eine Präparation von polyclonalen Ziegen-Antikörpern spezifisch für das FG-Fragment von murinem IgG. 4) A preparation of goat polyclonal antibodies specific for the FG fragment of murine IgG.

Beispiel 2 Example 2

Die Aktivitäten von Anti-Carboxypeptidase-A (Anti-CPA)-Antikörpem, die einmal nach dem Stand der Technik und einmal nach dem erfindungsgemässen Verfahren immobilisiert worden waren, wurden bei einer Belegung von 10 mg Antikörper pro Gramm ®EUPERGIT C verglichen. Die Aktivitäten sämtlicher, nach dem erfindungsgemässen Verfahren immobilisierten Antikörper waren gestiegen (s. Tabelle). Der Aktivitätsanstieg reichte bei den verschiedenen Antikörpern vom 3- bis 10,7fachen, anscheinend in Abhängigkeit von den spezifischen Charakteristiken der individuellen Antikörper. The activities of anti-carboxypeptidase-A (anti-CPA) antibodies, which had been immobilized once according to the prior art and once according to the method according to the invention, were compared with an occupancy of 10 mg of antibody per gram of ®EUPERGIT C. The activities of all antibodies immobilized by the method according to the invention had increased (see table). The increase in activity ranged from 3 to 10.7 times for the various antibodies, apparently depending on the specific characteristics of the individual antibodies.

Nach den bisher vorliegenden Ergebnissen zeigte nur die Anti-Meerettichperoxidase mAB, HRP2 keinen Aktivitätsanstieg nach erfindungsgemässer Immobilisierung im Vergleich zu den Immobilisierungsprodukten aus dem Verfahren des Standes der Technik. According to the results available to date, only the anti-horseradish peroxidase mAB, HRP2 showed no increase in activity after immobilization according to the invention compared to the immobilization products from the prior art method.

Beispiel 3 Example 3

In den vorstehenden Beispielen wurde ein 400facher molarer Überschuss an Dimethylmaleinsäurean-hydrid, bezogen auf die Antikörper, eingesetzt. Untersuchungen zur Variation des Antikörper-Dime-thylmaieinsäureanhydrid-Verhältnisses ergaben, dass relativ geringe Dosen an Dimethylmaleinsäurean-hydrid ausreichen, um die volle Wirkung zu erzielen. Ein nicht sehr stark ausgeprägtes Optimum wurde im Bereich eines 20CH500 molaren Überschusses registriert. In the above examples, a 400-fold molar excess of dimethyl maleic anhydride, based on the antibodies, was used. Studies on the variation of the antibody-dimethyl-malic acid anhydride ratio showed that relatively low doses of dimethyl maleic anhydride are sufficient to achieve the full effect. A not very pronounced optimum was registered in the range of a 20CH500 molar excess.

Steigert man den Überschuss auf das 10 OOOfache der Antikörper-Konzentration, so setzt ein allmählicher Aktivitätsabfall der immobilisierten Antikörper ein. If the excess is increased to 10,000 times the antibody concentration, the activity of the immobilized antibodies gradually decreases.

8 8th

5 5

10 10th

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Claims

1. A method for the covalent binding of biologically active proteins to solid, functional group-carrying material, characterized in that in a first reaction step the particularly reactive amino groups of the protein are modified with a reagent R, which can be reversibly removed under controlled conditions, in one second reaction step the protein is reacted with the functional groups FG of the carrier material T, in a third reaction step the remaining functional groups FG of the carrier material T are chemically blocked and in the final reaction step the modifying groups R 'formed from the reagent R are controlled in a controlled manner Reaction to be split off.

2. The method according to claim 1, characterized in that the reagent R is one of the formula wherein R is methyl, R 'is hydrogen or methyl and A and A' is methyl groups, or symbolize a double bond.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that the reagent R is selected from the group consisting of dimethylmaic anhydride and citraconic anhydride.

4. The method according to claims 2 and 3, characterized in that the reagent R is applied in a 200- to 500-fold molar excess over the proteins.

5. The method according to claims 1 to 4, for binding antibodies.

6. The method according to claims 1 to 4, characterized in that the solid, functional group-containing carrier material T has oxirane groups as functional groups.

7. The method according to claim 6, characterized in that the carrier material having solid functional groups consists of hollow beads containing oxirane groups.

8. The method according to claims 1 to 4, characterized in that the first reaction step is carried out in a weakly alkaline buffer, preferably at pH 8.7.

9. The method according to claim 8, characterized in that the buffer is still 1 molar of NaCl.

10. The method according to claim 1, characterized in that in the second reaction step, the middle of the reagent R-modified protein with the carrier material is first incubated for a few hours at room temperature and then slightly above 0 ° C for about four times the time.

11. The method according to claims 1 and 10, characterized in that the conjugate formed in the second reaction step from protein and the carrier material T is treated in the third reaction step to block any oxirane groups still present with 2-mercaptoethanol solution.

12. The method according to claims 1 and 10-11, characterized in that the product of the third reaction step is hydrolytically freed from the protective group R 'formed from the reagent R.

A

O

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