Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, seine Herstellung, pharmazeutische Präparate, welche es enthalten und seine Verwendung als Arzneimittel.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Zuckerderivat eines biologisch aktiven Peptids, das
EMI1.1
ist, sowie die Säureadditionssalze und Komplexe davon, bereitgestellt.
Im folgenden werden diese Verbindungen als erfindungsgemässe Verbindungen bezeichnet.
Unter einem nicht mit einem Zucker modifizierten Peptid wird das strukturell entsprechende Peptid verstanden, das keinen Zuckerrest oder keine Zuckerreste aufweist. Ein solches Peptid wird im folgenden als das nicht modifizierte Peptid bezeichnet.
Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemässe Verbindung besonders interessante und überraschende pharmakologische Eigenschaften zeigt, insbesondere eine längere Wirkungsdauer, worauf später noch eingegangen wird.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindung wie in den Patentansprüchen 5 bis 8 dargelegt. Diese Verbindung kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden.
Die erfindungsgemässe Verbindung kann beispielsweise hergestellt werden, indem
a) wenigstens eine Schutzgruppe, die in der Verbindung vorhanden ist, entfernt wird,
b) zwei Peptideinheiten, wovon jede mindestens eine Aminosäure oder einen Aminoalkohol in geschützter oder ungeschützter Form und diejenige Peptideinheit mit mindestens einer Aminosäure den Zuckerrest enthält, durch eine Amidbildung verbunden werden, wobei die Peptidbildung in einer Weise erfolgt, dass sich die gewünschte Aminosäuresequenz ergibt, und dann gegebenenfalls die Stufe a) durchgeführt wird, oder
c) der entsprechende, gegebenenfalls geschützte Zuckerrest in das geschützte oder ungeschützte Octreotid eingeführt und dann gegebenenfalls die Stufe a) durchgeführt wird,
d) eine funktionelle Gruppe eines ungeschützten oder geschützten mit Zucker derivatisierten Peptids in eine andere funktionelle Gruppe umgewandelt oder entfernt wird, so dass sich die Verbindung wie oben definiert ergibt, und im letztgenannten Fall die Stufe a) des Verfahrens durchgeführt wird, oder
e) ein mit dem entsprechenden Zucker derivatisiertes Octreotid, worin die Mercaptogruppen von Cys-Resten in freier Form vorliegen, oxidiert und so die Verbindung gebildet wird, worin 2 Cys-Reste durch eine S-S-Brücke verbunden sind,
und die Verbindung in freier Form, in Form eines Säureadditionssalzes oder in Komplex form isoliert wird.
Die obigen Umsetzungen stellen an sich bekannte Verfahren dar und können analog zu den folgenden Beispielen durchgeführt werden, wobei die Verfahren a) und b) insbesondere nach den im folgenden beschriebenen erfindungsgemässen Syntheseverfahren durchgeführt werden können. Gewünschtenfalls können bei diesen Umsetzungen Schutzgruppen, die sich bei Peptiden oder Zuckern eignen, für funktionelle Gruppen verwendet werden, die nicht an der Umsetzung teilnehmen. Unter solchen Schutzgruppen werden auch Polymerharze mit funktionellen Gruppen verstanden.
Die erfindungsgemässe Verbindung kann hergestellt werden, indem das geschützte Peptid, das eine freie Aminogruppe enthält, in einem leicht sauren Medium mit dem reduzierenden Disaccharid (Amadori-Umlagerung) umgesetzt wird und dann die Schutzgruppen entfernt werden.
Diese Umsetzung kann in einer für die Amadori-Umlagerung üblichen Weise durchgeführt werden. Die zugesetzte Säure kann beispielsweise Eisessig sein. Vorzugsweise wird mit einem Überschuss an Kohlenhydrat gearbeitet, der beispielsweise 10 Äquivalente auf 1 Äquivalent der Peptidverbindung ausmacht. Die Umsetzung wird in einem polaren Lösungsmittel, wie Methanol, vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 60 bis 70 DEG C durchgeführt.
Die Ausgangsmaterialien und Verbindungen der Erfindung können durch Flüssigphasensynthese oder Festphasensynthese hergestellt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen lassen sich am einfachsten durch Festphasensynthese herstellen.
Es wurde ein besonders bequemes Verfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen gefunden, die am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiolgruppe enthalten. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von Peptidalkoholen, die einen C-terminalen Threoninolrest enthalten.
Die Festphasenpeptidsynthese hat sich als besonders rasches und günstiges Verfahren zur Herstellung von Peptiden erwiesen und stellt daher ein hierzu heute allgemein übliches Verfahren dar.
Hierbei wird bekanntlich zuerst eine Aminosäure über ihre Carboxylgruppe unter Bildung einer Estergruppe oder Amidgruppe an eine Hydroxylgruppe oder Aminogruppe eines unlöslichen Syntheseharzes gebunden, worauf in der gewünschten Sequenz die weiteren Aminosäuren gebunden werden und abschliessend das fertige Polypeptid vom Trägerharz abgespalten wird.
Diese Synthese bereitet bei normalen Polypeptiden mit C-terminalen Aminosäuren keine Probleme. Polypeptidalkohole, die an ihrem C-terminalen Ende einen Aminoalkohol anstelle einer Aminosäure enthalten, gehen jedoch nicht ohne weiteres eine Bindung mit Trägerharzen ein, welche Hydroxylgruppen oder Aminogruppen aufweisen, und/oder lassen sich nach beendeter Synthese nicht so leicht vom Trägerharz abspalten.
Als mögliche Festphasenverfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen wurden bereits folgende Methoden vorgeschlagen:
a) Eine herkömmliche Herstellung des entsprechenden Polypeptids, das am C-terminalen Ende eine Aminosäure enthält (wie der Ester eines hydroxylgruppenhaltigen Harzes), und eine anschliessende reduktive Aufspaltung unter Verwendung von Borhydriden, wodurch die Carboxylgruppe zugleich in eine Alkoholfunktion überführt wird (US-A 4 254 023 und US-A 4 254 024).
b) Eine Bindung des terminalen Aminoalkohols als Ether an ein Hydroxymethylharz unter Verwendung von Carbonyldiimidazol und eine nach der Synthese des Peptids erfolgende Abspaltung unter Verwendung von HCl/TFA oder HBr/TFA (Kun-hwa Hsieh und G.R. Marshall, ACS National Meeting, New Orleans, 21.-25. März 1977).
Diese beiden Methoden erfordern jedoch drastische Bedingungen bei der Aufspaltung.
Es wurde nun gefunden, dass sich die Abspaltung des Peptids vom Harz bei gleichzeitiger Bildung des C-terminalen Peptidalkohols dann unter milden Bedingungen durchführen lässt, wenn der C-terminale Aminoalkohol über eine Acetalbindung an das Harz gebunden ist.
Der Peptidalkohol, der am C-terminalen Ende der Peptidkette 2 Alkoholgruppen oder 1 Alkoholgruppe und 1 Thiolgruppe enthält, wird durch saure Hydrolyse eines Acetals aus dem Peptidalkohol und einem polymeren Harz, das Formylphenylgruppen enthält, gebildet.
Die dabei ablaufende Reaktion lässt sich formelmässig wie folgt darstellen:
EMI5.1
Darin haben die erwähnten Symbole folgende Bedeutungen:
EMI6.1
ist der Rest eines unlöslichen Syntheseharzes.
Z ist eine direkte Bindung oder ein Rest, der das Harz mit der (acetalisierten) Formylphenylgruppe verbindet.
X steht für O oder S.
R1 ist Wasserstoff oder Methyl.
Y ist der Rest eines Peptidalkohols, der beispielsweise Schutzgruppen tragen kann. Die gegebenenfalls acetalisierte Gruppe CHO befindet sich dabei in m- oder p-Stellung zum Rest Z.
Aus Gründen der Einfachheit ist bei den im obigen Reaktionsschema angeführten Formeln Ir und IIr jeweils nur eine Substitutionsgruppe am Harz angegeben. An ein Molekül des polymeren Harzes ist jedoch selbstverständlich eine Reihe solcher Gruppen gebunden. Die Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz durch Hydrolyse der Acetalgruppe erfolgt, wie bereits oben angegeben, unter sauren Bedingungen, beispielsweise mittels verdünnter Trifluoressigsäure. Diese Hydrolyse kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Ist Z in der Formel Ir eine direkte Bindung, dann sind die Acetalgruppen tragenden Phenylreste direkt an den Polymerrest gebunden und gehören zum Polymer. Beispiele für solche Verbindungen der Formel Ir sind die Acetale eines formylierten Polystyrolharzes (hierbei ist
EMI6.2
in der Formel Ir dann eine Polyäthylenkette).
Ist Z ein Rest, dann enthält dieser Rest eine Gruppe, welche aus einer Umsetzung zwischen einer reaktionsfähigen Gruppe, die direkt oder indirekt an das Polymer gebunden ist, und einer anderen reaktionsfähigen Gruppe, die direkt oder indirekt an die (acetalisierte) Formylphenylgruppe gebunden ist, resultiert.
Der Rest Z kann beispielsweise die folgende Formel IIIr haben:
-(D)p-Q1-Q2-(E)q- (Formel IIIr),
worin die einzelnen Symbole folgende Bedeutungen haben:
Q1 = Rest einer reaktionsfähigen Gruppe, die an das Polymer gebunden ist,
Q2 = Rest einer reaktionsfähigen Gruppe, die an die (acetalisierte) Formylphenylgruppe gebunden ist,
D = Rest, der die Gruppe Q1 mit dem Polymer verbindet,
E = Rest, der die Gruppe Q2 mit der (acetalisierten) Formylphenylgruppe verbindet.
Die Indices p und q stehen unabhängig voneinander für 0 oder 1.
Die Gruppe Q1-Q2 ist vorzugsweise eine Estergruppe oder Amidgruppe, und insbesondere eine Carbonamidgruppe. Q1 steht vorzugsweise für NH, und Q2 bedeutet vorzugsweise CO.
Die Gruppen D und E sind unabhängig voneinander beispielsweise Alkylenreste oder Alkylenoxyreste mlt 1 bis 5 Kohlenstoffatomen.
Beispiele für Verbindungen der Formel Ir, worin Z ein Rest der Formel IIIr ist, sind die Verbindungen, bei denen
EMI7.1
für den Rest eines aminomethylierten Polystyrolharzes steht und der Rest der Formel
EMI8.1
ein Rest der Formel IVr ist
EMI8.2
worin R Wasserstoff oder Methyl bedeutet und m für 0 oder 1 steht,
wobei sich die Acetalgruppe wiederum in Stellung m oder p befindet.
In einem solchen Fall bedeutet Z die Gruppe
EMI8.3
während P Polystyrol ist.
Der Rest IVr hat vorzugsweise die Formel
EMI8.4
Anstelle des aminomethylierten Polystyrols können auch andere Polymere verwendet werden, und zwar insbesondere solche mit freien Aminogruppen, wie Polyacrylamide, welche Aminoethylgruppen tragen.
Die acetalisierte Formylphenylgruppe ist, wie bereits oben erwähnt, an das Polymer vorzugsweise durch eine Amidbindung gebunden. Hierdurch wird sichergestellt, dass die Bindung des acetalisierten Formylphenylrestes an das Harz während der Synthese des Polypeptids und während dessen Abspaltung vom Polypeptid stabil ist und dass die Abspaltung in der gewünschten Weise an der Acetalbindung erfolgt, so dass einerseits der Peptidalkohol gebildet wird und andererseits der Formylphenylrest am Harz bleibt.
Gewünschtenfalls kann der Peptidalkohol auch in einer vom Harz weiteren Entfernung gebunden sein, indem zwischen den reaktionsfähigen Gruppen des Polymers, insbesondere Aminogruppen, und den reaktionsfähigen Gruppen des acetalisierten Formylphenylderivats, insbesondere Carboxylgruppen, sogenannte Abstandshalter eingebaut werden. Für bestimmte Reaktionen am Polypeptidalkohol wird dies zweckmässigerweise vor der Aufspaltung getan, wie durch Oxidation von Cysteinresten. In diesem Fall enthält der Rest D oder E in der Formel IIr zusätzlich den Abstandshalter, wobei Q1 oder Q2 der reaktionsfähige Rest des Abstandshalters ist.
Der verwendete Abstandshalter kann beispielsweise eine omega -Aminocarbonsäure, wie epsilon -Aminocapronsäure, sein.
Bei Anwendung eines aminomethylierten Polystyrols, eines Rests der Formel IVr und von epsilon -Aminocapronsäure als Abstandshalter entspricht die Gruppe Z dann beispielsweise der folgenden Formel:
EMI9.1
Die Verbindungen der Formel Ir können unter Anwendung von Methoden hergestellt werden, wie sie bei der Festphasentechnologie üblich sind, und zwar ausgehend von einer Verbindung der Formel Vr
EMI10.1
worin A eine Schutzgruppe für die Aminofunktion ist und sich die Acetalgruppe in Stellung m oder p zum Rest Z befindet. Zu diesem Zweck wird zuerst die Schutzgruppe A abgespalten und die freie Aminogruppe dann mit der nächsten N-geschützten Aminosäure usw. so lange umgesetzt, bis alle Aminosäuren an das Harz in einer Sequenz gebunden sind, die dem gewünschten Peptidalkohol entspricht.
Die Aminoschutzgruppen, welche für die verwendeten Aminosäuren oder den Aminoalkohol ausgewählt werden, müssen so beschaffen sein, dass sie sich unter nicht sauren Bedlngungen abspalten lassen, da es unter sauren Bedingungen zu einer Hydrolyse der Acetalgruppen kommt. Als derartige Schutzgruppen lassen sich beispielsweise die Gruppen CF3CO- oder FMOC- (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) verwenden. Diese Schutzgruppen lassen sich in einem basischen Medium unter Anwendung von in der Peptid-Chemie üblichen Methoden abspalten.
Es können auch lediglich die Schutzgruppen in den Seitenketten und die Aminoschutzgruppe der als letzte angewandten Aminosäure säurelabil sein und dann gleichzeitig mit der Bildung des Peptidalkohols vom Harz abgespalten werden.
Als Schutzgruppe wird die BOC-Gruppe bevorzugt.
Als Basen werden vorzugsweise KOH oder Piperidin oder NaBH4 verwendet.
Der Aufbau der Peptidkette kann in herkömmlicher Weise ausgehend von einem Peptidrest mit freien Aminogruppen und einer Aminosäure mit freien oder aktivierten Carboxylgruppen durchgeführt werden.
Die Umsetzung kann unter Zusatz von beispielsweise Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid erfolgen.
Die Verbindungen der Formel Vr können beispielsweise hergestellt werden, indem
a) ein eine Aldehydgruppe tragendes Harz der Formel IIr
EMI11.1
worin sich die Gruppe CHO in Stellung m oder p zum Substituenten Z befindet,
mit einem N-geschützten Aminoalkohol der Formel
HX-CHR1-CH(NHA)-CH2OH,
der gegebenenfalls in aktivierter Form vorliegt, umgesetzt wird oder
b) ein Harz der Formel
EMI11.2
mit einer Verbindung der Formel VIr
EMI12.1
worin sich die Acetalgruppe in Stellung m oder p zur Gruppe Q min 1 - (E)q befindet und die Reste Q min 1 und Q min 2 zwei reaktionsfähige Gruppen sind, die unter Bildung einer Brücke Q1 - Q2 miteinander reagieren, umgesetzt wird.
Die Acetalisierung gemäss Verfahren a) kann in Gegenwart einer Säure als Katalysator durchgeführt werden. Zu hierfür geeigneten Säuren gehören p-Toluolsulfonsäure und p-Trifluormethylsulfonsäure.
Gewünschtenfalls kann eine Trimethylsilylgruppe als Schutzgruppe für einen freien Alkohol verwendet werden.
Die Veresterung gemäss Verfahren b) kann unter sehr milden Bedingungen durchgeführt werden, wie durch Umsetzung eines Carbonsäurederivats mit einem Polymer, das eine Gruppe OH oder NH2 trägt.
Die Verbindungen der Formel VIr können durch Acetylierung einer Verbindung der Formel
EMI12.2
mit einer Verbindung der Formel
HX-CHR1-CH(NHA)-CH2OH
hergestellt werden.
Diese Acetylierung kann, wie oben beim Verfahren a) beschrieben, durchgeführt werden.
Während des Aufbaus und der Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz können weitere Umsetzungen bewerkstelligt werden, beispielsweise eine Entfernung von Schutzgruppen, wie S-Schutzgruppen, oder eine Oxidation von Cysteinresten.
Solche Umsetzungen können auch nach erfolgter Abspaltung des Peptidalkohols in flüssiger Phase durchgeführt werden.
Unter Anwendung dieser Synthese lassen sich in einfacher Weise pharmakologisch wirksame und sonstiqe Peptide herstellen, die am C-terminalen Ende zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiolgruppe enthalten.
In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben und die [ alpha ]20_D-Werte nicht korrigiert. Es werden darin die folgenden Abkürzungen verwendet:
AcOH = Essigsäure
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
But = tert.-Butyl
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
DMF = Dimethylformamid
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
MeOH = Methanol
NEt3 = Triethylamin
Thr-ol = Threoninolrest = CH3-CHOH-CH(CH2OH)-NH-
TFA = Trifluoressigsäure
HOBT = N-Hydroxybenzotriazol
Bei dem erhaltenen Peptid handelt es sich um Polyacetat-Polyhydrat mit einem Peptidgehalt von 70 bis 90%.
Durch HPLC-Analyse ergibt sich, dass die Peptide weniger als 5% an anderen Peptiden enthalten.
Der in den folgenden Beispielen angegebene Faktor F zeigt den Peptidgehalt in den erhaltenen Produkten, wobei F = 1 einem Peptidgehalt von 100% entspricht. Der Unterschied bis auf 110% [(1-F) x 100] besteht aus Essigsäure und Wasser.
Beispiel 1:
EMI15.1
EMI15.2
a)
EMI15.3
Zu einer Lösung von 10 g
EMI15.4
Acetat in 100 ml DMF werden bei Raumtemperatur 2,25 g Di-tert.butyl-percarbonat, gelöst in 30 ml DMF, langsam zugetropft. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der Rückstand mit 200 ml Diisopropylether versetzt. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Diisopropylether gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung des Rohproduktes wird dieses über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: CH2Cl2/MeOH 9/1) und anschliessend als weisses amorphes Pulver isoliert.
[ alpha 20_D] 29,8 DEG (c = 1,28 in DMF)
b)
EMI15.5
D-(+)-Maltose und 0,5 g des Endproduktes der Stufe a) werden in 20 ml MeOH/HOAc 9/1 (v/v) gelöst und drei Stunden bei 60-70 DEG C gehalten. Nach dem Eindampfen wird in wenig Methanol aufgenommen und die Titelverbindung mit Diisopropylether gefällt. Zur Reinigung wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9/1).
400 mg
EMI16.1
werden mit 3 ml Trifluoressigsäure (100%) versetzt und solange bei Raumtemperatur gehalten, bis sich das gesamte Ausgangsmaterial gelöst hat (5 Minuten). Durch Zugabe von 20 ml Diisopropylether wird die Titelverbindung gefällt und anschliessend abfiltriert und mit Diisopropylether gewaschen. Durch Kieselgelchromatographie (Laufmittel: CHCl3/MeOH/HOAc/H2O 7/3/0,5/0,5) wird die Titelverbindung gereinigt und als Lyophilisat isoliert.
[ alpha ]20_D = -7,9 DEG (c = 0,71 in 95% AcOH) F: 0,91
Beispiel 2: Herstellung von Octreotid
EMI17.1
1) Herstellung des Ankeracetals (N-CF3CO-Threoninol-acetal der p-Formylphenoxy-essigsäure)
105 g (1,0 Mol) L-Threoninol werden in 200 ml Methanol unter Stickstoffspülung vorgelegt. Zu der erhaltenen klaren Lösung wird bei 0 DEG C eine Lösung aus 200 ml Trifluoressigsäuremethylester in 250 ml Methanol zugetropft. Dabei wird die Innentemperatur mittels Eisbad auf ca. 10 DEG C gehalten. Nach 1,5 Stunden ist in der Reaktionslösung kein Threoninol mehr nachweisbar. Eindampfen bei 40 DEG C ergibt einen weissen kristallinen Rückstand. Dieser wird in 200 ml Essigsäureethylester bei 70 DEG C gelöst und mit 100 ml Hexan gefällt. Dann wird auf 0 DEG C abgekühlt, mit Hexan gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält das N-Trifluoracetyl-threoninol.
50,3 g (0,25 Mol) des erhaltenen Produkts werden in 1,25 Liter Tetrahydrofuran gelöst und tropfenweise mit 75 ml Trimethylchlorsilan versetzt. Sofort anschliessend wird eine Mischung aus 70 ml Triethylamin und 250 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Es entsteht eine weisse Suspension, die 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Dann wird filtriert und das Filtrat bei 40 DEG C unter Bildung eines \ls eingedampft.
Das \l wird in 1,5 Liter Methylenchlorid gelöst und bei Raumtemperatur portionenweise mit 90,4 g p-Formyl-phenoxyessigsäure versetzt. Dann werden portionenweise insgesamt 9 ml Trifluormethansulfonsäuretrimethylsilylester zugegeben. Es wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert und der Rückstand gut mit Methylenchlorid gewaschen.
Das Filtrat wird bei 40 DEG C eingedampft und ergibt als Rückstand ein orangerotes harzartiges Produkt. Dieses Produkt wird über Kieselgel chromatographiert. Die Elution wird mit Essigsäureethylester durchgeführt. Durch Eindampfen der gewünschten Fraktionen wird die oben erwähnte Verbindung mit einer Reinheit von 97% (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) erhalten.
2) Aufbau des geschützten Octapeptids
Man suspendiert 17,2 g aminomethyliertes Polystyrol (Brand Dow 0,7 Gewichtsprozent N, was 0,50 mMol Aminomethylgruppen pro g Harz entspricht) werden in 80 ml Methylenchlorid/Dimethylformamid 4:1 suspendiert. Dazu werden sukzessive 4,17 g des Endprodukts der Stufe 1), 1,6 g Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ist der Kaisertest negativ. Das Gemisch wird filtriert und gewaschen. Das gewaschene Harz wird in 100 ml Tetrahydrofuran/Methanol 3:1 suspendiert und portionenweise mit 10,4 g Natriumborhydrid versetzt. Es wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und gewaschen. Das Harz wird wieder in Methylenchlorid/Dimethylformamid (4:1) suspendiert und mit 5,57 g FMOC-Cys(S-t-Bu)OH, 1,74 g Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 3,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) versetzt.
Hierauf wird die FMOC-Schutzgruppe mit Piperidin (2 x 20 Minuten Kontaktzeit) abgespalten.
In analoger Weise werden sukzessive die N-FMOC-geschützten Aminosäuren Thr-OH, Lys(BOC)-OH, D-Trp-OH, Phe-OH, Cys(S-t-Bu)OH und D-Phe-OH mittels HOBT/DCCI angekuppelt, wodurch man das FMOC-geschützte Oktapeptid-Harz erhält. Die Endbeladung beträgt 0,26 mMol/g.
3) Oxidation und Abspaltung
Das erhaltene Harz wird in 100 ml Trifluorethanol/Methylenchlorid 1:1 suspendiert und mit 50 ml Tributylphosphin versetzt. Rühren 70 Stunden bei Raumtemperatur. Dann wird filtriert, gewaschen und mit 100 ml eines 1:1-Gemisches aus Tetrahydrofuran und einer einnormalen Amminacetatlösung versetzt. Dazu werden 1,1 ml 30%iges wässriges Wasserstoffperoxid gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Dann wird das Harz gewaschen und mit einem Gemisch aus 20 ml Trifluoressigsäure, 80 ml Methylenchlorid, 10 ml Wasser und 2 ml Thioanisol versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt und filtriert und dann mit Trifluoressigsäure und Methylenchlorid gewaschen. Zum Filtrat werden 200 ml 15 Diethylether gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert. Der Rückstand wird in einem wässrigen Puffer gelöst und dann beispielsweise unter Verwendung von Duolit entsalzt.
Durch anschliessendes Gefriertrocknen des Acetats erhält man die Titelverbindung als Essigsäuresalz.
Beispiel 3:
Herstellung von N< alpha >-[ alpha -Glucosyl(1-4)-desoxyfructosyl]-SMS (siehe Beispiel 1)
Nach dem obigen Beispiel 2 werden 393 g des an das Harz gebundenen Oktapeptids hergestellt. Dle Cystein-Schutzgruppen werden reduktiv entfernt. Die Peptidbindung zum Harz wird mittels Wasserstoffperoxid in einem Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser zum cyclischen Oktapeptid oxidiert.
Nach Waschen in Tetrahydrofuran und dann in DMF wird das Peptidharz in 3600 ml eines Gemisches aus DMF und AcOH (8:1) geschüttelt. Die Suspension wird mit 526 g D(+)-Maltosemonohydrat behandelt. Das Gemisch wlrd auf 60 DEG C erwärmt und 18 Stunden bel dieser Temperatur gerührt.
Man kühlt das Gemisch, filtriert das Peptidharz ab und wäscht es der Reihe nach mit DMF und Methanol. Hierauf wird mit Methylenchlorid gewaschen. Sodann wird das Peptid vom Harz abgespalten, indem man das Ganze mit einem Gemisch aus 2900 ml Methylenchlorid und 716 rnl Trifluoressigsäure und einer Spur Wasser behandelt.
Das Filtrat wird unter Rühren anteilsweise mit 597 g Natriumcarbonat versetzt, worauf noch 30 Minuten weitergerührt und dann filtriert wird. Der Rückstand wird mit Methylenchlorid und Methanol gewaschen.
Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt, worauf sich eine Entsalzung unter Verwendung einer Säule, die mit einem keine funktionellen Gruppen enthaltenden Polystyrol, wie Duolit gefüllt ist, oder unter Anwendung eines zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie geeigneten Materials mit Umkehrphase, wie mit Silikon behandeltem Kieselgel, das langkettige Fettalkoholgruppen enthält (beispielsweise Labomatic, Schweiz, Brand HB-SIL-18-20-100) anschliesst. Hierdurch gelangt man zur reinen Titelverbindung.
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind pharmakologisch wirksam und eignen sich daher als therapeutische Mittel.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindungen lässt sich anhand üblicher pharmazeutischer und biopharmazeutischer Tests feststellen. Die Verbindungen sind im allgemeinen nach Verabreichung durch Injektion oder orale Gabe wenigstens genauso stark wirksam wie das nicht-modifizierte Peptid, nämlich das entsprechende zuckerfreie Peptid. Sie werden im allgemeinen besser absorbiert, sind leichter in Wasser löslich und verfügen über eine längere Wirkungsdauer.
Die erfindungsgemässe Verbindung lässt sich daher für die gleichen Indikationen wie das nicht-modifizierte Peptid anwenden.
Die erfindungsgemässe Verbindung kann in üblichen Bioverfügbarkeitstests mit dem nicht-modifizierten Peptid verglichen werden.
Die erfindungsgemässe Verbindung lässt sich beispielsweise längere Zeit nach ihrer Verabreichung noch im Blutplasma feststellen als das nicht-modifizierte Peptid, wie anhand üblicher Versuche zur Ermittlung der Bioverfügbarkeit gezeigt werden kann.
Die erfindungsgemässe Verbindung und das nicht-modifizierte Peptid können beispielsweise Hunden durch orale oder intravenöse Verabreichung in einer zur Erzeugung eines therapeutischen Effekts ausreichenden Einzeldosis verabfolgt werden.
Die Verbindungen werden in Dosen angewandt, die eine Detektion des Peptids oder eines Metaboliten hiervon im Blut ermöglichen. Die Detektion kann in herkömmlicher Weise vorgenommen werden, beispielsweise durch einen Radioimmunversuch.
Beim oben erwähnten Versuch hat sich beispielsweise gezeigt, dass die Verbindung des Beispiels 1 nach oraler Verabreichung eine im Vergleich zu Octreotid um das Zehnfache höhere Blutkonzentration ergibt.
Die absolute Bloverfügbarkeit der Verbindung von Beispiel 1 bei oraler und intravenöser Verabreichung, gemessen auf Basis des AUC-Wertes (Fläche unter der Kurve), ist um das Fünffache höher als beim Octreotid. Die Halbwertszeit für die Ausscheidung nach intravenöser Verabreichung beträgt etwa 2,3 Stunden im Vergleich zu etwa 0,5 Stunden für das Octreotid.
Zusätzlich hat die erfindungsgemässe Verbindung den Vorteil, dass sie in einem stärkeren Ausmass durch die Nieren ausgeschieden werden. Dies lässt sich anhand üblicher Tests beobachten.
Man verabreicht ausgehungerten männlichen Ratten (225 bis 375 g) oral Wasser (50 ml pro kgl. Nach 30 Minuten werden die Tiere beispielsweise mittels Inactin (100 mg pro kg i.p.) anästhesiert. Gallengang und Blase werden kanüliert. Beide Jugularvenen werden freigelegt. Zur Stimulierung einer Diurese wird in eine Vene eine Infusion aus 5% Glucose und 1% Ethanol verabreicht (5 ml pro Stunde). Die andere Vene dient zur Entnahme von Blutproben (0,5 ml) zu jeder Stunde während 4 Stunden.
Die erfindungsgemässe Verbindung und das nicht-modifizierte Peptid werden subkutan in einer Dosis von etwa 10 bis etwa 1000 mu g pro kg verabreicht. Die Konzentration der jeweiligen Verbindung wird in üblicher Weise, beispielsweise durch Radioimmunversuch, bestimmt.
Die Untersuchung der Verbindung des Beispiels 1 und von Octreotid in einer Dosis von 10 mu g pro kg nach dem obigen Test führt zu folgenden Ergebnissen:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: Prozentuale Ausscheidung über
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Galle:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Urin:
<tb> <SEP>Verbindung von Beispiel 1 <SEP>1,6 <SEP>36
<tb> <SEP>Octreotid <SEP>22 <SEP>19
<tb></TABLE>
Octreotid wird sowohl über die Galle als auch den Urin ausgeschieden, während die Ausscheidung der Verbindung von Beispiel 1 vorwiegend über den Urin erfolgt.
Die verbesserte Absorption der erfindungsgemässen Verbindung nach oraler Verabreichung lässt sich wie folgt ermitteln:
Die erfindungsgemässe Verbindung und das nicht-modifizierte Analoge werden oral an OFA-Ratten (beispielsweise in einer Dosis von 10 mg pro kg) verabreicht. Nach bestimmten Zeit spannen, beispielsweise nach 15, 30 und 60 Minuten, werden Blutproben gesammelt. Diese werden dann bezüglich ihres Wirkstoffgehalts analysiert, was beispielsweise durch Radioimmunversuch erfolgen kann.
Die erfindungsgemässe Verbindung erniedrigt die GH-Ausscheidung im Blut und kann wie folgt geprüft werden:
Ausgehungerte Rhesusaffen (wenigstens 5 Affen) in Primatsesseln erhalten die erfindungsgemässen Verbindungen in einem Bananenstück als Träger. Die Verbindung wird in einer Dosis von etwa 0,1 mg pro kg bis etwa 10 mg pro kg p.o. verabreicht. Über einen Katheter wird aus der Vena Saphena Blut entnommen. Die GH-Konzentration im Blut wird durch RIA (Radioimmunversuch) gemessen.
Bei diesem Test mit Rhesusaffen ergibt sich beispielsweise, dass die Verbindung des Beispiels 1 in einer Dosis von 0,1 mg pro kg die GH-Ausscheidung länger als 10 Stunden um wenigstens 50% erniedrigt, während das unveränderte Peptid Octreotid im Vergleich dazu nur eine 5 Stunden anhaltende Erniedrigung ergibt.
Ein weiterer Test wird wie folgt durchgeführt:
Männlichen Ratten wird eine Stunde nach Verabreichung der erfindungsgemässen Verbindung in mehreren logarithmisch gestaffelten Dosen nach Dekapitation Blut entnommen. Der GH-Spiegel im Serum wird durch RIA bestimmt. Bei diesem Versuch ist die erfindungsgemässe Verbindung in Dosen von etwa 0,02 bis etwa 30 mu g pro kg subkutan wirksam.
Bei diesem Test hat sich beispielsweise ergeben, dass die Verbindung des Beispiels 1 einen ID50-Wert von 0,190 mu g pro kg s.c. aufweist, während sich im Vergleich dazu beim gleichen Test für natürliches Somatostatin ein ID50-Wert von 93 mu g pro kg s.c. ergibt (der ID50-Wert gibt die Menge an Verbindung an, welche benötigt wird, um den GH-Gehalt im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren um 50% zu erniedrigen.
Im Gegensatz zum natürlichen Somatostatin ergibt die erfindungsgemässe Verbindung bei diesem Versuch eine langzeitige (beispielsweise 6 Stunden anhaltende) Hemmung der GH-Ausscheidung und sind daher diesbezüglich äusserst wirksam.
Die GH-erniedrigende Wirksamkeit dieser Verbindung lässt sich auch nach oraler Verabreichung an männliche Ratten beobachten, die \stradiolimplantate enthalten. Bei diesem Versuch kommt es zu verhältnismässig geringen Veränderungen im GH-Spiegel. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt:
Männlichen Ratten mit einem Gewicht von etwa 300 g wird unter Ethernarkose ein Silastikschlauch (Länge 50 mm, Durchmesser 3 mm) mit 50 mg \stradiol unter die Rückenhaut implantiert. Zu verschiedenen Zeiten (1 bis 6 Monate später) werden die Tiere wiederholt für Versuche verwendet. Die Testsubstanz wird entweder subkutan oder oral verabreicht.
Direkt vor und auch zu verschiedenen Zeiten nach Verabreichung der Substanz entnimmt man den Tieren etwa 0,8 ml Blut aus dem retroorbitalen Plexus. Man zentrifugiert das Blut und bestimmt den GH-Spiegel im Serum durch RIA.
Bei diesem Versuch zeigt sich, dass die erfindungsgemässe Verbindung nach oraler Verabreichung sogar nach mehreren Stunden noch wirksamer ist als das entsprechende nicht-modifizierte Peptid. Der ID50-Wert für die Verbindung des Bei spiels 1 ist nach 2 Stunden etwa 17-bis 40-mal niedriger als der ID50-Wert des nicht-modifizierten Peptids Octreotid.
Die erfindungsgemässe Verbindung lässt sich daher bei Indikationen anwenden, wo eine Hemmung der GH-Ausscheidung erwünscht ist. Zu solchen Indikationen gehören Diabetes mellitus, die Vorbeugung und Behandlung der Angiopathie und der proliferativen Retinopathie sowie die Acromegalie.
Die die GH-Ausscheidung hemmende erfindungsgemässe Verbindung hemmt auch die Pankreassekretion. Diese Hemmung lässt sich anhand von Tierversuchen feststellen, und hierzu kann beispielsweise das in Scand. J. Gastroint. 6, 423 (1975) von S.J. Konturek et al beschriebene Verfahren angewandt werden.
Die die GH-Ausscheidung hemmende erfindungsgemässe Verbindung hemmt auch die Magensäuresekretion und ergibt eine Erhöhung des pH-Werts des Magensaftes.
Diese Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindung kann beispielsweise durch den folgenden Versuch ermittelt werden:
Die die GH-Ausscheidung hemmende erfindungsgemässe Verbindung wird ausgehungerten Ratten, in deren Magen eine Fistel implantiert ist, in Dosen von etwa 0,05 mg pro kg bis etwa 5 mg pro kg mittels einer Magensonde verabreicht. Nach 1 Stunde wird die Fistel geöffnet. Der Magensaft wird in Abständen von 30 Minuten gesammelt. Die gesammelten Volumina werden aufgezeichnet und einer Bestimmung ihrer Säurekonzentration unterzogen.
Beim obigen Versuch ergibt die Verbindung des Beispiels 1 eine Erhöhung des pH-Werts auf 6 bis 8 während 3,5 Stunden. Octreotid ergibt dagegen eine Erhöhung des pH-Werts auf 6 bis 7 während nur 2 Stunden. Die Verbindung des Beispiels 1 ist in diesem Versuchssystem wenigstens 60-mal wirksamer als Cimetidin.
Die erfindungsgemässe Verbindung eignet sich daher zur Behandlung gastrointestinaler Störungen wie zur Behandlung von Magengeschwüren, gastrointestinalen Blutungen, akuter Pankreatitis und gastroenteropankreatischer Tumore (beispielsweise Vipomas, Insulinomas, Glucagonomas und dergleichen).
Die erfindungsgemässe Verbindung hemmt auch die Proliferation und/oder Keratinisierung epidermaler Zellen und eignen sich daher auch zur Behandlung dermatologischer Krankheiten, die mit einer krankhaften Proliferation und/oder Keratinisierung epidermaler Zellen zusammenhängen, und zwar insbesondere zur Behandlung von Psoriasis.
Ferner kann diese Verbindung auch zur Behandlung einer degenerativen senilen Demenz unter Einschluss der senilen Demenz des Alzheimer-Typs (SDAT) oder zur Behandlung von Cluster-Kopfschmerz, nämlich wiederholt auftretendem Kopfschmerz, angewandt werden.
Bei all diesen Indikationen soll die erfindungsgemässe Verbindung in einer Tagesdosis von etwa 2 mu g bis 20 mg verwendet werden. Gewünschtenfalls kann die Verbindung auch in unterteilten Dosen 2- bis 4-mal täglich in Einheitsdosierungsform oder auch in Retardform verabreicht werden. Solche Einheitsdosen können etwa 0,5 mu g bis 10 mg des jeweiligen Wirkstoffs enthalten.
Die erfindungsgemässe Verbindung kann nach jedem herkömmlichen Weg verabfolgt werden, beispielsweise enteral, wie oral, beispielsweise in Form von Trinklösungen, Tabletten oder Kapseln, nasal, beispielsweise in Form von flüssigen oder pulverförmigen Sprays und Salben, oder parenteral, beispielsweise in Form injizierbarer Lösungen oder Suspensionen.
Die für den jeweiligen Verabreichungsweg, wie eine nasale oder orale Verabreichung, jeweils geeignete Dosis an erfindungsgemässen Verbindungen kann durch übliche Versuche zur Ermittlung der Bioverfügbarkeit unter Verwendung der gleichen Substanz, die intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziert wird, bestimmt werden.
Zur Behandlung von Diabetes, Ulcera oder Acromegalie wird die Verbindung des Beispiels 1 zweckmässigerweise in einer Dosis von 3 bis 10 mg dreimal täglich peroral verabreicht.
Die erfindungsgemässe Verbindung kann in jeder pharmazeutisch annehmbaren Form verabfolgt werden, wie in freier Form, nämlich in Form der freien Base, oder, falls die Verbindung eine Säure ist, in freier Säureform, oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes. Die Salzform kann beispielsweise ein Säureadditionssalz oder, falls die Verbindung eine Säure ist, ein pharmazeutisch annehmbares kationisches Salz sein. Die Verbindung kann auch in Komplexform verabreicht werden. Zusätzlich oder wahlweise kann die Verbindung auch in Form eines Solvats, wie eines Hydrats, vorliegen.
Die erfindungsgemässen Verbindungen weisen in jeder dieser Formen grössenordnungsmässig die gleiche Wirksamkeit auf.
Zur Erfindung gehören auch pharmazeutische Zusammensetzungen aus einer erfindungsgemässen Verbindung in einer pharmazeutisch geeigneten Form in Verbindung mit wenigstens einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel. Solche Zusammensetzungen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden.
Eine Trinkampulle oder eine injizierbare Lösung kann pro ml beispielsweise 0,5 mg der Verbindung von Beispiel 1 in Acetatform, 11,45 mg Zitronensäure, 6,32 mg NaOH und 4,5 mg NaCI enthalten.
The present invention relates to a peptide, its production, pharmaceutical preparations which contain it and its use as a medicament.
The present invention provides a sugar derivative of a biologically active peptide which
EMI1.1
is, as well as the acid addition salts and complexes thereof.
These compounds are referred to below as compounds according to the invention.
A peptide not modified with a sugar is understood to mean the structurally corresponding peptide which has no sugar residue or no sugar residues. Such a peptide is hereinafter referred to as the unmodified peptide.
It was found that the compound according to the invention shows particularly interesting and surprising pharmacological properties, in particular a longer duration of action, which will be discussed later.
The invention also encompasses methods for producing the compound according to the invention as set out in claims 5 to 8. This compound can be prepared by methods well known for the synthesis of compounds of this type.
The connection according to the invention can be produced, for example, by
a) at least one protective group present in the compound is removed,
b) two peptide units, each of which contains at least one amino acid or an amino alcohol in protected or unprotected form and that peptide unit with at least one amino acid containing the sugar residue, are linked by amide formation, the peptide formation taking place in such a way that the desired amino acid sequence is obtained, and then step a) is optionally carried out, or
c) the corresponding, optionally protected sugar residue is introduced into the protected or unprotected octreotide and step a) is then optionally carried out,
d) converting or removing a functional group of an unprotected or protected sugar-derivatized peptide into another functional group, so that the compound results as defined above, and in the latter case step a) of the process is carried out, or
e) an octreotide derivatized with the corresponding sugar, in which the mercapto groups of Cys residues are in free form, is oxidized and thus the compound is formed in which 2 Cys residues are connected by an S-S bridge,
and the compound is isolated in free form, in the form of an acid addition salt or in complex form.
The above reactions represent processes known per se and can be carried out analogously to the following examples, it being possible for processes a) and b) to be carried out in particular by the synthesis processes according to the invention described below. If desired, protective groups which are suitable for peptides or sugars can be used for functional groups which do not participate in the reaction in these reactions. Such protective groups are also understood to mean polymer resins with functional groups.
The compound of the invention can be prepared by reacting the protected peptide containing a free amino group with the reducing disaccharide (Amadori rearrangement) in a slightly acidic medium and then removing the protective groups.
This reaction can be carried out in a manner customary for the Amadori rearrangement. The added acid can be, for example, glacial acetic acid. It is preferable to work with an excess of carbohydrate, which is, for example, 10 equivalents to 1 equivalent of the peptide compound. The reaction is carried out in a polar solvent, such as methanol, preferably at temperatures of about 60 to 70 ° C.
The starting materials and compounds of the invention can be prepared by liquid phase synthesis or solid phase synthesis.
The compounds according to the invention are easiest to prepare by solid phase synthesis.
A particularly convenient method for producing peptide alcohols has been found which contain two alcohol groups or one alcohol group and one thiol group at the C-terminal end of the peptide chain. This method is particularly suitable for the production of peptide alcohols which contain a C-terminal threoninol residue.
Solid phase peptide synthesis has proven to be a particularly fast and inexpensive method for producing peptides and is therefore a method which is generally customary today.
It is known that an amino acid is first bonded via its carboxyl group to an hydroxyl group or amino group of an insoluble synthetic resin to form an ester group or amide group, whereupon the further amino acids are bound in the desired sequence and finally the finished polypeptide is cleaved from the carrier resin.
This synthesis presents no problems for normal polypeptides with C-terminal amino acids. However, polypeptide alcohols which contain an amino alcohol instead of an amino acid at their C-terminal end do not readily bind to carrier resins which have hydroxyl groups or amino groups, and / or cannot be readily cleaved off from the carrier resin after the synthesis has ended.
The following methods have already been proposed as possible solid-phase processes for the production of peptide alcohols:
a) A conventional preparation of the corresponding polypeptide, which contains an amino acid at the C-terminal end (such as the ester of a resin containing hydroxyl groups), and a subsequent reductive cleavage using borohydrides, whereby the carboxyl group is simultaneously converted into an alcohol function (US-A 4,254,023 and US-A 4,254,024).
b) Binding of the terminal amino alcohol as ether to a hydroxymethyl resin using carbonyldiimidazole and cleavage after synthesis of the peptide using HCl / TFA or HBr / TFA (Kun-hwa Hsieh and GR Marshall, ACS National Meeting, New Orleans , March 21-25, 1977).
However, these two methods require drastic splitting conditions.
It has now been found that the cleavage of the peptide from the resin with simultaneous formation of the C-terminal peptide alcohol can be carried out under mild conditions if the C-terminal amino alcohol is bound to the resin via an acetal bond.
The peptide alcohol containing 2 alcohol groups or 1 alcohol group and 1 thiol group at the C-terminal end of the peptide chain is formed by acidic hydrolysis of an acetal from the peptide alcohol and a polymeric resin containing formylphenyl groups.
The reaction taking place can be represented as follows:
EMI5.1
The symbols mentioned have the following meanings:
EMI6.1
is the rest of an insoluble synthetic resin.
Z is a direct bond or residue that connects the resin to the (acetalized) formylphenyl group.
X stands for O or S.
R1 is hydrogen or methyl.
Y is the remainder of a peptide alcohol that can carry protective groups, for example. The optionally acetalized group CHO is in the m or p position to the rest of Z.
For the sake of simplicity, only one substitution group is indicated on the resin in the formulas Ir and IIr given in the above reaction scheme. Of course, a number of such groups are attached to one molecule of the polymeric resin. The peptide alcohol is split off from the resin by hydrolysis of the acetal group, as already indicated above, under acidic conditions, for example by means of dilute trifluoroacetic acid. This hydrolysis can be carried out at room temperature.
If Z in the formula Ir is a direct bond, then the phenyl radicals bearing acetal groups are bonded directly to the polymer radical and belong to the polymer. Examples of such compounds of the formula Ir are the acetals of a formylated polystyrene resin
EMI6.2
in the formula Ir then a polyethylene chain).
If Z is a radical, this radical contains a group which results from a reaction between a reactive group which is bonded directly or indirectly to the polymer and another reactive group which is bonded directly or indirectly to the (acetalized) formylphenyl group, results.
The radical Z can have the following formula IIIr, for example:
- (D) p-Q1-Q2- (E) q- (formula IIIr),
where the individual symbols have the following meanings:
Q1 = residue of a reactive group attached to the polymer,
Q2 = residue of a reactive group attached to the (acetalized) formylphenyl group,
D = residue that connects group Q1 to the polymer,
E = residue that connects the group Q2 with the (acetalized) formylphenyl group.
The indices p and q stand independently for 0 or 1.
The group Q1-Q2 is preferably an ester group or amide group, and in particular a carbonamide group. Q1 is preferably NH and Q2 is preferably CO.
The groups D and E are independently of one another, for example, alkylene radicals or alkyleneoxy radicals containing 1 to 5 carbon atoms.
Examples of compounds of the formula Ir in which Z is a radical of the formula IIIr are the compounds in which
EMI7.1
represents the rest of an aminomethylated polystyrene resin and the rest of the formula
EMI8.1
is a radical of formula IVr
EMI8.2
where R is hydrogen or methyl and m is 0 or 1,
the acetal group is again in the m or p position.
In such a case, Z means the group
EMI8.3
while P is polystyrene.
The remainder IVr preferably has the formula
EMI8.4
Instead of the aminomethylated polystyrene, other polymers can also be used, in particular those with free amino groups, such as polyacrylamides, which carry aminoethyl groups.
As already mentioned above, the acetalized formylphenyl group is preferably bound to the polymer by an amide bond. This ensures that the bond of the acetalized formylphenyl radical to the resin is stable during the synthesis of the polypeptide and during its cleavage from the polypeptide and that the cleavage takes place in the desired manner on the acetal bond, so that on the one hand the peptide alcohol is formed and on the other hand the formylphenyl radical stays on the Harz.
If desired, the peptide alcohol can also be bound at a further distance from the resin by incorporating so-called spacers between the reactive groups of the polymer, in particular amino groups, and the reactive groups of the acetalized formylphenyl derivative, in particular carboxyl groups. For certain reactions on the polypeptide alcohol, this is expediently done before the breakdown, such as by oxidation of cysteine residues. In this case, the radical D or E in the formula IIr additionally contains the spacer, where Q1 or Q2 is the reactive radical of the spacer.
The spacer used can be, for example, an omega-amino carboxylic acid, such as epsilon-amino caproic acid.
If an aminomethylated polystyrene, a radical of the formula IVr and epsilon-aminocaproic acid are used as spacers, the group Z then corresponds, for example, to the following formula:
EMI9.1
The compounds of formula Ir can be prepared using methods that are common in solid phase technology, starting from a compound of formula Vr
EMI10.1
where A is a protective group for the amino function and the acetal group is in position m or p to the radical Z. For this purpose, protective group A is first split off and the free amino group is then reacted with the next N-protected amino acid, etc., until all amino acids are bound to the resin in a sequence which corresponds to the desired peptide alcohol.
The amino protective groups which are selected for the amino acids used or the amino alcohol must be such that they can be split off under non-acidic conditions, since the acetal groups undergo hydrolysis under acidic conditions. The groups CF3CO or FMOC (9-fluorenylmethyloxycarbonyl), for example, can be used as such protective groups. These protective groups can be split off in a basic medium using methods customary in peptide chemistry.
It is also possible for only the protective groups in the side chains and the amino protective group of the amino acid used last to be acid-labile and then to be split off from the resin at the same time as the peptide alcohol is formed.
The BOC group is preferred as the protective group.
KOH or piperidine or NaBH4 are preferably used as bases.
The construction of the peptide chain can be carried out in a conventional manner starting from a peptide residue with free amino groups and an amino acid with free or activated carboxyl groups.
The reaction can be carried out with the addition of, for example, hydroxybenzotriazole and dicyclohexylcarbodiimide.
The compounds of formula Vr can be prepared, for example, by
a) a resin of the formula IIr bearing an aldehyde group
EMI11.1
in which the group CHO is in position m or p to the substituent Z,
with an N-protected amino alcohol of the formula
HX-CHR1-CH (NHA) -CH2OH,
which may be in activated form, is implemented or
b) a resin of the formula
EMI11.2
with a compound of formula VIr
EMI12.1
wherein the acetal group is in position m or p to the group Q min 1 - (E) q and the residues Q min 1 and Q min 2 are two reactive groups which react with one another to form a bridge Q1-Q2.
The acetalization according to process a) can be carried out in the presence of an acid as a catalyst. Suitable acids include p-toluenesulfonic acid and p-trifluoromethylsulfonic acid.
If desired, a trimethylsilyl group can be used as a protecting group for a free alcohol.
The esterification according to process b) can be carried out under very mild conditions, such as by reacting a carboxylic acid derivative with a polymer which carries an OH or NH 2 group.
The compounds of the formula VIr can be prepared by acetylating a compound of the formula
EMI12.2
with a compound of the formula
HX-CHR1-CH (NHA) -CH2OH
getting produced.
This acetylation can be carried out as described above in process a).
During the build-up and the cleavage of the peptide alcohol from the resin, further reactions can be accomplished, for example a removal of protective groups such as S-protective groups, or an oxidation of cysteine residues.
Such reactions can also be carried out in the liquid phase after the peptide alcohol has been split off.
Using this synthesis, it is easy to prepare pharmacologically active and other peptides which contain two alcohol groups or one alcohol group and one thiol group at the C-terminal end.
In the following examples, all temperatures are given in degrees Celsius and the [alpha] 20_D values have not been corrected. The following abbreviations are used:
AcOH = acetic acid
BOC = tert-butyloxycarbonyl
But = tert-butyl
DCCI = dicyclohexylcarbodiimide
DMF = dimethylformamide
Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl
MeOH = methanol
NEt3 = triethylamine
Thr-ol = threoninol residue = CH3-CHOH-CH (CH2OH) -NH-
TFA = trifluoroacetic acid
HOBT = N-hydroxybenzotriazole
The peptide obtained is polyacetate polyhydrate with a peptide content of 70 to 90%.
HPLC analysis shows that the peptides contain less than 5% of other peptides.
The factor F given in the following examples shows the peptide content in the products obtained, where F = 1 corresponds to a peptide content of 100%. The difference up to 110% [(1-F) x 100] consists of acetic acid and water.
Example 1:
EMI15.1
EMI15.2
a)
EMI 15.3
To a solution of 10 g
EMI 15.4
Acetate in 100 ml DMF 2.25 g di-tert-butyl percarbonate, dissolved in 30 ml DMF, are slowly added dropwise at room temperature. After two hours at room temperature, the solvent is stripped off in vacuo and 200 ml of diisopropyl ether are added to the residue. The precipitate that forms is filtered off, washed with diisopropyl ether and dried. To purify the crude product, this is chromatographed on silica gel (mobile phase: CH2Cl2 / MeOH 9/1) and then isolated as a white amorphous powder.
[alpha 20_D] 29.8 ° (c = 1.28 in DMF)
b)
EMI15.5
D - (+) - maltose and 0.5 g of the end product of stage a) are dissolved in 20 ml MeOH / HOAc 9/1 (v / v) and kept at 60-70 ° C. for three hours. After evaporation, the mixture is taken up in a little methanol and the title compound is precipitated with diisopropyl ether. For purification, it is chromatographed on silica gel (mobile phase CH2Cl2 / MeOH 9/1).
400 mg
EMI16.1
are mixed with 3 ml of trifluoroacetic acid (100%) and kept at room temperature until all of the starting material has dissolved (5 minutes). The title compound is precipitated by adding 20 ml of diisopropyl ether and then filtered off and washed with diisopropyl ether. The title compound is purified by silica gel chromatography (eluent: CHCl3 / MeOH / HOAc / H2O 7/3 / 0.5 / 0.5) and isolated as a lyophilisate.
[alpha] 20_D = -7.9 ° (c = 0.71 in 95% AcOH) F: 0.91
Example 2: Preparation of octreotide
EMI17.1
1) Preparation of anchor acetal (N-CF3CO-threoninol acetal of p-formylphenoxy-acetic acid)
105 g (1.0 mol) of L-threoninol are placed in 200 ml of methanol with a nitrogen purge. A solution of 200 ml of methyl trifluoroacetate in 250 ml of methanol is added dropwise to the clear solution obtained at 0 ° C. The internal temperature is kept at about 10 ° C. using an ice bath. After 1.5 hours, threoninol is no longer detectable in the reaction solution. Evaporation at 40 ° C. gives a white crystalline residue. This is dissolved in 200 ml of ethyl acetate at 70 ° C. and precipitated with 100 ml of hexane. Then it is cooled to 0 ° C., washed with hexane and dried at room temperature. The N-trifluoroacetyl-threoninol is obtained.
50.3 g (0.25 mol) of the product obtained are dissolved in 1.25 liters of tetrahydrofuran and 75 ml of trimethylchlorosilane are added dropwise. A mixture of 70 ml of triethylamine and 250 ml of tetrahydrofuran is then added immediately. A white suspension is formed which is stirred for 4 hours at room temperature. The mixture is then filtered and the filtrate is evaporated at 40 ° C. to form a oil.
The \ l is dissolved in 1.5 liters of methylene chloride and 90.4 g of p-formylphenoxyacetic acid are added in portions at room temperature. A total of 9 ml of trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate are then added in portions. The mixture is stirred at room temperature for 24 hours, then filtered and the residue is washed well with methylene chloride.
The filtrate is evaporated at 40 ° C. and gives an orange-red resin-like product as residue. This product is chromatographed on silica gel. The elution is carried out with ethyl acetate. Evaporation of the desired fractions gives the compound mentioned above with a purity of 97% (high performance liquid chromatography).
2) Structure of the protected octapeptide
17.2 g of aminomethylated polystyrene (Brand Dow 0.7% by weight N, which corresponds to 0.50 mmol of aminomethyl groups per g of resin) are suspended in 80 ml of 4: 1 methylene chloride / dimethylformamide. 4.17 g of the end product of stage 1), 1.6 g of hydroxybenzotriazole (HOBT) and 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) are added successively. After 2 hours of stirring at room temperature, the Kaisertest is negative. The mixture is filtered and washed. The washed resin is suspended in 100 ml of tetrahydrofuran / methanol 3: 1 and 10.4 g of sodium borohydride are added in portions. The mixture is stirred at room temperature for 6 hours, filtered and washed. The resin is resuspended in methylene chloride / dimethylformamide (4: 1) and 5.57 g FMOC-Cys (S-t-Bu) OH, 1.74 g hydroxybenzotriazole (HOBT) and 3.6 g dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) are added.
The FMOC protective group is then cleaved off with piperidine (2 × 20 minutes contact time).
Analogously, the N-FMOC-protected amino acids Thr-OH, Lys (BOC) -OH, D-Trp-OH, Phe-OH, Cys (St-Bu) OH and D-Phe-OH are gradually using HOBT / DCCI coupled, whereby the FMOC-protected octapeptide resin is obtained. The final loading is 0.26 mmol / g.
3) Oxidation and cleavage
The resin obtained is suspended in 100 ml of trifluoroethanol / methylene chloride 1: 1 and mixed with 50 ml of tributylphosphine. Stir 70 hours at room temperature. Then it is filtered, washed and mixed with 100 ml of a 1: 1 mixture of tetrahydrofuran and a normal amine acetate solution. 1.1 ml of 30% aqueous hydrogen peroxide are added. The mixture is stirred at room temperature for 24 hours. The resin is then washed and mixed with a mixture of 20 ml trifluoroacetic acid, 80 ml methylene chloride, 10 ml water and 2 ml thioanisole. The mixture is stirred for 2 hours and filtered, and then washed with trifluoroacetic acid and methylene chloride. 200 ml of 15 diethyl ether are added to the filtrate. The precipitate is filtered off. The residue is dissolved in an aqueous buffer and then desalted, for example using Duolit.
Subsequent freeze-drying of the acetate gives the title compound as the acetic acid salt.
Example 3:
Preparation of N <alpha> - [alpha-glucosyl (1-4) deoxyfructosyl] -SMS (see example 1)
According to Example 2 above, 393 g of the octapeptide bound to the resin are prepared. The cysteine protecting groups are removed reductively. The peptide bond to the resin is oxidized to the cyclic octapeptide by means of hydrogen peroxide in a mixture of tetrahydrofuran and water.
After washing in tetrahydrofuran and then in DMF, the peptide resin is shaken in 3600 ml of a mixture of DMF and AcOH (8: 1). The suspension is treated with 526 g of D (+) maltose monohydrate. The mixture was warmed to 60 ° C. and stirred at this temperature for 18 hours.
The mixture is cooled, the peptide-resin is filtered off and washed in turn with DMF and methanol. It is then washed with methylene chloride. The peptide is then cleaved from the resin by treating the whole with a mixture of 2900 ml of methylene chloride and 716 ml of trifluoroacetic acid and a trace of water.
The filtrate is mixed with 597 g of sodium carbonate in portions, followed by stirring for a further 30 minutes and then filtering. The residue is washed with methylene chloride and methanol.
The filtrate is evaporated to dryness, followed by desalting using a column filled with a non-functional polystyrene such as Duolit or using a reverse phase material suitable for high performance liquid chromatography, such as siliconized silica gel, the long chain fatty alcohol groups contains (e.g. Labomatic, Switzerland, Brand HB-SIL-18-20-100). This leads to the pure title connection.
The compounds according to the invention are pharmacologically active and are therefore suitable as therapeutic agents.
The effectiveness of the compounds according to the invention can be determined on the basis of customary pharmaceutical and biopharmaceutical tests. The compounds are generally at least as potent as the unmodified peptide, namely the corresponding sugar-free peptide, after administration by injection or oral administration. They are generally better absorbed, more easily soluble in water and have a longer duration of action.
The compound according to the invention can therefore be used for the same indications as the unmodified peptide.
The compound according to the invention can be compared with the unmodified peptide in customary bioavailability tests.
For example, the compound according to the invention can be found in the blood plasma for a long time after its administration than the unmodified peptide, as can be shown on the basis of conventional tests for determining the bioavailability.
The compound according to the invention and the unmodified peptide can, for example, be administered to dogs by oral or intravenous administration in a single dose sufficient to produce a therapeutic effect.
The compounds are used in doses that allow detection of the peptide or a metabolite thereof in the blood. The detection can be carried out in a conventional manner, for example by means of a radioimmunoassay.
In the experiment mentioned above, it has been shown, for example, that the compound of Example 1, after oral administration, gives a blood concentration ten times higher than that of octreotide.
The absolute block availability of the compound of Example 1 when administered orally and intravenously, measured based on the AUC value (area under the curve), is five times higher than that of the octreotide. The elimination half-life after intravenous administration is approximately 2.3 hours compared to approximately 0.5 hours for the octreotide.
In addition, the compound according to the invention has the advantage that it is excreted to a greater extent by the kidneys. This can be observed using common tests.
Starved male rats (225 to 375 g) are administered orally water (50 ml per kg. After 30 minutes, the animals are anesthetized, for example, with inactin (100 mg per kg ip). The bile duct and bladder are cannulated. Both jugular veins are exposed. For stimulation In one diuresis, an infusion of 5% glucose and 1% ethanol (5 ml per hour) is given in one vein and the other vein is used to take blood samples (0.5 ml) every hour for 4 hours.
The compound according to the invention and the unmodified peptide are administered subcutaneously in a dose of about 10 to about 1000 μg per kg. The concentration of the respective compound is determined in the usual way, for example by radioimmunoassay.
Examination of the compound of Example 1 and octreotide in a dose of 10 μg per kg according to the above test leads to the following results:
<tb> <TABLE> Columns = 3
<tb> Head Col 02 to 03 AL = L: percentage excretion via
<tb> SubHead Col 02 AL = L> Bile:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> urine:
<tb> <SEP> Connection of example 1 <SEP> 1.6 <SEP> 36
<tb> <SEP> octreotide <SEP> 22 <SEP> 19
<tb> </TABLE>
Octreotide is excreted in both the bile and the urine, while the compound of Example 1 is excreted predominantly in the urine.
The improved absorption of the compound according to the invention after oral administration can be determined as follows:
The compound according to the invention and the unmodified analog are administered orally to OFA rats (for example in a dose of 10 mg per kg). Blood samples are collected after a certain period of time, for example after 15, 30 and 60 minutes. These are then analyzed for their active substance content, which can be done, for example, by radioimmunoassay.
The compound according to the invention lowers the GH excretion in the blood and can be tested as follows:
Starved rhesus monkeys (at least 5 monkeys) in primate armchairs receive the compounds according to the invention in a piece of banana as a carrier. The compound is administered in a dose of about 0.1 mg per kg to about 10 mg per kg p.o. administered. Blood is drawn from the saphenous vein via a catheter. The GH concentration in the blood is measured by RIA (radioimmunoassay).
In this test with rhesus monkeys, for example, it follows that the compound of Example 1 in a dose of 0.1 mg per kg lowers the GH excretion by at least 50% for more than 10 hours, whereas the unchanged peptide octreotide in comparison only a 5 Hours of humiliation.
Another test is carried out as follows:
One hour after administration of the compound according to the invention, male rats are withdrawn in several logarithmically graduated doses after decapitation. The GH level in the serum is determined by RIA. In this experiment, the compound according to the invention is effective subcutaneously in doses of approximately 0.02 to approximately 30 μg per kg.
This test, for example, has shown that the compound of Example 1 has an ID50 value of 0.190 μg per kg s.c. compared to the same test for natural somatostatin, which has an ID50 value of 93 mu g per kg s.c. (the ID50 value indicates the amount of compound required to reduce the GH content by 50% compared to the untreated control animals.
In contrast to natural somatostatin, the compound according to the invention gives long-term (for example 6 hours) inhibition of GH excretion in this test and is therefore extremely effective in this regard.
The GH-lowering activity of this compound can also be observed after oral administration to male rats containing stradiol implants. In this experiment, there are relatively minor changes in the GH level. The experiment is carried out as follows:
Male rats weighing approx. 300 g are implanted under the back skin under ether anesthesia (50 mm length, 3 mm diameter) with 50 mg stradiol. At different times (1 to 6 months later) the animals are used repeatedly for experiments. The test substance is administered either subcutaneously or orally.
Immediately before and at various times after the substance is administered, about 0.8 ml of blood is taken from the retroorbital plexus from the animals. The blood is centrifuged and the GH level in the serum is determined by RIA.
This experiment shows that the compound according to the invention is even more effective after oral administration than the corresponding unmodified peptide even after several hours. After 2 hours, the ID50 value for the compound of example 1 is approximately 17 to 40 times lower than the ID50 value of the unmodified peptide octreotide.
The compound according to the invention can therefore be used in indications where inhibition of GH excretion is desired. Such indications include diabetes mellitus, the prevention and treatment of angiopathy and proliferative retinopathy, and acromegaly.
The compound according to the invention which inhibits GH excretion also inhibits pancreatic secretion. This inhibition can be determined from animal experiments, and this can be done, for example, in Scand. J. Gastroint. 6, 423 (1975) by S.J. Konturek et al described methods are used.
The compound according to the invention which inhibits GH excretion also inhibits gastric acid secretion and results in an increase in the pH of the gastric juice.
This effectiveness of the compound according to the invention can be determined, for example, by the following experiment:
The compound according to the invention which inhibits GH excretion is administered to starved rats, in the stomach of which a fistula is implanted, in doses of about 0.05 mg per kg to about 5 mg per kg by means of a gastric tube. The fistula is opened after 1 hour. The gastric juice is collected every 30 minutes. The volumes collected are recorded and subjected to a determination of their acid concentration.
In the above experiment, the compound of Example 1 gives an increase in pH to 6-8 over 3.5 hours. Octreotide, on the other hand, results in an increase in pH to 6 to 7 in just 2 hours. The compound of Example 1 is at least 60 times more effective than cimetidine in this test system.
The compound according to the invention is therefore suitable for the treatment of gastrointestinal disorders such as for the treatment of gastric ulcers, gastrointestinal bleeding, acute pancreatitis and gastroenteropancreatic tumors (for example vipomas, insulinomas, glucagonomas and the like).
The compound according to the invention also inhibits the proliferation and / or keratinization of epidermal cells and is therefore also suitable for the treatment of dermatological diseases which are associated with pathological proliferation and / or keratinization of epidermal cells, in particular for the treatment of psoriasis.
Furthermore, this compound can also be used for the treatment of degenerative senile dementia including Alzheimer's type senile dementia (SDAT) or for the treatment of cluster headache, namely recurrent headache.
For all these indications, the compound according to the invention should be used in a daily dose of approximately 2 μg to 20 mg. If desired, the compound can also be administered in divided doses 2 to 4 times a day in unit dosage form or also in sustained release form. Such unit doses can contain about 0.5 μg to 10 mg of the respective active ingredient.
The compound according to the invention can be administered by any conventional route, for example enterally, such as orally, for example in the form of drinking solutions, tablets or capsules, nasally, for example in the form of liquid or powder sprays and ointments, or parenterally, for example in the form of injectable solutions or suspensions .
The dose of compounds according to the invention which is suitable in each case for the respective route of administration, such as nasal or oral administration, can be determined by conventional experiments to determine the bioavailability using the same substance which is injected intravenously, intramuscularly or subcutaneously.
For the treatment of diabetes, ulcers or acromegaly, the compound of Example 1 is expediently administered orally in a dose of 3 to 10 mg three times a day.
The compound of the invention can be administered in any pharmaceutically acceptable form, such as in the free form, namely in the form of the free base, or, if the compound is an acid, in the free acid form, or in the form of a pharmaceutically acceptable salt. The salt form can be, for example, an acid addition salt or, if the compound is an acid, a pharmaceutically acceptable cationic salt. The compound can also be administered in complex form. Additionally or optionally, the compound can also be in the form of a solvate, such as a hydrate.
The compounds according to the invention have the same activity in terms of magnitude in each of these forms.
The invention also includes pharmaceutical compositions of a compound according to the invention in a pharmaceutically suitable form in conjunction with at least one pharmaceutical carrier or diluent. Such compositions can be prepared in a manner known per se.
A drinking ampoule or an injectable solution can contain, for example, 0.5 mg of the compound of Example 1 in acetate form, 11.45 mg of citric acid, 6.32 mg of NaOH and 4.5 mg of NaCl per ml.