CH675254A5 - - Google Patents

Description

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CH 675 254 A5

Description

La présente invention concerne un procédé pour rechercher la présence de catalase dans un échantillon de lait. De façon plus particulière, la présente invention procure un procédé extrêmement sensible et un nécessaire d'analyse pour la détection rapide de catalase dans un échantillon de lait en provenance de vaches atteintes de mammite.

Comme on le sait, la mammite bovine est, de loin, la maladie la plus importante des vaches laitières, compte tenu de sa fréquence et de son importance économique.

Le Brevet Israélien 36496 publié en Juin 1974 décrit et revendique une méthode pour rechercher la présence de cellules organiques dans un liquide, cette méthode consistant à briser ces cellules dans un échantillon du liquide par l'action combinée d'une protéase et d'un détergent compatible avec cette pro-téase, ce qui libère l'acide désoxyribonucléique (ADN) non dégradé et des enzymes actives, et à rechercher ensuite dans cet échantillon la présence de l'ADN et/ou d'une enzyme libérée.

Dans des réalisations préférées de ce brevet, le liquide est le lait, les cellules sont des cellules soma-tiques, et l'enzyme libérée recherchée est la catalase.

La recherche dans ce brevet est basée sur le principe connu que le lait en provenance de pis atteints de mammite contient des leucocytes en grand nombre, excédant 105 cellules/ml. La rupture des leucocytes libère l'ADN et des enzymes intra-cellulaires, par exemple la catalase, qui ne sont normalement pas détectables dans un lait sain. Si la rupture des leucocytes est effectuée par l'action combinée d'une protéase et d'un détergent compatible avec celle-ci, l'ADN n'est pas dégradé et les enzymes libérées sont activées pendant la période de l'essai. L'ADN libéré peut, en conséquence, être aisément détecté par l'accroissement de la viscosité de l'échantillon de lait. En variante et, en outre, on peut détecter les enzymes libérées par un système de tests approprié. Un test particulièrement approprié est la formation de bulles par réaction de l'enzyme libérée avec le peroxyde d'hydrogène.

La combinaison d'une protéase (par exemple subtilisine) et d'un détergent compatible avec elle constitue une préparation de rupture stable et efficace, qui provoque la libération rapide de macromolécules intactes et ne dégrade pas l'ADN.

Le principe de base du présent test est similaire à celui décrit dans ce brevet. Dans ce test, la recherche de l'activité de catalase suit le traitement de l'échantillon avec une préparation de rupture de cellules. Le traitement vise à éliminer les barrières d'accessibilité éventuelles entre la catalase présente à l'intérieur des cellules et son substrat. La présence de ces barrières ralentit la réaction catalytique et gêne ainsi la détection de la catalase. La rupture des cellules est ainsi prévue pour rendre instantanément détectable la teneur totale en catalase de l'échantillon.

Tel que décrit et expliqué dans ce brevet, bien que la rupture des cellules somatiques puisse être effectuée par plusieurs procédures bien connues, aucune de celles-ci n'est acceptable pour le but que l'on se propose actuellement. Les méthodes connues exigent habituellement de la main-d'œuvre et du temps, ou autrement elles ne sont pas efficaces. Les méthodes de rupture les plus fiables dépendent de l'utilisation d'un équipement coûteux (par exemple désintégrateur mécanique, sonique ou ultrasonique).

En utilisant la méthode de la présente invention, on élimine complètement la nécessité de l'incubation et, de ce fait, les difficultés impliquées par elle. Tel que décrit ci-après, le test est simple, rapide et direct. Il n'exige ni préparation, ni habileté particulière, ni équipement et peut être effectué à la ferme et même sous forme de test qu'on peut effectuer à côté de la vache.

L'addition de la protéase et du détergent à un échantillon de lait provoque la libération maximale des enzymes intracellulaires présentes dans cet échantillon, en trois minutes à la température ambiante.

L'agent de rupture à base de protéase et de détergent agit rapidement dans les conditions physiologiques de pH et de température et ne gêne pas la détection de la catalase libérée par le traitement.

Des études initiales résumées dans ce brevet ont confirmé que la rupture accroît la sensibilité de la détection de la catalase à un point tel qu'on peut l'utiliser pour le dépistage rapide de la mammite. Dans des tests ultérieurs sur le terrain, il apparut toutefois que la réalisation préférée, à savoir des tampons d'ouate imprégnés, indiqués à titre d'exemple dans ce brevet (exemple 2), ne donne pas de résultats homogènes.

Dans le test décrit dans ce brevet (exemple 2), des réactions positives furent enregistrées pour des échantillons de lait contenant 0,8-3,4 x 105 cellules/ml, tandis qu'une réaction négative fut enregistrée pour un échantillon de lait ne contenant pas de leucocytes. Dans des tests ultérieurs sur le terrain, on trouva toutefois que la plupart des échantillons rencontrés contenaient quelques cellules somatiques et qu'en conséquence, ils ne donnaient pas de réaction négative même si il n'y avait pas de mammite. La valeur diagnostique de ce test doit donc dépendre d'une distinction bien nette entre un niveau significatif et un niveau non significatif d'activité de catalase. Tel qu'il est décrit dans le document précédent, le test ne procure pas cette distinction. En outre, après une étude soigneuse et détaillée de ce brevet, il apparut qu'il n'y avait aucune indication dans ce document aidant à exposer les bases du problème ou suggérant une solution. En conséquence, ce procédé et ce brevet furent abandonnés.

C'est seulement dix ans plus tard que cette méthode fut à nouveau considérée; toutefois, du fait que le brevet ne fournissait aucune indication quant à une solution évidente du problème, ce qui avait conduit à son abandon initial, d'autres recherches furent nécessaires et furent dirigées sur la mise au point

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d'une méthode modifiée et d'une trousse de tests qui donneraient des résultats non ambigus. Les buts spécifiques de la recherche ultérieure furent:

a) augmentation de la sensibilité, de façon à assurer une réponse claire des échantillons positifs;

b) élimination de la formation de mousse caractérisant les échantillons positifs, de façon à éviter des réponses fausses dans les échantillons négatifs.

On a passé en revue une grande série de combinaisons potentiellement utiles de protéases et de détergents compatibles. Cette série comportait à la fois des préparations du commerce toutes prêtes et des combinaisons expérimentales de préparations d'enzymes de qualité technique et de détergents. Il est apparu que les spécifications pour l'obtention d'une préparation efficace de rupture de cellules imposaient de sévères limitations au choix des réactifs. Des préparations de laboratoire étaient invariablement moins bonnes que les préparations du commerce, principalement pour des raisons d'incompatibilité entre l'enzyme et le détergent.

A la suite de cette recherche extensive, on a trouvé, et c'est le but de la présente invention, un procédé pour rechercher la présence de la catalase dans un échantillon de lait, consistant à combiner cet échantillon de lait avec un détergent enrichi en une protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase pour briser les cellules bactériennes et somatiques contenant de la catalase présentes dans l'échantillon et pour en libérer la catalase active en présence d'un sel tampon de pH ayant une concentration d'au moins 20 mM dans la solution de l'échantillon résultante, à amener cette solution à un pH compris entre environ 7,0 et 8,0, et à rechercher ensuite dans cet échantillon la présence de catalase.

Dans les réalisations préférées de la présente invention, la catalase est détectée par addition de H2O2, d'où il résulte que l'oxygène créant de la mousse est libéré dans la solution; le procédé est, de préférence, mise en œuvre en ajoutant d'autres solutés à la solution, en plus du tampon, d'où il résulte que le tampon et le soluté additionnel diminuent la solubilité de l'oxygène libéré dans la solution, augmentant ainsi la génération de mousse.

De préférence, ce tampon est une solution d'un tampon phosphaté ayant un pH de 7,0-8,0 et il est amené à une concentration comprise entre 20 et 50 mM, suffisante pour diminuer la solubilité de l'oxygène dans le lait.

Par ailleurs, la présente invention procure également un nécessaire d'analyse détecter la présence de catalase dans du lait, comprenant un détergent enrichi en protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase, et 20 à 400 micromoles d'un tampon de pH, seul ou en combinaison avec tout autre soluté capable de réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait, pour amener la solution de lait résultante à un pH compris entre environ 7,0 et 8,0.

Le brevet US 3 926 732 décrit une méthode pour analyser un lait, consistant à ajouter de la galactose oxydase et un pigment leuco pour indiquer une mammite. Le brevet US 3 764 479 décrit un disque en papier filtre contenant de l'acétylcholine, du bicarbonate de sodium et un tampon à base de carbonate de sodium. Le disque comporte en outre une catalase et du peroxyde d'hydrogène. En outre, le brevet US 4 065 357 décrit l'utilisation de peroxyde d'hydrogène dans une méthode pour détecter la catalase.

Toutefois, aucun de ces brevets n'enseigne ni ne suggère le procédé et le nécessaire de la présente invention pour la détection rapide de catalase dans un échantillon de lait provenant de pis atteints de mammite.

Comme solutés additionnels, on peut utiliser plusieurs sels inorganiques extrêmement solubles (par exemple sulfate d'ammonium, chlorures de sodium, de potassium ou de magnésium, etc.), ainsi que des composés organiques solubles (par exemple urée, sucrose, etc) ou des tampons, à des concentrations suffisamment élevées pour expulser l'oxygène dissous à la place ou en plus de ces tampons.

On a ainsi découvert que, contrairement aux enseignements de ce brevet, il ne suffit pas d'utiliser l'activité de rupture des cellules d'une protéase et d'un détergent compatible avec cette protéase et que même la poudre à laver enrichie en enzyme préférée, vendue sous la marque commerciale BIOOR® par Shemen Ltd, Haîfa Israël, prise à titre d'exemple dans ce brevet, ne donne pas, en fait, de résultats satisfaisants.

En fait, on doit sélectionner et utiliser un détergent enrichi en protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase, et seule la poudre à laver enrichie en enzyme vendue sous la marque BIOMAT® par Witco Chemical Ltd, p.o. 975, Haîfa Israël, a, jusqu'ici, satisfait ce critère.

On a en outre découvert qu'un phosphate 0,01 M, comme indiqué dans les exemples de ce brevet, ne convient pas pour réduire la solubilité de l'oxygène dans l'échantillon. En outre, du fait qu'on ajoute au moins le double et de préférence jusqu'au quintuple, de ce tampon, seul ou en combinaison avec tout autre soluté capable de réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait, la sensibilité du test est accrue, davantage du fait que tout l'oxygène dégagé par la réaction de la catalase entre dans le processus de génération de mousse.

On a en outre trouvé que l'utilisation de tampons imprégnés empêchait l'utilisation d'un point de coupure visuel bien défini, permettant une distinction non ambiguë entre des échantillons de lait sain et des échantillons de lait suspect, dérivés de cas «sous-cliniques» de mammites. Dans le présent test, les réactifs sont distribués sous une forme soluble ou dissoute. Ainsi, aucun élément solide n'est introduit

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dans l'échantillon de lait et, de ce fait, il n'y a rien qui puisse interférer avec l'enregistrement visuel direct des résultats.

Bien que l'invention va maintenant être décrite en liaison avec certaines réalisations préférées dans les exemples suivants, de façon que ses aspects puissent être plus complètement appréciés, il est entendu que l'invention n'est pas limitée à ces réalisations particulières. Au contraire, elle couvre d'autres variantes, modifications et équivalents pour autant qu'ils puissent être à l'intérieur de la portée de l'invention définie par les revendications jointes. Ainsi, les exemples suivants, qui se rapportent à des réalisations préférées, servent à illustrer la mise en œuvre de l'invention, étant bien entendu que les cas particuliers représentés ne le sont qu'à titre d'exemple et à des fins d'illustration des réalisations préférées de la présente invention et qu'ils sont présentés pour procurer ce qu'on pense être la description la plus utile et la plus aisément compréhensible des procédures de formulation, ainsi que des principes et aspects conceptuels de l'invention.

EXEMPLE 1

DETECTION DE MAMMITES MATERIAUX

Tubes à essai: polystyrène, 7x11 mm, Nunc 3-40339

Peroxyde d'hvdroaène (30%) en provenance de BDH Chemical Ltd

Amido Black (Bleu noir d'Aniline) en provenance d'Analco, Bethesda, Md

Poudre BM (BIOMAT)* vendue par WITCO Chemical Ltd, POB 975, Haîfa 31009

* (Poudre de lavage enrichie aux enzymes. L'enzyme est une protéase alcaline produite par une souche Carlsberg de Bacillus subtilis et vendue sous le nom d'Alcalase ou de Subtilisine).

REACTIFS

BMP: la poudre BM est broyée avec un poids égal de K2HPO4 et est stockée à température ambiante sous forme d'un mélange de poudre (BMP).

Solvant: (mélangé journellement)

Tampon phosphaté 1 M, pH 7,3-5,0 ml Amido Black, 2 mg/ml -2,0 ml Peroxyde d'hydrogène, 30% -1,5 ml Eau distillée -1,5 ml

Réactif: (préparé journellement) 1,0 g de BMP, dissous dans 10 ml du mélange solvant précité. PROCEDURE

1. Placer 1,0 ml de lait dans un tube à essais et ajouter 0,1 ml de réactif.

2. Mélanger le contenu en tapotant le fond du tube, et placer dans un râtelier pendant trois minutes.

3. Enregistrer les résultats comme suit:

Anneau de mousse: négatif

Hauteur de mousse: positif (la hauteur est proportionnelle à la quantité de catalase dans l'échantillon). COMMENTAIRES

La détermination visuelle de la réaction positive est facilitée par:

1. Le détergent qui participe à la rupture des cellules, et convient également pour procurer une couche de mousse qui se forme lorsque l'oxygène est libéré du peroxyde d'hydrogène par l'action de la catalase: et

2. Le pigment (Amido Black) qui procure un fond noir contre lequel la mousse (réaction positive) est clairement visible.

La formule ci-dessus satisfait donc les exigences pour une recherche rapide et fiable de la catalase dans le lait. En outre, l'addition de phosphates à la fois solide et dissous a un double but. Ils agissent comme tampons, de sorte que tous les échantillons de lait sont examinés au pH optimal. Le sel dissous sert également à réduire la solubilité de l'oxygène dégagé par la réaction de la catalase et à augmenter ainsi la sensibilité du test.

Le test fut évalué avec des échantillons de lait recueilli à la ferme Netiv Halamed Heh, le 11 novembre 1986. Les échantillons furent testés dans les quatre heures et testés à nouveau après un stockage d'une nuit à 4°. Les résultats furent identiques dans les deux tests. L'évaluation suivante est basée sur la comparaison des résultats avec le présent nécessaire (BMP) et ceux obtenus en parallèle avec le Ca-lifomian Mastitis Test standard (CMT) qui a servi de système de référence.

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Tableau 1

Nombre total

93

%

Positifs vrais

23

Sensibilité

88,5

Positifs faux

13

Spécificité

80,6

Négatifs vrais

54

Valeur positive prévue

63,9

Négatifs faux

3

Valeur négative prévue

94,7

EXEMPLE 2

DETECTION DE MAMMITES Tous les détails sont identiques à ceux de l'exemple 1, sauf en ce qui suit:

1. Le solvant fut préparé le 16 décembre 1986 et stocké dans une bouteille noire à la température ambiante. Cette préparation fut ultérieurement utilisée pour tous les tests énumérés ci-après.

2. Les échantillons de lait furent recueillis comme précédemment différents jours (voir tableau 2 ci-après) et évalués exactement comme dans l'exemple 1.

Tableau 2

Série I

Série II

Série III

(23 décembre 1986)

(28 décembre 1986)

(5 janvier 1987)

Nombre total

110

56

106

Positifs vrais

10

3

34

Positifs faux

19

2

12

Négatifs vrais

80

50

58

Négatifs faux

1

1

2

Sensibilité

90,1%

75,0%

94,4%

Spécificité

80,0%

96,2%

82,9%

Valeur positive prévue

34,5%

60,0%

73,9%

Valeur négative prévue

98,8%

98,0%

96,7%

EXEMPLE 3

COMPARAISON DES NECESSAIRES DE LA PRESENTE INVENTION (BMP^ ET STANDARD fCMT) Tous les détails sont identiques à ceux de l'exemple 2, sauf en ce qui suit:

1. Les échantillons recueillis, le 5 janvier 1987, et stockés à 4° pendant 24 heures furent rassemblés, de telle sorte que chaque échantillon rassemblé contenait des volumes égaux de 4 échantillons individuels des 4 trayons d'un pis individuel. Ainsi, chaque échantillon rassemblé maintenant testé représente le lait produit par chaque vache (au lieu d'être celui de chaque trayon).

2. Chaque échantillon rassemblé fut testé par le CMT et par la méthode du présent brevet (BMP). Les résultats sont résumés sur le tableau 3.

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Tableau 3

Echantillons rassemblés

CMT

BMP

(positif*: total)

Positif

Négatif

Positif"

Négatif

0/4

0

g

0

9

1/4

2

6

8 [3-4]

0

2/4

4

0

4 [5-7]

0

3/4

6

0

6 [>71

0

* Nombre de trayons infectés comme déterminé par le test CMT avant rassemblement.

** Les figures entre-parenthèses donnent la hauteur (en mm) de la colonne de mousse.

Le procédé, et le nécessaire d'analyse de la présente invention ont ainsi les avantages suivants:

1. La combinaison tamponnée d'enzymes et de détergent utilisés ici ne détruit pas l'activité de la catalase;

2. Elle est pratiquement dépourvue de catalase;

3. Les solutés assurent un tamponnage correct et le dégagement de l'oxygène, produit de la réaction de la catalase, de la solution; et

4. La mousse formée est stable pendant 1 à 2 heures ou davantage, empêchant ainsi le dégagement de l'oxygène dans l'air.

Il est évident à l'homme de l'art que l'invention n'est pas limitée aux détails des exemples précédents, et que la présente invention peut être mise en œuvre sous d'autres formes spécifiques sans s'écarter de ses concepts essentiels; il est en conséquence souhaité que les présentes réalisations et exemples soient considérés, à tous égards, comme donnés à titre d'illustration et non à titre de limitation.

Claims (8)

Revendications

1. Procédé pour rechercher la présence de catalase dans un échantillon de lait, caractérisé en ce qu'on combine cet échantillon de lait avec un détergent enrichi par une protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase pour briser les cellules somatiques contenant la catalase qui se trouvent dans cet échantillon et pour en libérer la catalase active, en présence d'un sel tampon de pH ayant une concentration d'au moins 20 mM dans la solution de l'échantillon obtenue, en ce qu'on amène cette solution à un pH compris entre 7,0-8,0 et en ce qu'on recherche, après, la présence de catalase dans cet échantillon.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la catalase est détectée par l'addition de H2O2.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' on ajoute un autre soluté à la solution, en plus du tampon.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tampon est une solution de phosphate à pH 7,0-8,0.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration du tampon est comprise entre 20 et 50 mM pour réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase est la subtilisine.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase et le détergent se présentent sous la forme d'une poudre à laver enrichie par des enzymes et dépourvue de catalase.

8. Nécessaire pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient un détergent enrichi par une protéase alcaline pratiquement dépourvue de catalase et 20 à 400 micromoles d'un tampon de pH, seul ou en combinaison avec un autre soluté capable de réduire la solubilité de l'oxygène dans le lait et d'amener la solution de lait résultante à un pH compris entre 7,0-8,0.

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