CH664472A5

CH664472A5 - CAPSULE CONTAINING LIVABLE CELLS.

Info

Publication number: CH664472A5
Application number: CH4158/84A
Authority: CH
Inventors: Allan P Jun Jarvis
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1983-09-01
Filing date: 1984-08-30
Publication date: 1988-03-15
Also published as: SE8404343D0; AU563653B2; BE900469A; CA1245984A; GB2145992A; IT1196742B; SE8404343L; DK419184A; JPS6075326A; GB2145992B; DE3432143C2; NL8402671A; NO843481L; IT8467874A0; DE3432143A1; DK419184D0; IT8467874A1; IL72787A0; IL72787A; FR2551455B1

Description

BESCHREIBUNG DESCRIPTION

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine lebensfähige Zellen enthaltende Kapsel, die im Patentanspruch 1 definiert ist. Beschrieben werden auch Verfahren zum Einkapseln von Kernmaterial innerhalb einer semipermeablen Membran, insbesondere zum Einkapseln von in Bezug auf pH, Temperatur oder Ionenstärke empfindlichen lebensfähigen Zellen, innerhalb einer Mikrokapsel. Das hier offenbarte Einkapselungsverfahren erlaubt die Bildung einer semiper-meablen Membran ohne Schädigung des Kernmaterials. The present invention relates to a viable cell-containing capsule as defined in claim 1. Methods are also described for encapsulating core material within a semipermeable membrane, in particular for encapsulating viable cells that are sensitive to pH, temperature or ionic strength within a microcapsule. The encapsulation process disclosed here allows the formation of a semi-meable membrane without damaging the core material.

Obgleich eine Anzahl von Verfahren für die Mikroein-kapselung von Kernmaterial entwickelt wurden, können die meisten dieser Verfahren nicht für in Bezug auf pH, Temperatur oder Ionenstärke empfindliches Material, wie lebensfähige Zellen, verwendet werden, und zwar wegen der scharfen Bedingungen, die für die Einkapselung erforderlich sind. Die US-PS Nr. 4 352 883 offenbart ein Verfahren, von dem angenommen wird, dass es das erste Verfahren zum erfolgreichen Einkapseln von lebensfähigem Gewebe oder lebensfähigen Zellen innerhalb einer semipermeablen Membran ist. In diesem patentierten Verfahren wird um das Gewebe oder die Zellen herum eine temporäre Kapsel aus einem gelierbaren Material, vorzugsweise einem anionischen Gummi, wie Na-triumalginat, gebildet, und eine permanente, semipermeable Membran wird durch Vernetzung von Oberflächenschichten der temporären Kapsel gebildet. Spezifisch wird ein Gemisch aus dem Gummi und dem Kernmaterial einer Gelierlösung, vorzugsweise einer Calciumionenlösung, ausgesetzt, um eine temporäre Kapsel zu erzeugen. Die resultierende temporäre Although a number of methods have been developed for the microencapsulation of core material, most of these methods cannot be used for pH, temperature, or ionic strength sensitive materials, such as viable cells, because of the harsh conditions required for them Encapsulation is required. U.S. Patent No. 4,352,883 discloses a method which is believed to be the first method to successfully encapsulate viable tissue or cells within a semipermeable membrane. In this patented process, a temporary capsule made of a gellable material, preferably an anionic rubber, such as sodium alginate, is formed around the tissue or cells, and a permanent, semi-permeable membrane is formed by cross-linking surface layers of the temporary capsule. Specifically, a mixture of the gum and the core material is exposed to a gelling solution, preferably a calcium ion solution, to create a temporary capsule. The resulting temporary

Kapsel wird mit einer Lösung eines polykationischen Materials umgesetzt, um eine permanente Membran zu bilden. Das Innere der Kapsel kann wieder verflüssigt werden, indem man Bedingungen wieder herstellt, unter denen das anionische Gummi flüssig ist, z.B. durch Veränderung der ionischen Umgebung durch Bringen der Kapsel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Die Wiederverflüssigung des Inneren der Kapsel erleichtert den Nährstofftransport durch die Membran hindurch und fördert das Zellwachstum. Das Verfahren braucht das Kernmaterial nicht zu schädigen oder die Lebensfähigkeit von Zellen nicht zu beeinträchtigen, weil die Temperatur-, Ionenstärke- und pH-Bereiche, die in dem Einkapselungsverfahren angewandt werden, nicht scharf zu sein brauchen. Capsule is reacted with a solution of a polycationic material to form a permanent membrane. The interior of the capsule can be liquefied again by restoring conditions under which the anionic rubber is liquid, e.g. by changing the ionic environment by placing the capsule in phosphate buffered saline. The reliquefaction of the interior of the capsule facilitates the transport of nutrients through the membrane and promotes cell growth. The process need not damage the core material or affect cell viability because the temperature, ionic strength, and pH ranges used in the encapsulation process need not be sharp.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Kapsel, die lebensfähige Zellen enthält und eine semipermeable Membran aufweist, zur Verfügung zu stellen. The object of the invention is therefore to provide a capsule which contains viable cells and has a semipermeable membrane.

Beschrieben wird ein Verfahren zum Einkapseln von Kernmaterial, wie Enzymen, Antikörpern, Hormonen oder lebensfähigen Zellen, z. B. Gewebekulturen oder genetisch modifizierten Zellen, innerhalb einer semipermeablen Membran. Das Kernmaterial wird in einem wässrigen Medium suspendiert, in dem ein Polysaccharid, das kationische Gruppen enthält, vorzugsweise ein aminiertes Polysaccharid, wie Poly-D-glucosamin (Chitosan), gelöst ist. Ein Tröpfchen der Suspension wird geliert, indem man das Tröpfchen einer Lösung von zweiwertigen oder mehrwertigen Anionen, z.B. Phosphat, Hydrogenphosphat oder Sulfat, aussetzt. Eine permanente Membran wird durch Vernetzen von Oberflächenschichten der temporären Matrix mit einem Polymer, das anionische Gruppen, vorzugsweise Carboxylgruppen, die mit den kationischen Gruppen der Matrix reaktionsfähig sind, enthält. Poly-L-glutaminsäure und Poly-L-asparagin-säure sind, entweder als Säuren oder als Salze, bevorzugte anionische Polymere. Das Innere der Kapsel kann wieder löslich gemacht werden, indem man die Kapsel einer Lösung von niedermolekularen Polykationen, z.B. Spermidin, Spermin oder Harnstoff, aussetzt. Die Wiederverflüssigung des Inneren fördert den Massentransport zwischen der Flüssigkeit ausserhalb der Kapsel und dem Volumen innerhalb der Kapsel. A method is described for encapsulating nuclear material such as enzymes, antibodies, hormones or viable cells, e.g. B. tissue cultures or genetically modified cells, within a semipermeable membrane. The core material is suspended in an aqueous medium in which a polysaccharide containing cationic groups, preferably an aminated polysaccharide such as poly-D-glucosamine (chitosan), is dissolved. A droplet of the suspension is gelled by placing the droplet in a solution of divalent or multivalent anions, e.g. Phosphate, hydrogen phosphate or sulfate. A permanent membrane is formed by crosslinking surface layers of the temporary matrix with a polymer that contains anionic groups, preferably carboxyl groups, that are reactive with the cationic groups of the matrix. Poly-L-glutamic acid and poly-L-aspartic acid, either as acids or as salts, are preferred anionic polymers. The interior of the capsule can be made soluble again by placing the capsule in a solution of low molecular weight polycations, e.g. Spermidine, spermine, or urea. The reliquefaction of the interior promotes mass transport between the liquid outside the capsule and the volume inside the capsule.

Beschrieben wird ferner ein Verfahren zum Einkapseln von lebensfähigen Zellen innerhalb einer semipermeablen Membran. Die Zellen werden in einem wässrigen Medium suspendiert, das mit der Lebensfähigkeit der Zellen verträglich ist und ein aminiertes Glucopolysaccharid enthält. Ein Tröpfchen der Suspension wird einer Gelierlösung ausgesetzt, wodurch eine ihre Form beibehaltende, wasserunlösliche temporäre Matrix gebildet wird. Die Gelierlösung ist eine wässrige Lösung von zweiwertigen oder mehrwertigen Anionen, z.B. Phosphat, Hydrogenphosphat oder Sulfat. Oberflächenschichten der temporären Matrix werden permanent vernetzt, indem man die Kapsel einem Polymer, das eine Vielzahl von Carboxylgruppen enthält, z.B. Polyglutaminsäure oder Polyasparaginsäure, aussetzt. Das Innere der Kapsel wird in einer im wesentlichen von Fällmitteln freien Reaktion wieder verflüssigt, indem man die Kapsel einer Lösung eines niedermolekularen Polykations, z.B. Spermidin, Spermin oder Harnstoff, aussetzt. Die Wiederverflüssigung tritt durch Entfernung von mehrwertigen Anionen aus dem inneren Gel ein. Menschen- oder Säugetiergewebezellen in einem Gewebenährmedium und genetisch modifizierte pro-karyotische oder eukaryotische Zellen in einem Nährmedium können mittels dieses Verfahrens eingekapselt werden. Das Einkapselungsverfahren ist schonend, so dass die eingekapselten Zellen nicht geschädigt werden und innerhalb der Kapsel normale Stoffwechselprozesse, einschliesslich Wachstum und Vermehrung, erfahren können. Also described is a method for encapsulating viable cells within a semipermeable membrane. The cells are suspended in an aqueous medium that is compatible with cell viability and contains an aminated glucopolysaccharide. A droplet of the suspension is exposed to a gelling solution, thereby forming a water-insoluble temporary matrix that retains its shape. The gelling solution is an aqueous solution of divalent or multivalent anions, e.g. Phosphate, hydrogen phosphate or sulfate. Surface layers of the temporary matrix are permanently cross-linked by placing the capsule on a polymer containing a variety of carboxyl groups, e.g. Polyglutamic acid or polyaspartic acid. The interior of the capsule is liquefied again in a reaction essentially free of precipitants, by placing the capsule in a solution of a low molecular weight polycation, e.g. Spermidine, spermine, or urea. Reliquefaction occurs by removing polyvalent anions from the inner gel. Human or mammalian tissue cells in a tissue culture medium and genetically modified pro-karyotic or eukaryotic cells in a culture medium can be encapsulated using this method. The encapsulation process is gentle so that the encapsulated cells are not damaged and normal metabolic processes, including growth and reproduction, can be experienced within the capsule.

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Gemäss einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Kapsel mit einer Membran, die ein eingeschlossenes innerhalb der Kapsel befindliches Volumen begrenzt. Die Membran hat eine innere Schicht aus einem ami-nierten Polysaccharid, insbesondere einem aminierten Glu-copolysaccharid, die ionisch mit einer äusseren Schicht aus einem polyanionischen Polymer, vorzugsweise einem poly-carboxylierten Polymer, wie Polyglutaminsäure oder Polyasparaginsäure, vernetzt ist, so dass sich eine wasserunlösliche permanente Kapsel bildet. Zellen, vorzugsweise eukaryoti-sche, bakterielle oder genetisch modifizierte Zellen, können innerhalb des in der Kapsel befindlichen Volumens angeordnet sein. Wenn Zellen innerhalb des Volumens in der Kapsel angeordnet sind, sollten die polyanionischen und polyami-nierten Polymere mit der Zelle physiologisch verträglich sein. According to a further embodiment, the invention relates to a capsule with a membrane which delimits an enclosed volume located within the capsule. The membrane has an inner layer of an aminated polysaccharide, in particular an aminated glu-copolysaccharide, which is ionically crosslinked with an outer layer of a polyanionic polymer, preferably a poly-carboxylated polymer such as polyglutamic acid or polyaspartic acid, so that one forms water-insoluble permanent capsule. Cells, preferably eukaryotic, bacterial or genetically modified cells, can be arranged within the volume in the capsule. If cells are located within the volume in the capsule, the polyanionic and polymerized polymers should be physiologically compatible with the cell.

Beschrieben wird nun ein Verfahren zum Einkapseln von Kernmaterialien, wie lebensfähige eukaryotische oder pro-karyotische, natürlich vorkommende oder genetisch modifizierte Zellen oder Gewebekulturen innerhalb einer semipermeablen Membran. Die Erfindung bezieht sich auf eine mehrschichtige Kapsel eines neuen Typs. A process for encapsulating core materials, such as viable eukaryotic or pro-karyotic, naturally occurring or genetically modified cells or tissue cultures within a semipermeable membrane, is now described. The invention relates to a multilayer capsule of a new type.

Ein Gel oder eine temporäre Matrix wird um das Kernmaterial oder die lebensfähigen Zellen herum gebildet, indem man ein Polysaccharid oder Glucopolysaccharid, das kationische Gruppen enthält, mit einem mehrwertigen Ani-on umsetzt. Oberflächenschichten der resultierenden temporären Matrix werden durch ein Polymer, das anionische Gruppen, vorzugsweise Carboxylgruppen, enthält, ionisch vernetzt, so dass sich eine permanente Membran bildet, die das Kernmaterial einkapselt. Das Innere der Kapsel kann wieder verflüssigt werden, indem man die Kapsel einer Lösung von niedermolekularen Polykationen aussetzt. A gel or temporary matrix is formed around the core material or viable cells by reacting a polysaccharide or glucopolysaccharide containing cationic groups with a polyvalent anion. Surface layers of the resulting temporary matrix are ionically crosslinked by a polymer which contains anionic groups, preferably carboxyl groups, so that a permanent membrane is formed which encapsulates the core material. The inside of the capsule can be liquefied again by exposing the capsule to a solution of low molecular weight polycations.

Ein Kernmaterial, z.B. Enzyme, Hormone, Antikörper oder lebensfähige Zellen, wird in einem wässrigen Medium suspendiert, das ein gelierbares, kationische Gruppen enthaltendes Polymer enthält. Das bevorzugte gelierbare Polymer ist ein aminiertes Glucopolysaccharid, insbesondere Chitosan (Poly-D-glucosamin). Chitosan wird durch saure Hydrolyse von Chitin (Poly-D-N-acetylglucosamin), dem wichtigsten Baumaterial des äusseren Skeletts von wirbellosen Tieren, gebildet. Chitosan ist ein langkettiges, aminiertes Polymer, das mit den meisten Zellen physiologisch verträglich ist. Es ist in Wasser nur schwer löslich, kann aber leicht in verdünnter Essigsäure gelöst werden. A core material, e.g. Enzymes, hormones, antibodies or viable cells are suspended in an aqueous medium containing a gelable polymer containing cationic groups. The preferred gellable polymer is an aminated glucopolysaccharide, especially chitosan (poly-D-glucosamine). Chitosan is formed by acid hydrolysis of chitin (poly-D-N-acetylglucosamine), the most important building material in the outer skeleton of invertebrates. Chitosan is a long-chain, aminated polymer that is physiologically compatible with most cells. It is only sparingly soluble in water, but can easily be dissolved in dilute acetic acid.

Vorratslösungen von Chitosan werden hergestellt, indem man das Chitosan in 0,5-molarer Essigsäure auflöst. Die Essigsäure wird aus der Lösung durch wiederholte Dialyse gegen mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Chitosan fällt aus dieser Lösung nicht aus, wenn die Lösung auf einer Temperatur unter 37 °C gehalten wird. Die bevorzugte Vorratslösung, 1,4% Chitosan in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wurde mit Erfolg längere Zeit bei 4 °C aufbewahrt. Chitosan stock solutions are made by dissolving the chitosan in 0.5 molar acetic acid. The acetic acid is removed from the solution by repeated dialysis against phosphate buffered saline (PBS). Chitosan does not precipitate out of this solution if the solution is kept at a temperature below 37 ° C. The preferred stock solution, 1.4% chitosan in phosphate buffered saline, was successfully kept at 4 ° C for a long time.

Die Chitosanlösung, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird mit dem einzukapselnden Material gemischt, wobei sich eine Lösung oder Aufschlämmung bildet, ehe sie zu Tröpfchen oder anderen Formen geformt wird. Obgleich Lösungen mit einer Chitosanendkonzentration von 0,4% (Gewicht/Volumen) gelieren, wird eine optimale Gelierung mit 0,8 bis 1,2% (Gewicht/Volumen) Chitosan in isotonischem, 125-millimolarem Dinatriummonohydrogenphos-phat erhalten. Tröpfchen der Suspension von Chitosan und Kernmaterial können mittels beliebiger herkömmlicher Tröpfchenbildungsvorrichtungen gebildet werden. Eine derartige Tröpfchenbildungsvorrichtung wird unten beschrieben. The chitosan solution prepared as described above is mixed with the material to be encapsulated to form a solution or slurry before being formed into droplets or other shapes. Although solutions with a final chitosan concentration of 0.4% (weight / volume) gel, an optimal gelation with 0.8 to 1.2% (weight / volume) chitosan in isotonic, 125-millimolar disodium monohydrogenphosphate is obtained. Droplets of the suspension of chitosan and core material can be formed using any conventional droplet formation device. Such a droplet forming device is described below.

Ein Rohr, das die Suspension enthält, wird mit einem A tube containing the suspension is connected to a

Stopfen versehen, der eine Tröpfchenbildungsvorrichtung festhält. Die Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse mit einer oberen Luftaufnahmedüse und einem langgestreckten Hohlkörper, der mit Reibsitz in dem Stopfen sitzt. Eine 10 ml-Injektionsspritze, die mit einer Schrittschaltpumpe versehen ist, wird oben auf das Gehäuse montiert, wobei eine Nadel, z.B. eine teflonbeschichtete Nadel mit 0,25 mm Innendurchmesser, sich durch die ganze Länge des Gehäuses erstreckt. Das Innere des Gehäuses ist so konstruiert, dass die Spitze der Nadel einem konstanten laminaren Luftstrom ausgesetzt ist, der wie eine aus Luft gebildete Schneide wirkt. Beim Gebrauch wird die Schrittschaltpumpe betätigt, um in Inkrementen Tröpfchen der Lösung aus der Spitze der Nadel zu pressen. Jedes Tröpfchen wird durch den Luftstrom «abgeschnitten» Und fält annäherungsweise 2,5 cm in die Gelierlösung, vorzugsweise eine Dinatriumhydrogenphosphatlö-sung, wo es durch Reaktion mit den negativen Ionen unverzüglich geliert wird. Der Abstand zwischen der Spitze der Nadel und der Oberfläche der Gelierlösung ist vorzugsweise so gross, dass die Suspension von Chitosan und Kernmaterial die physikalisch günstigste Form, nämlich eine Kugel (maximales Volumen für minimale Oberfläche) annehmen kann. Luft aus dem Rohr tritt durch eine Öffnung in dem Stopfen aus. Dieses Verfahren führt zu einer «Vernetzung» des Gels und der Bildung einer temporären schützenden Matrix mit hoher Viskosität, die ihre Form beibehält und das suspendierte Kernmaterial und sein Medium enthält. Die temporären Matrices sammeln sich in der Lösung als getrennte Phase an und können durch Absaugen abgetrennt werden. Provide stopper that holds a droplet forming device. The device consists of a housing with an upper air intake nozzle and an elongated hollow body which sits with a friction fit in the stopper. A 10 ml syringe equipped with a stepping pump is mounted on top of the housing, with a needle, e.g. a Teflon-coated needle with 0.25 mm inner diameter, extends through the entire length of the housing. The interior of the housing is designed so that the tip of the needle is exposed to a constant laminar flow of air that acts like a cutting edge made of air. In use, the stepper pump is actuated to squeeze droplets of the solution from the tip of the needle in increments. Each droplet is “cut off” by the air flow and folds approximately 2.5 cm into the gelling solution, preferably a disodium hydrogen phosphate solution, where it is immediately gelled by reaction with the negative ions. The distance between the tip of the needle and the surface of the gelling solution is preferably so large that the suspension of chitosan and core material can take the physically most favorable form, namely a sphere (maximum volume for minimum surface). Air from the tube exits through an opening in the plug. This process leads to a "crosslinking" of the gel and the formation of a temporary protective matrix with high viscosity that maintains its shape and contains the suspended core material and its medium. The temporary matrices collect in the solution as a separate phase and can be removed by suction.

Die bevorzugte Gelierlösung mit mehrwertigen Anionen ist eine 125-millimolare Dinatriumhydrogenphosphatlösung; jedoch wurden auch mit Mononatriumdihydrogenphosphat-und Natriumsulfatlösungen annehmbare temporäre Matrices erzeugt. Natriumeitrat kann die Suspension zwar gelieren, aber die besten Ergebnisse werden mit Mononatriumdi-hydrogenphosphat- oder Dinatriummonohydrogenphos-phat- sowie Sulfatlösungen erhalten. Wenn die Anionen-konzentration zu gering ist (z.B. unterhalb annäherungsweise 100-millimolar), kann keine Gelierung eintreten. The preferred gelling solution with polyvalent anions is a 125 millimolar disodium hydrogen phosphate solution; however, acceptable temporary matrices were also created with monosodium dihydrogen phosphate and sodium sulfate solutions. Sodium citrate can gel the suspension, but the best results are obtained with monosodium dihydrogenphosphate or disodium monohydrogenphosphate and sulfate solutions. If the anion concentration is too low (e.g. below approximately 100 millimolar), no gelation can occur.

Die mittels dieses Verfahrens gebildeten temporären Matrices werden gesammelt und gewaschen, um überschüssige Gelierlösung zu entfernen. Die Matrices werden dann einer Überzugs- oder Vernetzungslösung aus einem polyanionischen, vorzugsweise polycarboxylierten, Polymer ausgesetzt. Eine bevorzugte Vernetzungslösung ist eine 1%-ige Lösung von Poly-L-asparaginsäure oder Poly-L-glutaminsäure, die im Verhältnis 1:15 mit 150-millimolarem Natriumchlorid verdünnt ist, so dass sich eine Polymerendkonzentration von 6,6 x 10-4 g/100 ml ergibt. Das Molekulargewicht der Poly-L-asparaginsäure oder Poly-L-glutaminsäure kann im Bereich von 3000 bis 100 000 oder höher liegen, aber der Bereich von 25 000 bis 60 000 wird bevorzugt. Eine Reaktionsdauer von 3 bis 6 Minuten bei Umgebungsraumtemperatur hat sich als befriedigend erwiesen. The temporary matrices formed by this method are collected and washed to remove excess gelling solution. The matrices are then exposed to a coating or crosslinking solution made of a polyanionic, preferably polycarboxylated, polymer. A preferred crosslinking solution is a 1% solution of poly-L-aspartic acid or poly-L-glutamic acid, which is diluted 1:15 with 150-millimolar sodium chloride, so that a final polymer concentration of 6.6 x 10-4 g / 100 ml results. The molecular weight of the poly-L-aspartic acid or poly-L-glutamic acid can range from 3000 to 100,000 or higher, but the range from 25,000 to 60,000 is preferred. A reaction time of 3 to 6 minutes at ambient room temperature has proven to be satisfactory.

Die folgenden Beispiele erläutern exemplarische Verfahren zur praktischen Ausführung der Erfindung. The following examples illustrate exemplary methods for practicing the invention.

Beispiel 1 example 1

Eine Vorratslösung von 1,4% Chitosan (CSN — Sigma Chemical Co.) in 14- bis 17-millimolarer (Gewicht/Volumen) isotonischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde in diesem Versuch verwendet. Verschiedene CSN-Konzentrationen wurden getestet, um die optimale CSN-Konzentration für die Bildung einer temporären Matrix zu bestimmen. In jedem Falle wurden 1 ml-Proben aus der CSN-Vorratslösung und fötalem Kälberserum (FCS — Flow Laboratories) gebildet. A 1.4% chitosan (CSN - Sigma Chemical Co.) stock solution in 14 to 17 millimolar (weight / volume) isotonic phosphate buffered saline, prepared as described above, was used in this experiment. Different CSN concentrations were tested to determine the optimal CSN concentration for the formation of a temporary matrix. In each case, 1 ml samples were made from the CSN stock solution and fetal calf serum (FCS - Flow Laboratories).

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Wie unten beschrieben, wurden unter Verwendung einer oben beschriebenen Tröpfchenbildungsvorrichtung Tröpfchen erzeugt und in die Lösungen eingeführt. Die Tabelle erläutert drei verschiedene CSN-Konzentrationen (Gewicht/ Volumen), die in diesem Versuch getestet wurden, nämlich 0,6%, 0,8% und 1%. As described below, droplets were generated using a droplet-forming device described above and introduced into the solutions. The table explains three different CSN (weight / volume) concentrations tested in this experiment, namely 0.6%, 0.8% and 1%.

Tabelle table

Probe Nr. CSN (ml) FCS (ml) CSN-Konzentration Sample No. CSN (ml) FCS (ml) CSN concentration

(Gew./Vol.) (W / v)

1 0,57 0,43 0,8% 1 0.57 0.43 0.8%

2 0,42 0,58 0,6% 2 0.42 0.58 0.6%

3 0,72 0,28 1,0% 3 0.72 0.28 1.0%

Zwei Gelierpuffer wurden hergestellt, nämlich 110-milli-molares Natriumcitrat (Sigma) und 125-millimolares Dina- Two gelling buffers were made, namely 110 millimolar sodium citrate (Sigma) and 125 millimolar dina-

triumhydrogenphosphat (Sigma). In allen Fällen waren die unter Verwendung dieser gepufferten Lösungen gebildeten zeitweiligen Matrices annehmbar, aber der Natriumcitrat-puffer erzeugte eine nicht angemessene Gelierung der Probe Nr. 1. Obgleich alle Proben mit dem Dinatriumhydrogen-phosphatpuffer annehmbare temporäre Matrices bildeten, ergab die Probe Nr. 3 die beste Gelierung. trium hydrogen phosphate (Sigma). In all cases, the temporary matrices formed using these buffered solutions were acceptable, but the sodium citrate buffer produced inadequate gelation of Sample No. 1. Although all samples with the disodium hydrogen phosphate buffer formed acceptable temporary matrices, Sample No. 3 resulted the best gelation.

Eine 1 %-ige Lösung von Poly-L-asparaginsäure (Molekulargewicht 40 000 — Sigma) wurde im Verhältnis 1:15 mit 150-millimolarem Natriumchlorid (Sigma) verdünnt, um eine Lösung mit einer Konzentration von 6,6 x 10~4g/ 100 ml zu bilden. Die aus der Probe Nr. 3 gebildeten temporären Matrices wurden aus dem Gelierpuffer entfernt, wiederholt mit isotonischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und wieder in der Poly-L-asparaginsäurelö-sung suspendiert. Nach 6 Minuten bei Raumtemperatur in der Poly-L-asparaginsäurelösung war die Vernetzungsreaktion beendet, wobei sich die permanenten Membranen bildeten. Die Kapseln waren im wesentlichen kugelförmig und hatten einen Durchmesser von ca. 380 bis 480 (xm. Einige Kapseln hatten kleine Schwänze. Die mittels dieses Verfahrens gebildeten Kapseln waren nicht klebrig und hatten keine Neigung zum Zusammenklumpen. Die Porosität der Kapseln wurde empirisch bestimmt und betrug ca. 80 000 u. Dieses Beispiel erläutert, dass unter Anwendung des beschriebenen Verfahrens erfindungsgemäss annehmbare Kapseln gebildet werden können. A 1% solution of poly-L-aspartic acid (molecular weight 40,000 - Sigma) was diluted 1:15 with 150-millimolar sodium chloride (Sigma) to give a solution with a concentration of 6.6 x 10 ~ 4g / To form 100 ml. The temporary matrices formed from sample No. 3 were removed from the gelling buffer, washed repeatedly with isotonic phosphate-buffered saline and resuspended in the poly-L-aspartic acid solution. After 6 minutes at room temperature in the poly-L-aspartic acid solution, the crosslinking reaction had ended, the permanent membranes forming. The capsules were substantially spherical and approximately 380 to 480 (xm) in diameter. Some capsules had small tails. The capsules formed by this method were not sticky and had no tendency to clump together. The porosity of the capsules was determined empirically and was approximately 80,000 and this example illustrates that acceptable capsules can be formed using the method described.

Beispiel 2 Example 2

Dieses Beispiel wurde ausgeführt, um zu beweisen, dass die Lebensfähigkeit von Zellen durch das Einkapselungsverfahren nicht beeinträchtigt wird. Die in diesem Versuch verwendete Zellkultur war die Friend Erythroleukemic Cell Line (FEL745), eine erythroleukämische Mäuselinie, die leicht in einer Suspensionskultur wächst. This example was performed to demonstrate that the encapsulation process does not affect cell viability. The cell culture used in this experiment was the Friend Erythroleukemic Cell Line (FEL745), an erythroleukaemic mouse line that grows easily in a suspension culture.

Eine Kultur von FEL745-Zellen wurde 5 Minuten lang zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde als Auf-schlämmung wieder in fötalem Kälberserum (Flow Labs) suspendiert. Eine Vorratslösung, die 1,4% Chitosan enthielt, wurde wie oben beschrieben hergestellt und mit der Zellkulturlösung gemischt, so dass sich eine Chitosanendkonzentra-tion von 1% (Gewicht/Volumen) und eine Zellkonzentration von ca. 5 x 106 Zellen/ml ergab. Temporäre Matrices wurden erzeugt, indem man das Gemisch aus Chitosan und Zellen durch eine oben beschriebene Tröpfchenbildungsvorrichtung presste und die resultierenden flüssigen Mikrokügel-chen mit der oben beschriebenen 125-millimolaren (Gewicht/Volumen) Phosphationenlösung in Berührung brachte. Die resultierenden temporären Matrices wurden wiederholt mit isotonischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und wieder in einer 6,6 x 10~4 g Poly-L-aspara-ginsäure (Molekulargewicht 40 000) in 100 ml 150-millimo-larem Natriumchlorid enthaltenden Lösung suspendiert. Nach 6 Minuten bei Raumtemperatur in der Poly-L-asparaginsäurelösung wurden die resultierenden Kapseln zweimal mit dem Nährmedium RPMI-1640 (Flow Labs), das 10% fötales Kälberserum und Antibiotika enthielt, gewaschen. Die Mikrokapseln wurden in Gewebekulturkolben mit dem Nährmedium gebracht und bei 37 °C unter einer 5%-igen Kohlendioxid-Atmosphäre bebrütet. A culture of FEL745 cells was centrifuged for 5 minutes and the resulting pellet was resuspended as a slurry in fetal calf serum (Flow Labs). A stock solution containing 1.4% chitosan was prepared as described above and mixed with the cell culture solution so that a final chitosan concentration of 1% (weight / volume) and a cell concentration of approx. 5 x 106 cells / ml resulted . Temporary matrices were created by forcing the mixture of chitosan and cells through a droplet described above and contacting the resulting liquid microspheres with the 125 millimolar (weight / volume) phosphate ion solution described above. The resulting temporary matrices were washed repeatedly with isotonic phosphate-buffered saline and resuspended in a 6.6 x 10 -4 g poly-L-aspartic acid (molecular weight 40,000) in a solution containing 100 ml of 150 millimolar sodium chloride. After 6 minutes at room temperature in the poly-L-aspartic acid solution, the resulting capsules were washed twice with the nutrient medium RPMI-1640 (Flow Labs), which contained 10% fetal calf serum and antibiotics. The microcapsules were placed in tissue culture flasks with the nutrient medium and incubated at 37 ° C under a 5% carbon dioxide atmosphere.

Proben der Zellkultur wurden in verschiedenen Abständen entfernt. Die Untersuchung unter einem Mikroskop zeigte, dass die Zellen wuchsen und sich vermehrten, was die Lebensfähigkeit der Zelle nach dem Einkapselungsverfahren erläutert. Wie festgestellt werden kann, wurde keine Wieder-verflüssigungsstufe angewandt, da Friend-Zellen in einer Gelkultur ebenso wie in einer Suspensionskultur wachsen können. Viele Typen von Zellen brauchen aber eine flüssige Kultur, um sich zu vermehren. Die Lebensfähigkeit der Zellen sollte durch das Wiederlöslichmachen des Kapselinneren nicht beeinflusst werden. Die Kapsel stellt eine Mikroumge-bung zur Verfügung, die frei von äusseren Verunreinigungen ist. Samples of the cell culture were removed at various intervals. Examination under a microscope showed that the cells grew and multiplied, which explains the viability of the cell after the encapsulation process. As can be seen, no re-liquefaction step was used since Friend cells can grow in a gel culture as well as in a suspension culture. However, many types of cells need a liquid culture to multiply. Cell viability should not be affected by the solubility of the capsule interior. The capsule provides a microenvironment that is free of external contaminants.

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Claims

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1. Viable cell-containing capsule, which has a semipermeable membrane that limits an enclosed volume within the capsule, in which viable human or mammalian cells are arranged within a nutrient medium, the membrane having an inner layer that has an aminated polysaccharide, and an outer layer comprising a polyanionic polymer, the aminated polysaccharide and the polyanionic polymer being crosslinked by ionic interaction between cationic amine groups on the aminated polysaccharide and anionic groups on the polyanionic polymer to form a water-insoluble permanent capsule form, whereby the encapsulated viable cells within the capsule are able to grow and multiply.

2. Capsule according to claim 1, characterized in that the aminated polysaccharide is a polyaminated glucopolysaccharide.

2nd

PATENT CLAIMS

3. Capsule according to claim 1 or 2, characterized in that the polyanionic polymer is a polycarboxylated polymer.

4. Capsule according to claim 3, characterized in that the polyanionic polymer is polyaspartic acid or a salt thereof.

5. Capsule according to claim 3, characterized in that the polyanionic polymer is polyglutamic acid or a salt thereof.

6. Capsule according to one of claims 1 to 5, characterized in that the aminated polysaccharide and the polyanionic polymer are physiologically compatible with the cells.

7. Capsule according to claim 6, characterized in that the cells are genetically modified cells.

8. Capsule according to claim 1, characterized in that the aminated polysaccharide is chitosan.