La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un dérivé de l'acide adénylique cyclique, L'acide N6, 2'-O- dibutyryl-8-thio-adénosine-3', 5'-phosphorique cyclique de formule:
EMI1.1
On sait que l'acide adénosine-3', 5'-phosphorique (AMP cyclique) joue un rôle biologique extrêmement important en raison de son rôle de deuxième messager hormonal . Certaines hormones activent en effet un enzyme, I'adényl-cyclase, localisé dans les membranes cellulaires du tissu-cible qui catalyse la formation de cet AMP cyclique à partir de l'ATP par départ d'acide pyrophosphorique. L'AMP cyclique exerce alors, à l'intérieur des cellules du tissu-cible, un effet identique à celui de l'hormone spécifique.
Il existe d'autre part une phosphodiestérase spécifique qui, par hydrolyse, convertit l'AMP cyclique en acide adénosine-5'-phosphorique (AMP); cet enzyme semble jouer un rôle de régulateur de la concentration intracellulaire du nucléotide cyclique.
On a remarqué que l'AMP cyclique exogéne n'exerce qu'un effet médiocre sur des cellules intactes, ce qui a été attribué avant tout a des difficultés de transport à travers les membranes cellulaires. On a synthétisé alors des séries d'analogues de l'AMP cyclique qui exercent sur des cellules intactes un effet bien supérieur. La synthése d'une première série d'analogues était basée sur le principe suivant: introduction en N6 et (ou) 2'-O de restes acyles qui, par leurs propriétés lipophiles, devaient faciliter le passage à travers les membranes cellulaires. C'est ainsi qu'on a préparé en particulier le N6, 2'-O-dibutyryl-AMP cyclique (Th.
Posternak, E.W. Sutherland et W.F. Henion, Biochim. Biophys.
Acta 65, 558 (1962); J.G. Falbriard, Th. Postemak et E.W.
Sutherland, ibid 148, 99 (1967) qui, dans de trés nombreux tests, s'est montré plus actif sur des cellules intactes que le nucléotide cyclique de base: cette activité est due aussi sans doute à la résistance qu'oppose cette substance à l'action de la phosphodiestérase sur laquelle elle exerce même un effet inhibiteur à certaines concentrations (G. Cehovic, Th. Postemak et E. Charollais, Adv.
in Cyclic Nucleotide Research, 1, 521 (1972).
Par la suite, on a préparé des analogues actifs résultant d'une substitution de l'AMP cyclique dans le squelette purique en C-8 (Th. Posternak, I. Marcus et G. Cehovic, C. R. Acad. Sc. Paris 27'D. 622(1971); K. Muneyama, R.J. Bauer, D.A. Shuman,
R. K. Robins et L. Simon, Biochemistry 10, 2390 (1971). C'est surtout l'acide 8-thio-3', 5'-adénosine-phosphorique qui manifeste un effet considérable qui est par exemple prés de trois fois supérieur à celui de l'AMP cyclique dans le test de la décharge in vitro d'hormones hypophysaires, en particulier d'hormone de croissance, par des coupes d'hypophyse de rat.
Si, conformément au principe énoncé ci-dessus, on introduit dans cette substance deux groupes butyryles lipophiles, le N6, 2'-O-dibutyryl-8-thio
AMP cyclique résultant manifeste dans le même test une activité environ 7 fois plus élevée que celle de l'AMP cyclique.
Un procédé pour la préparation des deux composés mentionnés, c'est-à-dire du 8-thio-AMP cyclique et de son dérivé NO, 2' O-dibutyrylé, présente donc un intérêt considérable. Selon les exemples des brevets allemand P 19221728 et anglais N" 1257546 de la maison Boehringer Mannheim G.m.b.H. et selon le travail cité plus haut de Muneyama et ai., le 8-thio-AMP cyclique peut être préparé par traitement du 8-bromo-AMP cyclique au moyen de la thiourée. De nombreux essais ont montré que cette méthode n'est pas favorable et qu'on obtient de meilleurs résultats en traitant le 8-bromo-AMP cyclique par NaSH. Ce procédé a été décrit dans la demande de brevet français No 70.35682.
Dans cette demande de brevet, on a indiqué un procédé de préparation du N6, 2'-O-dibutyryl-8-thio-AMP cyclique qui est isolé sous forme de sel de baryum avec un rendement ne dépassant pas 30%. Le procédé de la présente invention donne par contre un rendement de 83%.
Le procédé suivant l'invention est caractérisé par le fait qu'on traite l'acide 8-thio-adénosine-3', 5'-phosphorique cyclique, à chaud, par un agent butyrylant puis qu'on isole le produit N6, 2' O-dibutyrylé.
Comme agent butyrylant, on peut employer un mélange d'anhydride butyrique et d'une base organique, notamment la pyridine.
Pour isoler le produit cherché on peut chromatographier le mélange réactionnel sur terre de diatomées, notamment la célite, puis on peut transformer le sel d'addition de l'acide cherché avec la base organique, notamment le sel de pyridinium de l'acide N6.
2'-O-dibutyryl-8-thio-adénosine-3', 5'-phosphorique cyclique en son sel alcalin par passage de sa solution sur une résine échangeuse d'ions.
Pour la chromatographie initiale du mélange réactionnel, on peut utiliser, comme éluants successifs: I'heptane, le mélange heptane-acétone et le mélange heptane-acetone-eau.
Pour transformer le sel de pyridinium en sel alcalin, notamment de sodium, on peut utiliser comme résine échangeuse la forme sodée de la résine Dowex-50 8 x .
Le sel de sodium ainsi obtenu peut être ensuite transformé en acide libre par contact avec la forme protonée d'une résine échangeuse, par exemple la résine Dowex -50 . On peut ensuite salifier l'acide ainsi obtenu par des bases minérales ou organiques, les sels formés étant ensuite isolés par les moyens usuels.
Il est à noter que, lors de la réaction de butyrylation suivant le présent procédé, l'acylation du groupe thio en C8 ne se fait pas.
En effet, on a constaté par spectrographie que la forme tantomère thione de ce groupe prédomine fortement, ce qui explique sa faible réactivité à vis des d'acides.
Comme déjà mentionné plus haut, le produit résultant du présent procédé présente un intérêt considérable pour la recherche thérapeutique et biochimique.
L'exemple suivant illustre l'invention de maniére détaillée.
Exemple:
Préparation de l'acide N6, 2'-0-dibutyntl-8-thio-adénosine-
3', 5'-phosphorique et ses sels (N6, 2'-0-dibutyryl-8-thio
AMP cyclique et ses sels.
I g de 8-thio-AMP cyclique, préparé comme décrit dans la demande de brevet français N" 70.35682, bien pulvérisé, est suspendu dans un mélange de 33,3 ml de pyridine anhydre et de 16,6 ml d'anhydride butyrique, tous deux fraîchement distillés. On chauffe à l'ébullition à reflux pendant V2 heure jusqu'à dissolution complète. La solution est laissée ensuite à température ambiante à l'abri de la lumière. Au bout de 5-8 jours, la chromatographie sur papier Whatman NO 1 (système A: éthanol-acétate d'ammonium 0,5M 5:2 en vol.) indique la formation pratiquement quantitative du dérivé dibutyrylé.
La solution brunâtre est alors versée sur une colonne de célite BDH (30-80) (mesh for gas chromatography) de 50 cm de longueur et de 1,6 cm de diamètre imbibée d'heptane.
On lave d'abord avec au total 3 1 d'heptane afin d'éliminer complètement l'anhydride et l'acide butyriques. La colonne est ensuite lavée avec 2-3 1 d'un mélange heptane-acétone (7:3 en vol.), ce qui élimine une impureté à fluorescence rose à la lumière UV visible par chromatographie dans le système A. On procède à un deuxième lavage au moyen d'un mélange heptane-acétone (3:7 en vol.). Dans le liquide sortant se trouve d'abord un peu de dérivé 2'-O-monobutyrylé, puis apparaît le dérivé N6, 2'-O-dibutyrylé.
Ce dernier est alors élué par fractionnement au moyen du mélange éthanol-acetone-eau (5:80:15 en vol.). Les fractions contenant le dérivé dibutyrylé sont réunies et évaporées à sec sous vide. Le résidu (1,3 g) est ensuite redissous dans la quantité minimum d'eau et la solution est passée sur une colonne de 37 ml de Dowex-50 8 x (forme Na+) qu'on lave ensuite par 200 ml d'eau. Les solutions aqueuses réunies sont évaporées à sec sous vide et le résidu est desséché par coévaporations successives avec de l'éthanol. Le résidu est redissous dans la quantité minimum d'éthanol (env. 5 ml) et le sel de sodium est précipité par addition de 10 vol. d'éther sec fraîchement distillé. Il est recueilli par centrifugation et séché sous vide poussé.
On obtient ainsi 1,3 g de sel de sodium NO, 2'-O-dibutyryl-8-thio-AMP cyclique (rendement 83%). Le produit se montre homogène à la chromatographie sur papier Whatman N" 1 dans trois systèmes de solvant:
Système A: éthanol-acétate d'ammonium 0,5M (5:2 en vol.)
Rf. 0,85.
Système B: n-propanol-ammoniaque conc.-eau (55:10:35 en vol.)
Rf. 0,82.
Système C: isopropanol-sulfate d'ammonium à 1% (2:1 en vol.)
Rf. 0,82.
Dans l'eau à pH 7,0 kmaX 246 met 323 m; EmaX 19800 et 25500.
Cl8H23N508PSNa
Calculé: C 41,30 H 4,43 N 13,38 P 5,91%
Trouvé: C 41,15 H 4,49 N 13,53 P 5,44%
Par passage à O sur une colonne de Dowex-50 (forme H+) d'une solution aqueuse du sel de sodium, on obtient l'acide libre qui se sépare à l'état solide par évaporation à sec sous vide. Une solution de cet acide libre fournit par neutralisation au moyen des bases correspondantes d'autres sels qu'on isole après évaporation à sec sous vide.