Cette invention est orientée vers des nouvelles protéines ou des nouveaux polypeptides de poids moléculaires intermédiaires entre ceux de l'insuline et du glucagon, ainsi que vers leur procédé de préparation.
La protéine actuelle, extraite habituellement du pancréas de bovins, est représentée (en utilisant les abréviations de nomenclature normales pour les polypeptides: voir 67 JACS 1524, 1530) par la formule Nn2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Asp.Asp-Ala-
6 12 Thr-Pro.Glu-Gln-Mét-Ala.Gln-Tyr-Ala.Ala-Glu-Leu.Arg.
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Comme il est entendu dans la technique des polypeptides naturels, toutes les parties amino-acides sont de la forme isomère optique lévogyre.
Le polypeptide correspondant provenant du pancréas de porcins est identique à celui qui est représenté ci-dessus, si ce n'est que, en position 6, là où le polypeptide de bovins présente une glutamine, le polypeptide de porcins présente une valine. De même, le polypeptide d'origine ovine diffère de celui d'origine bovine en ce qu'il présente une sérine, en position 2, là où le polypeptide d'origine bovine présente une proline; et le polypeptide d'origine humaine diffère du polypeptide d'origine bovine en ce qu'il présente une asparagine en un point que l'on pense être en position 23, mais qui est peut-être la position 15, là où le polypeptide d'origine bovine présente une glutamine, en plus d'une différence représentée par le remplacement d'une glutamine par une valine en position 6 comme dans la substance d'origine porcine.
Ces différences spécifiques mineures sont bien connues dans la technique des extraits glandulaires: les substances présentent des comportements chimiques et pharmacologiques similaires et, à l'utilisation, on peut substituer l'une à l'autre, ou bien on peut utiliser un mélange.
Ainsi, sous une forme de représentation, la protéine obtenue par le procédé selon l'invention a la constitution suivante: NH2-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro -Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-
6 12 13 Pro-Z-Gln-Mèt-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg-Arg-Tyr-
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où, dans les modes de réalisation particuliers, X, Y, Z et Z' ont ces significations
Protéine X Y Z Z'
Bovine Pro Gln Glu Glu
Porcine Pro Val Glu Glu
Ovine Sér Gln Glu Glu
Humaine Pro Val Glu Asn ou
Pro Val Asn Glu
Le procédé selon l'invention de production de ladite protéine consiste à broyer la glande pancréatique d'un animal jusqu'à obtention d'un état d'émulsion approximatif dans un solvant non miscible à l'eau; à mettre ladite glande en contact d'alcool aqueux acidifié jusqu'à un pH d'environ 2,8; à séparer les substances tissulaires insolubles par filtration;
à ajuster la solution à un pH de 8 à 8,5 en ajoutant un hydroxyde de métal alcalin; à séparer, à ce pH, de la préparation concentrée résultante une partie des graisses et le phosphate d'ammonium par précipitation; à ajuster jusqu'à un pH d'environ 5,2 à l'aide d'un acide; à diluer cette solution par un mélange de diéthyléther et d'éthanol; puis à laisser ce mélange au repos pendant 12h ou plus pour faire précipiter et recueillir lesdits polypeptides.
Le produit du procédé selon cette invention est présent à des concentrations faibles dans l'insuline cristallisée du commerce; il est présent à des concentrations plus élevées dans l'extrait pancréatique brut obtenu dans la séparation de l'insuline, et connu dans la technique sous le nom de gâteau salin . Le produit est présent dans la liqueur mère du procédé de cristallisation alcaline de l'insuline, et en a été extrait. Il peut également être extrait du pancréas lui-même, et d'extraits liquides bruts de pancréas.
Pour préparer le produit par le procédé de cette invention, on peut partir de préférence de pancréas entier soigneusement disséqué du corps d'un animal fraîchement tué, par exemple en vue de la production de viande. La glande est rincée et immédiatement mise au réfrigérateur. Si elle doit être conservée plus longtemps qu'une durée minimale elle doit être maintenue à l'état congelé. La quantité de glande utilisée n'est pas essentielle mais pour obtenir un rendement convenable de 30-50 milligrammes de produit, il est nécessaire d'en avoir environ 10 kilogrammes.
Toutes les opérations subséquentes décrites ci-après sont effectuées
avec élégance, dans les conditions d'hygiène, et avec l'asepsie nécessaire, à 4" C 40C+0,50. Les solvants et substances similaires sont introduits à la température indiquée.
On broie finement la glande jusqu'à un état d'émulsion
approximatif, et on met la glande broyée en contact avec de
l'alcool aqueux acidifié jusqu'à un pH d'environ 2,8. On agite la suspension résultante et ensuite on élimine les substances tissulaires insolubles par filtration. La fraction intéressante est dans la solution. Pour obtenir le pH nécessaire, on peut utiliser l'acide phosphorique, L'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique ainsi
que d'autres acides. De même, bien que l'méthanol soit le solvant de choix, on peut utiliser d'autres solvants organiques miscibles à l'eau, parmi lesquels l'acétone, d'autres cétones solubles dans l'eau, I'acétaldéhyde, d'autres aldéhydes solubles dans l'eau, etc.
On ajuste la solution acide, exempte de tissu, à pH 8-8,5 en ajoutant judicieusement l'hydroxyde de métal alcalin ou, de préférence, de l'ammoniaque aqueux. A ce pH, il précipite de la préparation concentrée résultante certains corps gras et du phosphate d'ammonium. On sépare la solution soit par décantation, soit par filtration, soit par les deux procédés.
On ajuste ensuite le pH de la solution résultante à une valeur d'environ 5,2 avec, par exemple, L'acide acétique. Ensuite on dilue cette solution avec un mélange de quatre volumes de diéthyléther et de deux volumes d'éthanol. On laisse reposer le mélange pendant une nuit ou bien une durée équivalente ou plus longue, et après ce temps presque toutes les protéines, y compris le présent produit, précipitent. On centrifuge la suspension partielle résultante et on récupère le précipité. On élimine l'eau du précipité sous vide, on le lave à l'éther pour éliminer les corps gras résiduaires s'il y en a, et ensuite on chasse l'éther résiduaire sous vide. A ce moment-là on reprend le produit séché par l'acide acétique molaire.
Diverses protéines se dissolvent dans le milieu acide; on chromatographie alors la solution sur une colonne de Séphadex G-50 (fine), la séparation se faisant approximativement selon la masse moléculaire.
Le glucagon a une masse moléculaire d'approximativement 3500. La nouvelle protéine a une masse moléculaire d'approximativement 4200 - 4231 dans une détermination de la forme bovine - tandis que l'insuline a une masse moléculaire d'approximativement 5800.
En outre, le glucagon contient un fragment tryptophane, qui confère à la molécule la capacité d'être sorbée quelque peu sur
Séphadex. Pour cette raison, la séparation sur Séphadex du glucagon et de la nouvelle protéine est un peu meilleure que ce qu'on attendrait en fonction de la masse moléculaire seule. C'est pourquoi on préfère la présente séparation sur Séphadex.
Par ce procédé, la présente protéine et quelques autres se séparent d'une matière d'aucun intérêt ici. On peut étudier l'élut par absorption ultraviolette, tout pic d'élution de protéine étant mis en évidence par une forte absorption à 276280 millimicrons.
Remarquant l'existence d'un tel maximum d'absorption, on change le moyen utilisé pour recueillir des substances, et, facultativement, on change après avoir observé le début d'un autre maximum d'absorption. Dans un autre mode opératoire, on change le moyen utilisé pour recueillir les substances en fonction de la durée, et l'observation visuelle ou un graphique par rapport à la durée indiquent quels sont les divers échantillons recueillis qui ont un intérêt. La fraction contenant la présente protéine contient habituellement aussi de l'insuline et du glucagon.
Dans un mode de réalisation préféré, on lyophilise ensuite le
mélange pour obtenir une substance sèche. On reprend alors cette
substance sèche dans un tampon de tris(hydroxyméthyl)amino
méthane 0,01 M, d'éthylènediaminetétraacétate tétrasodique
0,001 M et d'urée 7 M, le pH (initialement égal à environ 11)
de la solution résultante étant ajusté à environ 9,0 à l'aide de HCI.
Lorsque la substance sèche a été totalement dissoute dans
une quantité minimale suffisante de tampon, on chromatographie
la solution résultante sur une colonne de diéthylaminoéthyl
cellulose, en utilisant d'autres portions de la même solution
tampon comme éluant.
Dans cette élution, des traces de substances indésirables sans
intérêt ici sont tout d'abord éluées, puis le glucagon. Après le
glucagon, la protéine de cette invention est nettement éluée.
Dans le mode de réalisation préféré décrit ici, I'insuline demeure
fixée dans la colonne chromatographique. Si on le désire, on peut
l'éluer à l'aide de solutions salines plus concentrées, mais ceci
ne fait pas partie de l'invention.
Ensuite on chromatographie l'élut dans la solution tampon
sur une colonne de Séphadex G-25 (grossiers avec une solution
aqueuse d'acide acétique à 2% comme éluant. Dans cette étape
on sépare presque complètement les constituants des tampons
non aqueux. On lyophilise de nouveau la solution résultante; le
produit séché restant à la fin de la lyophilisation est la protéine
de l'invention.
L'exécution élégante des différentes étapes détaillées ici conduit
avec certitude au produit. Cependant, on peut ultérieurement le
caractériser rapidement si on le désire, de la manière suivante.
Une première étape de caractérisation préférée est l'analyse
de l'aminoacide terminal en N. On fait réagir une partie du
produit d'une manière connue avec le chlorure de 1-diméthyl-
aminonaphtalène-5-sulfonyle: ce composé forme un produit d'addi
tion terminale en N. On hydrolyse le produit d'addition, ce qui
sépare l'aminoacide terminal sous forme dudit produit d'addition.
On partage ensuite celui-ci par chromatographie en couche mince
et on recherche en lumière ultraviolette une tache fluorescente
unique du produit d'addition du chlorure de l-diméthylamino
naphtalène-5-sulfonyle et de l'alanine.
Lorsque les résultats de cette expérience sont satisfaisants,
on examine le produit par électrophorèse sur gel et disque de
polyacrylamide dans un tampon de tris-borate en partant d'une
concentration en produit égal à 0,1%. Après deux heures sous
un courant d'électrophorèse constant de 2 milliampères, on colore
le gel avec du Bleu Brillant Coomassie à une concentration d'en
viron 0,025% dans une solution aqueuse d'acide trichloracétique
à 10%. Cette expérience devrait avoir pour résultat une zone
bleue unique d'intensité importante, représentant la seule pré
sente protéine.
Si cette expérience donne des résultats satisfaisants, on peut, si on le désire, soumettre l'échantillon à une analyse partielle ou totale de la séquence d'aminoacides.
Le produit isolé, sec, est une substance cristalline blanche qui se décompose à la chaleur avant que l'on puisse déterminer sa température de fusion nette. L'analyse a une série d'étapes soustractives (Edman) qui conduit à la formule développée attribuée ci-dessus.
Le produit a divers effets biologiques. Il augmente la mobilité de l'intestin, provoque la constriction du canal cholédoque et le relâchement de la vésicule biliaire.
Il est utile comme laxatif vétérinaire ne nécessitant pas d'ingestion orale. Utilisé dans ce but, il est administré de toute manière connue par laquelle le polypeptide non dénaturé entre dans la circulation sanguine. L'administration de la substance entraîne l'expulsion involontaire du contenu du côlon. Lorsqu'on désire obtenir des effets rapides, on administre le composé par voie intraveineuse. Lorsqu'on désire un effet plus prolongé, à démarrage plus lent, on l'administre par voie sous-cutanée dans une région bien alimentée à circulation périphérique et sous forme d'un composé retard d'où il est lentement mobilisé par la circulation sanguine.
On ajuste les doses posologiques en fonction des espèces animales, de l'importance de la réponse désirée et d'autres facteurs qu'on a l'habitude de prendre en considération dans la détermination des doses posologiques. A titre d'indication, on peut dire que les propriétés du produit de cette invention se sont bien manifestées chez des chiens auxquels on a fait des injections intraveineuses de 5 à 50 microgrammes par kilogramme de poids corporel. Des doses aussi faibles que 0,5 microgramme par kilogramme sont également efficaces.
This invention is directed to novel proteins or new polypeptides of molecular weights intermediate between those of insulin and glucagon, as well as to their method of preparation.
The present protein, usually extracted from the pancreas of bovine animals, is represented (using normal nomenclature abbreviations for polypeptides: see 67 JACS 1524, 1530) by the formula Nn2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Gln-Tyr -Pro-Gly-Asp.Asp-Ala-
6 12 Thr-Pro.Glu-Gln-Met-Ala.Gln-Tyr-Ala.Ala-Glu-Leu.Arg.
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As is understood in the art of natural polypeptides, all amino acid moieties are of the levorotatory optical isomer form.
The corresponding polypeptide from porcine pancreas is identical to that shown above, except that at position 6, where the bovine polypeptide presents glutamine, the porcine polypeptide presents a valine. Likewise, the polypeptide of ovine origin differs from that of bovine origin in that it presents a serine, in position 2, where the polypeptide of bovine origin presents a proline; and the polypeptide of human origin differs from the polypeptide of bovine origin in that it exhibits an asparagine at a point thought to be at position 23, but which may be at position 15, where the polypeptide d The bovine origin exhibits a glutamine, in addition to a difference represented by the replacement of a glutamine by a valine in position 6 as in the substance of porcine origin.
These minor specific differences are well known in the art of glandular extracts: the substances exhibit similar chemical and pharmacological behaviors and, in use, one can substitute for one another, or one can use a mixture.
Thus, in one form of representation, the protein obtained by the process according to the invention has the following constitution: NH2-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro -Gly-Asp-Asp-Ala-Thr -
6 12 13 Pro-Z-Gln-Mèt-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg-Arg-Tyr-
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where, in the particular embodiments, X, Y, Z and Z 'have these meanings
Protein X Y Z Z '
Bovine Pro Gln Glu Glu
Pork Pro Val Glu Glu
Ovine Ser Gln Glu Glu
Human Pro Val Glu Asn or
Pro Val Asn Glu
The method according to the invention for the production of said protein consists in grinding the pancreatic gland of an animal until an approximate state of emulsion is obtained in a solvent immiscible with water; contacting said gland with acidified aqueous alcohol to a pH of about 2.8; separating insoluble tissue substances by filtration;
adjusting the solution to a pH of 8 to 8.5 by adding an alkali metal hydroxide; in separating, at this pH, from the resulting concentrated preparation a part of the fats and the ammonium phosphate by precipitation; adjusting to a pH of about 5.2 with an acid; in diluting this solution with a mixture of diethyl ether and ethanol; then leaving this mixture to stand for 12 hours or more to precipitate and collect said polypeptides.
The product of the process according to this invention is present at low concentrations in commercial crystallized insulin; it is present in higher concentrations in the crude pancreatic extract obtained in the separation of insulin, and known in the art as salt cake. The product is present in and extracted from the mother liquor of the alkaline insulin crystallization process. It can also be extracted from the pancreas itself, and from crude liquid extracts from the pancreas.
To prepare the product by the process of this invention, one can preferably start from whole pancreas carefully dissected from the body of a freshly killed animal, for example for the production of meat. The gland is rinsed and immediately put in the refrigerator. If it is to be kept longer than a minimum period, it should be kept frozen. The amount of gland used is not essential but to obtain a suitable yield of 30-50 milligrams of product it is necessary to have about 10 kilograms.
All subsequent operations described below are carried out
elegantly, hygienically and with the necessary asepsis, at 4 "C 40C + 0.50. Solvents and similar substances are introduced at the indicated temperature.
The gland is finely ground to a state of emulsion
approximate, and the crushed gland is placed in contact with
aqueous alcohol acidified to a pH of about 2.8. The resulting suspension is stirred and then insoluble tissue substances are removed by filtration. The interesting fraction is in the solution. To obtain the necessary pH, one can use phosphoric acid, hydrochloric acid or sulfuric acid as well
than other acids. Likewise, although methanol is the solvent of choice, other water-miscible organic solvents can be used, including acetone, other water-soluble ketones, acetaldehyde, other water soluble aldehydes, etc.
The acidic, tissue-free solution is adjusted to pH 8-8.5 by the appropriate addition of alkali metal hydroxide or, preferably, aqueous ammonia. At this pH, it precipitates from the resulting concentrated preparation certain fatty substances and ammonium phosphate. The solution is separated either by decantation, or by filtration, or by both methods.
The pH of the resulting solution is then adjusted to a value of about 5.2 with, for example, acetic acid. This solution is then diluted with a mixture of four volumes of diethyl ether and two volumes of ethanol. The mixture is allowed to stand overnight or an equivalent or longer time, and after this time almost all the proteins, including the present product, precipitate. The resulting partial suspension is centrifuged and the precipitate is collected. The water is removed from the precipitate in vacuo, washed with ether to remove the residual fatty substances, if any, and then the residual ether is removed in vacuo. At this time, the dried product is taken up in molar acetic acid.
Various proteins dissolve in the acidic medium; the solution is then chromatographed on a Sephadex G-50 (fine) column, the separation taking place approximately according to the molecular mass.
Glucagon has a molecular weight of approximately 3500. The new protein has a molecular weight of approximately 4200 - 4231 in bovine form determination - while insulin has a molecular weight of approximately 5800.
In addition, glucagon contains a tryptophan moiety, which gives the molecule the ability to be somewhat sorbed on
Sephadex. For this reason, the Sephadex separation of glucagon and the new protein is somewhat better than one would expect based on molecular weight alone. This is why the present separation is preferred over Sephadex.
By this process, the present protein and a few others are separated from material of no interest herein. The elute can be studied by ultraviolet absorption, any peak of protein elution being evidenced by strong absorption at 276280 millimicrons.
Noticing the existence of such an absorption maximum, one changes the means used to collect substances, and, optionally, one changes after observing the onset of another maximum of absorption. In another procedure, the means used to collect the substances are changed as a function of time, and visual observation or a graph against time indicates which of the various samples collected are of interest. The fraction containing the present protein usually also contains insulin and glucagon.
In a preferred embodiment, the
mixture to obtain a dry substance. We then take this
dry substance in a tris (hydroxymethyl) amino buffer
0.01 M methane, tetrasodium ethylenediaminetetraacetate
0.001 M and 7 M urea, pH (initially equal to about 11)
of the resulting solution being adjusted to about 9.0 with HCl.
When the dry substance has been completely dissolved in
a sufficient minimum quantity of buffer, chromatography
the resulting solution on a diethylaminoethyl column
cellulose, using other portions of the same solution
buffer as eluent.
In this elution, traces of undesirable substances without
interest here are first eluted, then glucagon. After the
glucagon, the protein of this invention clearly elutes.
In the preferred embodiment described herein, the insulin remains
fixed in the chromatographic column. If we want, we can
elute it using more concentrated saline solutions, but this
is not part of the invention.
Then the elute is chromatographed in the buffer solution
on a Sephadex G-25 column (coarse with a solution
2% aqueous acetic acid as eluent. In this step
the constituents of the tampons are almost completely separated
non-aqueous. The resulting solution is freeze-dried again; the
dried product remaining at the end of freeze-drying is protein
of the invention.
The elegant execution of the different steps detailed here leads
with certainty to the product. However, it can later be
characterize quickly if desired, as follows.
A preferred first step of characterization is the analysis
N terminal amino acid. Part of the
produced in a known manner with 1-dimethyl chloride
aminonaphthalene-5-sulfonyl: this compound forms a product of add
end in N. The adduct is hydrolyzed, resulting in
separates the terminal amino acid as said adduct.
This is then partitioned by thin layer chromatography
and we look for a fluorescent spot in ultraviolet light
sole of the adduct of l-dimethylamino chloride
Naphthalene-5-sulfonyl and alanine.
When the results of this experiment are satisfactory,
the product is examined by gel and disc electrophoresis of
polyacrylamide in a tris-borate buffer starting from a
product concentration equal to 0.1%. After two hours under
a constant electrophoresis current of 2 milliamperes, we color
gel with Coomassie Brilliant Blue at a concentration of
about 0.025% in aqueous solution of trichloroacetic acid
at 10%. This experiment should result in an area
unique blue of significant intensity, representing the only
smells like protein.
If this experiment gives satisfactory results, the sample may, if desired, be subjected to partial or total amino acid sequence analysis.
The isolated, dry product is a white crystalline substance which decomposes on heat before its net melting point can be determined. The analysis has a series of subtractive steps (Edman) which leads to the structural formula attributed above.
The product has various biological effects. It increases the mobility of the intestine, causes constriction of the common bile duct and sagging of the gallbladder.
It is useful as a veterinary laxative which does not require oral ingestion. Used for this purpose, it is administered in any known manner by which the undenatured polypeptide enters the bloodstream. Administration of the substance results in the involuntary expulsion of the contents of the colon. When it is desired to obtain rapid effects, the compound is administered intravenously. When a more prolonged, slower onset effect is desired, it is administered subcutaneously in a well-supplied region with peripheral circulation and in the form of a depot compound from which it is slowly mobilized by the bloodstream. .
Dosage doses are adjusted depending on the animal species, the magnitude of the desired response, and other factors which are usually considered in determining dosage doses. As an indication, it can be said that the properties of the product of this invention have been well manifested in dogs which have been given intravenous injections of 5 to 50 micrograms per kilogram of body weight. Doses as low as 0.5 microgram per kilogram are also effective.