Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer therapeutisch wirksamer Derivate der 7 Aminocephalosporansäure (ACA) der Formel I
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worin R1 einen über eines seiner Stickstoffatome gebundenen Tetrazolylrest bedeutet und R2 eine N-monosub stitvierte Carbamoyloxygruppe bedeutet, in welcher gegebenenfalls der Carbamoylsauerstoff durch Schwefel ersetzt ist, und ihrer Salze.
Eine substituierte Carbamoyloxygruppe ist z.B. eine Gruppe der Formel 4-CO-NH-R3, worin R3 ein aliphatischer, aromatischer, araliphatischer oder heterocyclischer Rest, besonders ein unsubstituierter, gerader oder verzweigter Niederalkylrest, wie der Methyl-, Äthyl-, vor allem aber der p-Chloräthylrest, ist.
R2 kann weiter eine Thiocarbamoyloxygruppe der Formel
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sein, worin R3 die oben angegebene Bedeutung hat und R4 für Wasserstoff steht.
Die Salze der neuen Verbindungen können Metallsalze, vor allem solche von therapeutisch anwendbaren Alkali- oder Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, oder Salze mit organischen Basen, z.B. Triäthylamin, N-Äthylpiperidin, Dibenzylamin, N -Benzyl - p- phenetylamin, N,N' - Dibenzyläthylendiamin, Procain, Ephenamin, sein.
Die neuen Verbindungen weisen eine besonders gute antibakterielle Wirkung auf. Sie sind sowohl gegenüber grampositiven wie vor allem auch gegenüber gramnegativen Bakterien wirksam, z.B. gegen Staphylococcus aureus penicillin-resistent. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhosa und Bacterium proteus, wie sich auch im Tierversuch, z.B. an Mäusen, zeigt. An diesen sind bei subcutanen Anwendung, je nach Art der bakteriellen Infektion, 0,1-100 mg/kg chemotherapeutisch wirksam. Die Verbindungen können daher zur Be kämpfung von Infektionen, die durch solche Mikroorganismen hervorgerufen werden, verwendet werden, ferner als Futtermittelzusätze, zur Konservierung von Nahrungsmitteln oder als Desinfektionsmittel.
Die neuen Verbindungen können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Erfindungsgemäss werden sie erhalten, wenn man eine Verbindung der Formel II
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oder ein Salz davon, worin R1 die angegebene Bedeutung hat, unter Bildung des Restes R3 acyliert.
Wenn erwünscht, kann man die erhaltenen Verbtin- dungen in ihre therapeutisch verwendbaren Metall-, wie Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, oder Salze mit Ammo niak oder organischen Basen überführen oder aus erhaltenen Salzen die freien Carbonsäuren bilden.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten 7-Amino-O-des acetyl-cephalosporansäurederivate sind bekannt oder können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. nach dem Verfahren des englischen Patentes Nr. 1 080904.
Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen die Reaktionskomponenten gegebenenfalls in Form ihrer Salze vorliegen.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z.B.
in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, topicale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen, festen oder flüssigen Trägermaterial.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
In der Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten werden die folgenden Systeme verwendet: System 52 = n-Butanol < Eisessig-Wasser (75 : 7,5 : 21) System 101A = n - Butanol - Pyridin -Eisessig-Wasser (42:24:4:30)
Beispiel 1
9,61 g rohes Natriumsalz der 7-[Tetrazolyl(1)-acetyl amino]-O-desacetyl-cephlalosporansäure werden in 100 ml absolutem Dimethylformamid suspendiert und an schllessend 0,15 ml (Bu3Sn)2O (Tributylzinnoxyd) zugegeben. Dann tropft man während 15 Minuten eine Lösung von 10,6 ml ,3-Chloräthylisocyanat in 45 ml Dime thylformamid ein und rührt noch eine Stunde weiter.
Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. -Der harzartige Rückstand wird dreimal mit je 500 ml abs. Äther verrieben (ätherlöslicher Anteil: 4,03 g Öl verworfen) und dann in 250 ml 10%igem Phosphatpuffer vom pH 6,7 aufgenommen. Man extrahiert nacheinander mit 1,5 1 und 0,5 1 Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 100 ml Puffer pH 6,7 rückextrahiert und dann verworfen.
Die wässerigen Phasen werden vereinigt, mit 1,5 Liter Essigester überschichtet, durch Zugabe von 2 n. Salzsäure und Schütteln auf pH 2,4 eingestellt und die Phasen getrennt. Nach Sättigung mit Kochsalz wird die wässerige Phase noch zweimal mit je 1 Liter Essigester extralsiert, die organischen Phasen sukzessive zweimal je 200 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im -Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhält 6,32 g eines amorphen Rückstandes, woraus sich mittels Natrium-a-äthylhexanoat das Natriumsalz (Rohprodukt) gewinnen lässt. Dieses wird durch Ansäuren und Extraktion mittels Essigester in die kristalline Säureform zurückgeführt.
Daraus lässt sich auf die oben beschriebene Weise das reine kristalline Natriumsalz der O-lDesacetyl - O-(ss-chloräthylcarbamoyl)-7-[tetrazolyl(1)- -acetylamino]-cephalosporansäure gewinnen. UV-Spektrum Àmax = 260 mn (e = 9200). Optische Drehung = = + 1210 + 10 (c = 1 in Wasser). Dünnschicht- chromatogramm an Silicagel: Rf1olA = 0,5; Rf 52 = 0.23.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
3,93 g 7-Bromacetylaminocephalosporansäure werden in 25 ml Methylenchlorid unter Zugabe von 3,45 ml N,N Diisopropyläthylamlin gelöst. Dazu gibt man eine Lösung, die durch Auflösen von 0,84 g Tetrazol in 5 ml Dimethylformamid und anschliessendes Verdünnen mit 10 ml Methylenchlorid hergestellt worden ist. Mit 7 ml Methy- lenchlorid wird nachgespült.
Nach 30 Stunden wird das Reaktionsgemisch mit 40 ml einer 10%igen Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung versetzt und das pH in der wässerigen Phase durch Zugabe von wenig 2n--Natriumcarbonat-Lösung auf 5,2 eingestellt. Man schüttelt durch und trennt dann die beiden Phasen. Die wässerige Phase wird noch einmal mit 100 ml Essigester extrahiert und die beiden organischen Lösungen werden verworfen, nachdem sie zuvor zweimal mit je 20 ml 1/15-m. Phosphatpuffer pH 5 gewaschen worden sind.
Die vereinigten wässerigen ,Phasen werden mit 500 ml Essigester überschichtet, mit n-Salzsäure unter Schütteln auf pH 2,6 gestellt und mit Kochsalz gesättigt. Nach Abtrennung der organischen Phase wird die wässerige Lösung noch weiter mit 200, 100 und 100 ml Essigester nachextrahiert. Die Essigester-Lösungen werden nacheinander mit 40 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhält zunächst 3,5 g eines gelblichen Harzes. Dieses wird in 15 ml Methanol gelöst, mit 4,0 ml einer 3-m. methanolischen Lösung von Natrium -loc-äthylhexanoat und anschliessend langsam mit Äther versetzt.
Nach halbstündigem Stehen bei 0 lassen sich 3,6 g kristallines Natriumsalz der 7-[Tetrazolyl(1)-acetyl- aminol-cephalosporansäure durch Filtration isolieren. Die kristalline Säure gewinnt man durch Rückextraktion in Essigester bei pH 2.
Rf52 = 0,17; RflOlA = 0 > 47 [α]D20 = + 157 + 10 (c = 1, im Wasser als Natrium- salz) 13V-Spektrum -im Wasser als Natriumsalz: man = 260 mp ( = 7900)
10,2 g Natriumsalz von 7-fTetrazol(1)-acetylamino]- -cephalosporansäure werden in 300 ml Wasser gelöst, auf 370 erwärmt und mittels 0,2 n. Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt.Dann gibt man eine Aufschlämmung von 240 mg Acetylesterase (aus Bacillus subtilis ATCC 6633, vgl.
belgisches Patent 1 904) in ca. 5 mi Wasser dazu und neutralisiert die gebildete Essigsäure laufend mit 0,2 n.
Natronlauge (tLinstellung auf pH 7,5; Temperatur 370).
Nach 5¸ Stunden ist die reaktion beendet. Man stellt das pH auf 6,5 ein, filtriert die Lösung durch eine Glasfritte G4 und lyophilisiert. Es resultieren 11,49 g eines gelblichen Harzes des Natriumsalzes der 7-[Tetrazolyl(1) -acetylamino]-O-desacetyl-cephalosporansäure.
Beispiel 2
9,15 g Natriumsalz von 7-[Tetrazolyl(1)-acetylamino]- -cephalosporansäure werden in 270 ml Wasser gelöst und bei 370 mittels 240 mg Acetylesterase in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise in das Natriumsalz der 7-l[Tetrazo- lyl(!1)-acetylamino]O-desacetyl-cephalosporansäure über- -geführtl(10,3 g).
IDieses Produkt wird in 100 ml absolutem Dimethylformamid suspendiertund mit 0,16 ml Tri-n-butylzinnoxyd [(Bu3Sn)2O] versetzt. Dann tropft man während 5 Minuten, unter Kühlung eine Lösung von 8,1 g (10,8 ml) Methylisocyanat in 45 mi Dimethylformamid ein und rührt noch 1 Stunde weiter. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und ,das Filtrat im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der harzartige Rückstand wird dreimal mit je 500 ml absolutem Äther verrieben (der ätherlösliche Anteil abgetrennt und verworfen) und dann in 250 ml 10%.
igem Phosphatpuffer vom pH 6,7 aufgenommen. Man extrahiert nacheinander mit 1,5 Liter und 0,5 Liter Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 100 ml Puffer vom pH 6,7 rückextrahiert und dann verworfen. Die wässerigen Phasen werden vereinigt, mit 1,5 Liter Essigester überschichtet, durch Zugabe von 5-n. Salzsäure und Schütteln auf pH 2,4 eingestellt und die Phasen getrennt. Nach Sättigung mit Kochsalz wird die wässerige Phase noch dreimal mit je 1 Liter Essigester extrahiert.
Die organischen Phasen werden sukzessive mit zweimal je 200 ml gesättigter Kochsalziösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und durch eine Säule (Durchmesser 4,5 cm) von 100 g Silicagel filtriert. Man wäscht die Säule mit 500 ml Essigester nach und dampft die vereinigten Essigestereluate im Vakuum zur Trockne ein.
Es resultiert ein amorpher Rückstand von 4,7 g. Diesen nimmt man in 20 ml Aceton auf, worin er grösstenteils in Lösung geht. Durch Zugabe von 80 ml Chloroform entsteht ein hellbraunes Präcipitat, das durch Filtration abgetrennt und anschliessend nochmals der gleichen Ace ton/Chloroform-lBehandlung unterworfen wird. Das daraus resultierende Präcipitat (1,2 g) wird in 40 ml Methanol aufgenommen und nach Zugabe von 1,7 ml methanolischem Natrium! äthylhexanoat +(3 m) in Lösung gebracht. Mittels einer Spatelspitze Norit (Aktivkohle) und anschliessende Filtration durch Celite wird entfärbt und anschliessend auf ein Volumen von ca. 10 ml eingeengt.
Man erhält auf diese Weise das kristalline Natriumsalz, das abtlltn.ert und mit Aceton gewaschen wird.
Die bei der oben beschriebenen Aceton/Chloroform-Be- handlung angefallenen Filtrate werden sukzessive auf eine Säule von 100 g Silicagel (Durchmesser 3 cm, Höhe 27,5 cm) gegeben. Man chromatographiert durch langsame Steigerung des Acetongehaltes im Elutionsmittel. Bei einem Volumenverhältnis von Aceton-Chloroform 1: 3 wird die gewünschte Substanz eluiert. Man führt sie in der oben beschriebenen Weise in das kristalline Natriumsalz über.
IDie vereinigten Natriumsalz Fraktionen (ca. 90%ig rein) werden zur weiteren Reinigung nochmals in die Säureform übergeführt. Dazu löst man in 30 ml Wasser, überschichtet mit 300 ml Essigester, stellt mittels verdünnter Salzsäure auf pH 2,4 ein und sättigt mit Kochsalz.
Nach der Phasentrennung wird die wässerige Phase mit 200 und 100 ml Essigester nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, durch eine Säule von 10 g Silicagel filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. tDen Rückstand führt man mittels 3-m. methanolischer Lösung von Natrium--äthyl- hexanoat direkt in das reine, kristalline Natriumsalz der O-Desacetyl-O-methylcarbamoyl - 7-[tetrazolyl(1) - acetylamino]-cephalosporansäure über.
UV-Spektrum: Xmax 262 nm (s = 8450) Optische Drehung: Coll,"o = + 1270 + 10 (c = 0,98 in Wasser) Dünnschichtchromatogramm an Silicagel: Rf52 = 0,17, RflolA = 0,40.
Beispiel 3
9,15 g Natriumsalz von 7-[[Tetrazolyl(1)-acetylamino]- -cephalosporanXsäure werden in 270 ml Wasser gelöst und bei 370 mittels 240 mg Acetylesterase in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise in das Natriumsalz der 7-[Tetrazolyl(1) - acetylamino] -0- desacetyl - cephalosporansäure übergeführt (10,3 g).
Dieses Rohprodukt wird in 100 ml absolutem Dimethylformamid suspendiert und mit 0,16 ml Tri-n-butylzinnoxyd [(BuSn)2O] versetzt. Dann tropft man während 5 Minuten unter Kühlung in eine Lösung von 11,2 ml Äthylisocyanat in 45 ml Dimethylformamid ein und rührt noch 1 Stunde weiter. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der harzartige Rückstand wird dreimal mit je 500 ml absolutem Äther verrieben (der ätherlösliche Anteil abgetrennt und verworfen) und dann in 250 ml 10%igem Phosphatpuffer von pH 6,7 aufgenommen. Man extrahiert nacheinander mit 1,5 Liter und 0,5 Liter Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 100 ml Puffer vom pH 6,7 rückextrahiert und dann verworfen.
Die wässerigen Phasen werden vereinigt, mit 1,5 Liter Essigester überschichtet, durch Zugabe von 5-n.
Salzsäure und Schütteln auf pH 2,4 eingestellt und die Phasen getrennt. Nach Sättigung mit Kochsalz wird die wässerige Phase noch dreimal mit je 1 Liter Essigester extrahiert. Die organischen Phasen werden sukzessive mit zweimal je 200 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und durch eine Säule (Durchmesser 4,5 cm) von 100 g Silicagel filtriert. Man wäscht die Säule mit 500 ml frischem Essigester nach und dampft die vereinigten Essigestereluate im Vakuum zur Trockne ein. Es resultiert ein amorpher Rückstand von 5,49 g. Diesen nimmt man in 20 ml Aceton auf, worin er teilweise in Lösung geht. iDurch Zugabe von 80 ml Chloroform entsteht ein hellbraunes Präcipitat, das durch Filtration abgetrennt und anschliessend nochmals der gleichen Aceton/Chloroform-Behandlung unterworfen wird.
Das daraus resultierende Präcipitat 1(2,8 g) wird in 80 ml Methanol aufgenommen und nach Zugabe von 3,6 ml methanolischem Natrium-,a-äthylhexanoat f3 m) in Lösung gebracht. Mittels einer Spatelspitze Norit (Aktivkohle) und anschliessende Filtration durch Celite wird entfärbt und anschliessend auf ein Volumen von ca. 5 ml eingeengt. Man erhält auf diese Weise das kristalline Na triumsa3z, das abfiltriert und mit Chloroform gewaschen wird. Die bei der oben beschriebenen Aceton/Chloroform-Behandlung angefallenen Filtrate werden sukzessive auf eine Säule von 100 g Silicagel (Durchmesser 3 cm, Höhe 27,5 cm) gegeben. Man chromatographiert durch langsame Steigerung des Acetongehaltes im Elutionsmittel.
Bei einem Voiumverhältnis von Aceton-Chloroform 1 :3 wird die gewünschte Substanz eluiert. Man führt sie in der oben beschriebenen Weise in das kristalline Natriumsalz über.
Die vereinigten Natriumsalz-Fraktionen (ca. 90%ig reine werden zur weiteren Reinigung nochmals in die Säureform übergeführt. Dazu löst man in 35 ml Wasser, überschichtet mit 350 ml Essigester, stellt mittels verdünnter Salzsäure auf pH 2,4 ein und sättigt mit Kochsalz. Nach der Phasentrennung wird die wässerige Phase mit 250 und 150 ml Essigester nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, durch eine Säule von 15 g Silicagel filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Den Rückstand führt man mittels 3-m. methanolischer Lösung von Natrium-z,- -äthylhexanoat direkt in das reine, kristalline Natriumsalz der O-Desacetyl-O-äthylcarbamoyl-7- [tetrazolyl( 1 )-acetyl aminocephalosporansäure über.
Uv-Spektmm man 261 nu (± = 8550) Optische Drehung CO;]D20 = + 1240 + 10 (c = 0,98 in Wasser) Dünnschichtchromatogramm an Silicagel: Rf,- = 0,21, RflolA = 0,44
The invention relates to a process for the preparation of new therapeutically effective derivatives of 7 aminocephalosporanic acid (ACA) of the formula I
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where R1 signifies a tetrazolyl radical bonded via one of its nitrogen atoms and R2 signifies an N-monosubstituted carbamoyloxy group in which the carbamoyl oxygen is optionally replaced by sulfur, and its salts.
A substituted carbamoyloxy group is e.g. a group of the formula 4-CO-NH-R3, in which R3 is an aliphatic, aromatic, araliphatic or heterocyclic radical, especially an unsubstituted, straight or branched lower alkyl radical, such as methyl, ethyl, but especially p-chloroethyl radical .
R2 can furthermore be a thiocarbamoyloxy group of the formula
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where R3 has the meaning given above and R4 is hydrogen.
The salts of the new compounds can be metal salts, especially those of therapeutically applicable alkali or alkaline earth metals, such as sodium, potassium, ammonium, calcium, or salts with organic bases, e.g. Triethylamine, N-ethylpiperidine, dibenzylamine, N -benzyl-p-phenetylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, procaine, ephenamine.
The new compounds have a particularly good antibacterial effect. They are effective against both gram-positive and especially against gram-negative bacteria, e.g. resistant to Staphylococcus aureus penicillin. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhosa and Bacterium proteus, as also found in animal experiments, e.g. on mice, shows. With subcutaneous application, 0.1-100 mg / kg are chemotherapeutically effective on these, depending on the type of bacterial infection. The compounds can therefore be used to combat infections caused by such microorganisms, and also as feed additives, for preserving food or as disinfectants.
The new compounds can be prepared by methods known per se. According to the invention, they are obtained when a compound of the formula II
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or a salt thereof, in which R1 has the meaning given, is acylated to form the radical R3.
If desired, the compounds obtained can be converted into their therapeutically useful metal salts, such as alkali or alkaline earth metal salts, or salts with ammonia or organic bases, or the free carboxylic acids can be formed from the salts obtained.
The 7-amino-O-des acetyl-cephalosporanic acid derivatives used as starting materials are known or can be prepared by processes known per se, e.g. according to the method of English patent no. 1 080904.
The invention also relates to those embodiments of the process in which the reaction components are optionally present in the form of their salts.
The new compounds can be used as medicaments, e.g.
in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic, solid or liquid carrier material suitable for enteral, topical or parenteral administration.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
The following systems are used in thin-layer chromatography on silica gel plates: System 52 = n-butanol <glacial acetic acid-water (75: 7.5: 21) System 101A = n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (42: 24: 4: 30 )
example 1
9.61 g of the crude sodium salt of 7- [tetrazolyl (1) acetyl amino] -O-deacetyl-cephlalosporanic acid are suspended in 100 ml of absolute dimethylformamide and 0.15 ml (Bu3Sn) 2O (tributyltin oxide) are then added. A solution of 10.6 ml of 3-chloroethyl isocyanate in 45 ml of dimethylformamide is then added dropwise over the course of 15 minutes and the mixture is stirred for a further hour.
The reaction mixture is filtered and the filtrate is evaporated to dryness in a high vacuum. -The resinous residue is three times with 500 ml abs. Ether triturated (ether-soluble portion: 4.03 g of oil discarded) and then taken up in 250 ml of 10% phosphate buffer of pH 6.7. It is extracted successively with 1.5 l and 0.5 l of ethyl acetate. The organic phases are back-extracted twice with 100 ml of buffer pH 6.7 each time and then discarded.
The aqueous phases are combined, covered with a layer of 1.5 liters of ethyl acetate, adjusted to pH 2.4 by adding 2N hydrochloric acid and shaking, and the phases are separated. After saturation with sodium chloride, the aqueous phase is extracted twice with 1 liter of ethyl acetate each time, the organic phases are successively washed twice with 200 ml of saturated sodium chloride solution each time, dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in a vacuum. 6.32 g of an amorphous residue are obtained, from which the sodium salt (crude product) can be obtained by means of sodium a-ethylhexanoate. This is returned to the crystalline acid form by acidification and extraction with ethyl acetate.
The pure crystalline sodium salt of O-ldesacetyl-O- (ss-chloroethylcarbamoyl) -7- [tetrazolyl (1) - -acetylamino] -cephalosporanic acid can be obtained therefrom in the manner described above. UV spectrum Àmax = 260 mn (e = 9200). Optical rotation = = + 1210 + 10 (c = 1 in water). Thin-layer chromatogram on silica gel: Rf1olA = 0.5; Rf 52 = 0.23.
The starting material can be made as follows:
3.93 g of 7-bromoacetylaminocephalosporanic acid are dissolved in 25 ml of methylene chloride with the addition of 3.45 ml of N, N diisopropylethylamline. A solution is added which has been prepared by dissolving 0.84 g of tetrazole in 5 ml of dimethylformamide and then diluting with 10 ml of methylene chloride. It is rinsed with 7 ml of methylene chloride.
After 30 hours, 40 ml of a 10% strength potassium dihydrogen phosphate solution are added to the reaction mixture and the pH in the aqueous phase is adjusted to 5.2 by adding a little 2N sodium carbonate solution. Shake well and then separate the two phases. The aqueous phase is extracted once more with 100 ml of ethyl acetate and the two organic solutions are discarded after they have been previously treated twice with 20 ml of 1/15-m. Phosphate buffer pH 5 have been washed.
The combined aqueous phases are covered with a layer of 500 ml of ethyl acetate, adjusted to pH 2.6 with n-hydrochloric acid with shaking and saturated with sodium chloride. After the organic phase has been separated off, the aqueous solution is further extracted with 200, 100 and 100 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate solutions are washed successively with 40 ml of saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. First 3.5 g of a yellowish resin are obtained. This is dissolved in 15 ml of methanol, with 4.0 ml of a 3-m. methanolic solution of sodium loc-ethylhexanoate and then slowly mixed with ether.
After standing at 0 for half an hour, 3.6 g of crystalline sodium salt of 7- [tetrazolyl (1) -acetyl-aminol-cephalosporanic acid can be isolated by filtration. The crystalline acid is obtained by back-extraction in ethyl acetate at pH 2.
Rf52 = 0.17; RflOlA = 0> 47 [α] D20 = + 157 + 10 (c = 1, in water as sodium salt) 13V spectrum - in water as sodium salt: man = 260 mp (= 7900)
10.2 g of the sodium salt of 7-tetrazol (1) -acetylamino] - -cephalosporanic acid are dissolved in 300 ml of water, heated to 370 and adjusted to pH 7.5 with 0.2N sodium hydroxide solution. Then a suspension of 240 is added mg acetylesterase (from Bacillus subtilis ATCC 6633, cf.
Belgian patent 1 904) in approx. 5 ml of water and neutralizes the acetic acid formed continuously with 0.2 N.
Sodium hydroxide solution (adjustment to pH 7.5; temperature 370).
The reaction is over after 5¸ hours. The pH is adjusted to 6.5, the solution is filtered through a G4 glass frit and lyophilized. 11.49 g of a yellowish resin of the sodium salt of 7- [tetrazolyl (1) -acetylamino] -O-deacetyl-cephalosporanic acid result.
Example 2
9.15 g of the sodium salt of 7- [tetrazolyl (1) -acetylamino] - -cephalosporanic acid are dissolved in 270 ml of water and converted at 370 using 240 mg of acetylesterase in the manner described in Example 1 into the sodium salt of the 7-l [tetrazolyl (! 1) -acetylamino] O-desacetyl-cephalosporanic acid converted (10.3 g).
This product is suspended in 100 ml of absolute dimethylformamide, and 0.16 ml of tri-n-butyltin oxide [(Bu3Sn) 2O] is added. A solution of 8.1 g (10.8 ml) of methyl isocyanate in 45 ml of dimethylformamide is then added dropwise over the course of 5 minutes, with cooling, and stirring is continued for a further hour. The reaction mixture is filtered and the filtrate is evaporated to dryness in a high vacuum. The resinous residue is triturated three times with 500 ml of absolute ether each time (the ether-soluble fraction is separated off and discarded) and then in 250 ml of 10%.
igem phosphate buffer of pH 6.7 was added. It is extracted successively with 1.5 liters and 0.5 liters of ethyl acetate. The organic phases are back-extracted twice with 100 ml of pH 6.7 buffer each time and then discarded. The aqueous phases are combined, covered with 1.5 liters of ethyl acetate, by adding 5-n. Hydrochloric acid and shaking adjusted to pH 2.4 and the phases separated. After saturation with common salt, the aqueous phase is extracted three times with 1 liter of ethyl acetate each time.
The organic phases are washed successively with twice 200 ml of saturated sodium chloride solution each time, dried with sodium sulfate and filtered through a column (diameter 4.5 cm) of 100 g of silica gel. The column is washed with 500 ml of ethyl acetate and the combined ethyl acetate eluates are evaporated to dryness in vacuo.
An amorphous residue of 4.7 g results. This is taken up in 20 ml of acetone, in which it largely goes into solution. The addition of 80 ml of chloroform produces a light brown precipitate which is separated off by filtration and then subjected again to the same acetone / chloroform treatment. The precipitate resulting therefrom (1.2 g) is taken up in 40 ml of methanol and, after the addition of 1.7 ml of methanolic sodium! ethyl hexanoate + (3 m) brought into solution. With a spatula tip Norit (activated charcoal) and subsequent filtration through Celite, it is decolorized and then concentrated to a volume of approx. 10 ml.
In this way, the crystalline sodium salt is obtained, which is separated off and washed with acetone.
The filtrates obtained during the acetone / chloroform treatment described above are successively placed on a column of 100 g of silica gel (diameter 3 cm, height 27.5 cm). It is chromatographed by slowly increasing the acetone content in the eluent. The desired substance is eluted at a volume ratio of acetone-chloroform 1: 3. They are converted into the crystalline sodium salt in the manner described above.
The combined sodium salt fractions (approx. 90% pure) are converted again into the acid form for further purification. To do this, it is dissolved in 30 ml of water, covered with a layer of 300 ml of ethyl acetate, adjusted to pH 2.4 using dilute hydrochloric acid and saturated with sodium chloride.
After the phase separation, the aqueous phase is extracted with 200 and 100 ml of ethyl acetate. The combined organic phases are washed with saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate, filtered through a column of 10 g of silica gel and evaporated to dryness in vacuo. tThe residue is carried out using a 3-m. methanolic solution of sodium ethyl hexanoate directly into the pure, crystalline sodium salt of O-deacetyl-O-methylcarbamoyl-7- [tetrazolyl (1) -acetylamino] -cephalosporanic acid.
UV spectrum: Xmax 262 nm (s = 8450) Optical rotation: Coll, "o = + 1270 + 10 (c = 0.98 in water) Thin-layer chromatogram on silica gel: Rf52 = 0.17, RflolA = 0.40.
Example 3
9.15 g of the sodium salt of 7 - [[tetrazolyl (1) -acetylamino] - -cephalosporanX acid are dissolved in 270 ml of water and converted into the sodium salt of 7- [tetrazolyl (1) at 370 using 240 mg of acetylesterase in the manner described in Example 1 ) - acetylamino] -0- desacetyl - cephalosporanic acid converted (10.3 g).
This crude product is suspended in 100 ml of absolute dimethylformamide and mixed with 0.16 ml of tri-n-butyltin oxide [(BuSn) 2O]. A solution of 11.2 ml of ethyl isocyanate in 45 ml of dimethylformamide is then added dropwise over a period of 5 minutes, with cooling, and stirring is continued for a further hour. The reaction mixture is filtered and the filtrate is evaporated to dryness in a high vacuum. The resinous residue is triturated three times with 500 ml of absolute ether each time (the ether-soluble fraction is separated off and discarded) and then taken up in 250 ml of 10% phosphate buffer of pH 6.7. It is extracted successively with 1.5 liters and 0.5 liters of ethyl acetate. The organic phases are back-extracted twice with 100 ml of pH 6.7 buffer each time and then discarded.
The aqueous phases are combined, covered with 1.5 liters of ethyl acetate, by adding 5-n.
Hydrochloric acid and shaking adjusted to pH 2.4 and the phases separated. After saturation with common salt, the aqueous phase is extracted three times with 1 liter of ethyl acetate each time. The organic phases are washed successively with twice 200 ml of saturated sodium chloride solution each time, dried with sodium sulfate and filtered through a column (diameter 4.5 cm) of 100 g of silica gel. The column is washed with 500 ml of fresh ethyl acetate and the combined ethyl acetate eluates are evaporated to dryness in vacuo. An amorphous residue of 5.49 g results. This is taken up in 20 ml of acetone, in which it is partially dissolved. By adding 80 ml of chloroform, a light brown precipitate is formed, which is separated off by filtration and then subjected again to the same acetone / chloroform treatment.
The precipitate 1 resulting therefrom (2.8 g) is taken up in 80 ml of methanol and, after addition of 3.6 ml of methanolic sodium, α-ethylhexanoate f3 m), is brought into solution. Using a spatula tip of Norit (activated charcoal) and subsequent filtration through Celite, it is decolorized and then concentrated to a volume of approx. 5 ml. The crystalline sodium salt is obtained in this way, which is filtered off and washed with chloroform. The filtrates obtained during the acetone / chloroform treatment described above are successively applied to a column of 100 g of silica gel (diameter 3 cm, height 27.5 cm). It is chromatographed by slowly increasing the acetone content in the eluent.
The desired substance is eluted at a volume ratio of acetone-chloroform 1: 3. They are converted into the crystalline sodium salt in the manner described above.
The combined sodium salt fractions (approx. 90% pure are again converted into the acid form for further purification. To do this, they are dissolved in 35 ml of water, covered with 350 ml of ethyl acetate, adjusted to pH 2.4 with dilute hydrochloric acid and saturated with sodium chloride After the phases have separated, the aqueous phase is re-extracted with 250 and 150 ml of ethyl acetate. The combined organic phases are washed with saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate, filtered through a column of 15 g of silica gel and evaporated to dryness in vacuo 3 m. Methanolic solution of sodium z, - ethylhexanoate directly into the pure, crystalline sodium salt of O-deacetyl-O-ethylcarbamoyl-7- [tetrazolyl (1) acetylaminocephalosporanic acid).
Uv spectra 261 nu (± = 8550) Optical rotation CO;] D20 = + 1240 + 10 (c = 0.98 in water) Thin-layer chromatogram on silica gel: Rf, - = 0.21, RflolA = 0.44