Es wurde festgestellt, dass Guanidine in Form der Säureadditionssalze der Formel [CH@-(CH2)m-A-(CH2)n-NHC(NHRê)NHRÚ]+X- (1) oder der entsprechenden Basen davon, in welcher Formel stöchiometrisch eine der drei stickstoffhaltigen Gruppe pen als Iminogruppe vorliegt, enthalten, wirkungsvolle Impfstoffadjuvantien sind, insbesondere für Diphtherie Formoltoxoid.
In der obigen Formel bedeuten:
R1 einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
R2 einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine 2-Phenoxyäthylgruppe,
X das Äquivalent eines Anions,
A ein Sauerstoffatom oder den Methylenrest, n ist gleich 2 oder 3 und meine ganze Zahl von 11 bis 15.
Besonders wirksam sind von den genannten Verbindungen diejenigen, bei denen beide Alkylreste R1 und R2 Methylreste sind. Eine besondere Gruppe von Verbindungen der Formel 1 sind diejenigen, in welchen R1 und iR2 Methylreste sind und A ein Sauerstoffatom ist. Zu dieser Gruppe gehören die bevorzugten N-2-Dodecyl oxyäthyl-N',N" -dimethylguanidium-, N - 3 - Dodecyloxy- propyl-N',N''-dimethylguanidinium- und N-2-Hexadecyl oxyäthylJN',N"-dimethy}guanidinium^Verbindungen, welche die höchste Wirksamkeit als Impfstoffadjuvantien bei DiphtherieFormoltoxoid aufweisen.
Impfstoffadjuvantien dienen dazu, die Wirksamkeit des antigenen Stoffes bei dem Erzielen der gewünschten
Immunitätsreaktion zu erhöhen und mancher schwach antigener Stoff benötigt zum Erreichen der erwünschten Wirkung das Beisein eines Adjuvanten in der Vaccine.
Der Adjuvant kann in die Vaccine eingebracht werden, bevor diese in Behälter, wie Ampullen, verteilt wird. Man kann aber den Adjuvanten unmittelbar vor Verwendung der Vaccine dem antigenen Stoff zumischen.
rDie erwähnte biologische Wirkung der genannten Gua nidine ist eine Eigenschaft des in diesen enthaltenen Kat- iorls. Das Anion ghat also eine geringe Bedeutung es soll nur pharmakologisch und pharmazeutisch annehmbar sein. So kann die Verbindung xB. ein Hydrochlorid, Hy drojodid, Sulfat, Toluol-p-sulfonat, p-Chlorbenzolsulfo nat, Naphthalin-2-sulfonat, Maleat oder Tartrat sein.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen der
Formel 1 verwen rm zwknissg' in Lösung, Di spension od. Suspension in eimer Fsigkeit. Die Disper- sion kann durch Schütteln und Feinmahlen der Verbin dung in einer wässrigen Flüssigkeit gewonnen werden.
Durch Vermischen des Adjuvanten mit dem nicht-pa thogenen antigenen Stoff erhält man die Vaccine. Das
Mengenverhältnis der beiden Stoffe hängt von den immu nologischen Eigenschaften des Antigenen ab; die zu ver abreichende Menge und die Dosierung hängen von der
Natur der Infektion und der Grösse des Patienten ab. Bei kleinen Tieren, wie Mäusen und Meerschweinchen, liegt die zu verwendende Adjuvantenmenge vorzugsweise zwi schen 0,01 und 1 mgllDosis. Solche Mengen sind nicht toxisch.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen S-substituierten Isothioharnstoff, welcher zwei der drei Aminogruppen der Verbindung der Formel 1 enthält, oder ein entsprechendes Salz einer solchen Verbindung, mit einem Amin der Formel RNH2 umsetzt, worin RNH- die dritte der drei Aminogruppen ist.
Beispiel 1
24,7 g Äthanolamin werden vorsichtig während der Zugabe von 8,2 g Natrium in kleinen Mengen gerührt und erhitzt. Das Erhitzen und Rühren werden fortgesetzt, bis das gesamte Natrium gelöst ist, worauf 70 ml Toluol eugegeben werden. Das Gemisch wird allmählich auf Rückflusstemperatur erhitzt und während 30 Minuten tropfenweise mit 50 g 1-Bromdodecan behandelt. Das Erhitzen und Rühren wird weitere 5 Stunden fortgesetzt. Das Gemisch lässt man über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und behandelt es mit Wasser und Äther. Die organische Schicht wird entfernt und der wässrige Teil zweimal mit Äther extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet eingedampft und unter Wasserpumpenvakuum destilliert.
Nach Umdestillation des Produkts erhält man 2-Dodecyloxyäthylamin vom Schmelzpunkt 108-llûolC/14 mm Hg.
5 g N,N'-S-Trimethylthiouroniumjodid werden zu einer warmen Lösung von 4,6 g 2-,Dodecyloxyäthylamin in 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten auf dem Dampfbad erwärmt, über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton und Wasser kri stallisiert und liefert ein Produkt vom Schmelzpunkt 120 ;134 C, das brei 100 f weich wird. Zwei Umkristallisatio- nen aus einem Gemisch von Aceton und Wasser, gefolgt von einer weiteren aus Aceton und einer aus einem Gemisch von Aceton und Petroläther (Siedepunkt 4060 C) ergibt reines N-2-Dodecyloxyäthyl-N',N"-dimethyl- iguanidinhydrojodid vom Schmelzpunkt 144 - 1470C.
Beispiel 2
Nach dem Verfahren des ersten Teils von Beispiel 1, aber unter Verwendung von 30,2 g 3-Propanolamin anstelle von 24,7 g Äthanolamin, stellt man 3-Dodecyloxypropylamin vom Siedepunkt 128-134 C/0,5 mm her.
Nach dem Verfahren des zweiten Teils von Beispiel 1 ergeben 5 g Amin und 6,5 g N,N'-s-Trimethylthiouro- niumjodid in 10 ml Dimethylformamid reines N-3-Dodecyloxypropyl - N',N" - dimethylguanidin - hydrojodid vom Schmelzpunkt 12O1220C nach zwei Umkristallisationen aus einem Gemisch von Benzol und Petroläther (Siedepunkt 680 C) und einer Umkristallisation aus Aceton/ Wasser.
Beispiel 3
Nach dem Verfahren des ersten Teils von Beispiel 1 ergibt die Umsetzung zwischen 5,8 g Äthanolamin, 1,7 g Natrium und 13 g 1 -Bromhexadecan 2-Hexadecyloxy äthylamin vom Siedepunkt 140-142 C/0,1 mm.
4 g dieses Amins und 3,5 g N,N'-S-Trimethylthiouroniumjodid in Dimethylformamid nach dem Verfahren des zweiten Teils von Beispiel 1 liefern N-2-Hexadecyloxy äthyl-N',N"-dimethylguanidinhydrojodid. Nach zwei Um kristallisationen aus Äthanol/Wasser und zwei weiteren aus Aceton/Petroläther (Siedepunkt 40600C) hat das reine Salz einen Schmelzpunkt von 155 - 1570C bei vorherigem Weichwerden.
Die folgenden Verbindungen werden nach den in der britischen Patentschrift 1 003 889 beschriebenen Verfah ren hergestellt: Schmelz Beispiel Verbindung punkt C 4 N-Hexadecyl-N'-methyl-N"-2- 73 -75 -phenoxyäthylguanidin-hydroj odid 5 S-Hexadecyl-N,N' - dimethyl-thio - 75 -77 uroniumbromid 6 S-Octadecyl-N,N'4imetltyl-thio- 90,5-92 uroniumjodid
Eine wässrige Dispersion von N-2-Dodecyloxyäthyl- -N',N"-dimethylguanidin-hydrojodid (1 mg/ml) wird durch Schütteln und Mahlen in isotonischem Borat/Succinat-Puffer bei pH 7,5 hergestellt.
Dieser Puffer enthält 0,9 IGew./Vol.-% Natriumborat Na2B4O7 10H2O, 0,29 Gevr./Vol.-% Bernsteinlsäure und 0,75 Ü'ew.%/Voi.-% Natriumchlorid.
Diphtherie-Formoltoxoid, hergestellt durch Behan dem von gereinigtem Diphtherietoxin mit wässrigem Formaldehyd, wird in isotonischem Borat/Succinat-Puffer pH 7,5 verdünnt, so dass es 10 Flockenäquivalente (10 Lf.)/ml enthält. Zu dieser Lösung wird ein gleiches Volumen des Adjuvanten zugesetzt, so dass man eine Diphtherievaccine erhält.
Die Wirksamkeit der Vaccine wird ion Gruppen von 5 Meerschweinchen gezeigt, indem die Vaccine verabreicht nnd später die Antikörperspiegel geschätzt werden. Jedes Meerschweinchen wird subkutan mit zwei Dosen von 0,2 ml der Vaccine 28 Tage injiziert. Die Meerschweinchen sterben 10 Tage nach der zweiten Dosis, und der Antikörpertiter gegen Diphtherie wird in normalen Meerschweinchen nach dem intracutanen Meerschweinchentest von Romer und Sames 4Z Immun. Forsch., 3, 344, 1909), abgeändert von Glenny und Llewellyn-Jones (J. Path.
Ad. 34, 143, 1931) geschätzt. Der mittlere Antikörper titer war 0,063 Ilinhelten/rul, verglichen mit einem Titer von weniger als 0,001 Einheiten/ml, der mit dem Diphtherietoxoid ohne Adjuvanten erhalten wird.
Das beschriebene Vorgehen wird unter Verwendung einer wässrigen Dispersion anderer Verbindungen wie der holt, wobei man die folgenden Resultate erhält:
Mittlerer
Verbindung Antikörpertiter (Einheiten/rnl) N-3-Dodecyloxypropyl-N',N''-dimethyl- 0,55 guanidin-hydrojodid N-2-Hexadecyloxyäthyl-N',N' -dime- 2,2 thylguanidin-hydrojodid N-Hexadecyl-N'-methyl-N" -phenoxy- 2,5 äthylguanidin-hydrojodid
S-Hexadecyl-N,N' -dimethyl-thiouro- 1,2 niumbromid
Der Versuch wird unter Verwendung einer wässrigen Dispersion von S-Octadecyl-N,N'-dimethyl-thiouronium- jodid ausgeführt. 4 von 5 Tieren zeigten Titer höher als 0,1 Einheiten/ml.
It was found that guanidines in the form of the acid addition salts of the formula [CH @ - (CH2) mA- (CH2) n -NHC (NHRê) NHRÚ] + X- (1) or the corresponding bases thereof, in which formula one of the stoichiometric three nitrogen-containing groups pen present as an imino group, contain effective vaccine adjuvants, especially for diphtheria formol toxoid.
In the above formula:
R1 is an alkyl radical with 1 to 4 carbon atoms,
R2 is an alkyl radical with 1 to 4 carbon atoms or a 2-phenoxyethyl group,
X is the equivalent of an anion,
A is an oxygen atom or the methylene radical, n is 2 or 3 and my whole number is from 11 to 15.
Of the compounds mentioned, those in which both alkyl radicals R1 and R2 are methyl radicals are particularly effective. A special group of compounds of formula 1 are those in which R1 and iR2 are methyl radicals and A is an oxygen atom. This group includes the preferred N-2-dodecyl oxyäthyl-N ', N "-dimethylguanidium-, N - 3 - dodecyloxypropyl-N', N" - dimethylguanidinium- and N-2-hexadecyl oxyäthylJN ', N " -dimethy} guanidinium ^ Compounds which are most effective as vaccine adjuvants in diphtheria formol toxoid.
Vaccine adjuvants are used to increase the effectiveness of the antigenic substance in achieving the desired
To increase the immune response and some weakly antigenic substances require the presence of an adjuvant in the vaccine to achieve the desired effect.
The adjuvant can be introduced into the vaccine before it is distributed into containers such as ampoules. But you can mix the adjuvant with the antigenic substance immediately before using the vaccine.
The mentioned biological effect of the mentioned guanidines is a property of the catalyst contained in them. The anion g is therefore of little importance; it should only be pharmacologically and pharmaceutically acceptable. So the connection xB. a hydrochloride, hydroiodide, sulfate, toluene-p-sulfonate, p-chlorobenzenesulfonate, naphthalene-2-sulfonate, maleate or tartrate.
The compounds of the invention obtainable
Formula 1 is used in solution, dispersion or suspension in a bucket of liquid. The dispersion can be obtained by shaking and finely grinding the compound in an aqueous liquid.
The vaccines are obtained by mixing the adjuvant with the non-pathogenic antigenic substance. The
The ratio of the two substances depends on the immunological properties of the antigen; the amount to be administered and the dosage depend on the
The nature of the infection and the size of the patient. In small animals such as mice and guinea pigs, the amount of adjuvant to be used is preferably between 0.01 and 1 mg / l dose. Such amounts are not toxic.
The process according to the invention for the preparation of the compounds mentioned is characterized in that an S-substituted isothiourea which contains two of the three amino groups of the compound of the formula 1, or a corresponding salt of such a compound, is reacted with an amine of the formula RNH2 in which RNH - is the third of the three amino groups.
example 1
24.7 g of ethanolamine are carefully stirred and heated in small amounts while adding 8.2 g of sodium. Heating and stirring are continued until all of the sodium is dissolved, whereupon 70 ml of toluene is added. The mixture is gradually heated to reflux temperature and treated dropwise with 50 g of 1-bromododecane over 30 minutes. Heating and stirring are continued for an additional 5 hours. The mixture is left to stand overnight at room temperature and treated with water and ether. The organic layer is removed and the aqueous portion extracted twice with ether. The combined organic solution is dried over sodium sulfate, evaporated and distilled under a water pump vacuum.
After redistillation of the product, 2-dodecyloxyethylamine with a melting point of 108 ° C / 14 mm Hg is obtained.
5 g of N, N'-S-trimethylthiouronium iodide are added to a warm solution of 4.6 g of 2-, dodecyloxyethylamine in 5 ml of dimethylformamide. The mixture is heated on the steam bath for 15 minutes, left to stand overnight at room temperature and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is crystallized from a mixture of acetone and water and gives a product with a melting point of 120; 134 C, which is soft 100 f. Two recrystallizations from a mixture of acetone and water, followed by a further one from acetone and one from a mixture of acetone and petroleum ether (boiling point 4060 ° C.) yields pure N-2-dodecyloxyethyl-N ', N "-dimethyl iguanidine hydroiodide Melting point 144-1470C.
Example 2
Following the procedure of the first part of Example 1, but using 30.2 g of 3-propanolamine instead of 24.7 g of ethanolamine, 3-dodecyloxypropylamine with a boiling point of 128-134 C / 0.5 mm is prepared.
Following the procedure of the second part of Example 1, 5 g of amine and 6.5 g of N, N'-s-trimethylthiouronium iodide in 10 ml of dimethylformamide give pure N-3-dodecyloxypropyl - N ', N "- dimethylguanidine - hydroiodide of melting point 12O1220C after two recrystallizations from a mixture of benzene and petroleum ether (boiling point 680 C) and one recrystallization from acetone / water.
Example 3
Following the procedure of the first part of Example 1, the reaction between 5.8 g of ethanolamine, 1.7 g of sodium and 13 g of 1-bromohexadecane 2-hexadecyloxy ethylamine with a boiling point of 140-142 C / 0.1 mm.
4 g of this amine and 3.5 g of N, N'-S-trimethylthiouronium iodide in dimethylformamide by the method of the second part of Example 1 yield N-2-hexadecyloxyethyl-N ', N "-dimethylguanidine hydroiodide. After two recrystallizations from ethanol / Water and two others made from acetone / petroleum ether (boiling point 40600C), the pure salt has a melting point of 155-1570C when previously softened.
The following compounds are prepared according to the method described in British patent 1 003 889: enamel example Compound point C 4 N-hexadecyl-N'-methyl-N "-2- 73 -75 -phenoxyethylguanidine-hydrojodide 5 S-hexadecyl -N, N'-dimethyl-thio-75-77 uronium bromide 6 S-octadecyl-N, N'4imethyl-thio-90.5-92 uronium iodide
An aqueous dispersion of N-2-dodecyloxyethyl-N ', N "-dimethylguanidine hydroiodide (1 mg / ml) is prepared by shaking and grinding in isotonic borate / succinate buffer at pH 7.5.
This buffer contains 0.9% w / v sodium borate Na2B4O7 10H2O, 0.29% w / v% succinic acid and 0.75% w / v% sodium chloride.
Diphtheria formol toxoid, prepared by treating purified diphtheria toxin with aqueous formaldehyde, is diluted in isotonic borate / succinate buffer pH 7.5 so that it contains 10 flake equivalents (10 Lf.) / Ml. An equal volume of the adjuvant is added to this solution so that a diphtheria vaccine is obtained.
The effectiveness of the vaccines is demonstrated in groups of 5 guinea pigs by administering the vaccines and later estimating the antibody levels. Each guinea pig is injected subcutaneously with two 0.2 ml doses of the vaccine for 28 days. The guinea pigs die 10 days after the second dose, and the antibody titer to diphtheria in normal guinea pigs is 4Z Immun according to the Romer and Sames intracutaneous guinea pig test. Forsch., 3, 344, 1909), modified by Glenny and Llewellyn-Jones (J. Path.
Ad. 34, 143, 1931). The mean antibody titer was 0.063 Ilinhelten / rul compared to a titer of less than 0.001 units / ml obtained with the diphtheria toxoid without adjuvant.
The procedure described is carried out using an aqueous dispersion of other compounds such as the one with the following results:
Middle
Compound antibody titer (units / ml) N-3-dodecyloxypropyl-N ', N' '- dimethyl- 0.55 guanidine-hydroiodide N-2-hexadecyloxyethyl-N', N '-dime- 2,2 thylguanidine-hydroiodide N- Hexadecyl-N'-methyl-N "-phenoxy-2,5-ethylguanidine-hydroiodide
S-hexadecyl-N, N '-dimethyl-thiouronium bromide
The experiment is carried out using an aqueous dispersion of S-octadecyl-N, N'-dimethyl-thiouronium iodide. 4 out of 5 animals showed titers higher than 0.1 units / ml.