Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden
Man kann einen Schutz gegen versehiedene bakterielle Krankheiten, z. B. die Diphtherie des Menschen und die Enterotoxämie der Schafe, durch Immunisierung des Wirts mit Toxoiden erreichen, die aus den durch die pathogenen Bakterien erzeugten Toxinen gewonnen werden. Die Toxoide können durch Behandeln der Toxine mit Formaldehyd hergestellt werden.
Die auf diesem Wege aus ungereinigten Toxinpräpara- ten gewonnenen Toxine haben den Nachteil, dass sie nicht gleichmässig antigen wirken; als lösliche Toxoide kann ihre antigene Wirkung gering sein, so dass man sie gewöhnlich mit einem Hilfsstoff, z. B. einer Aluminiumverbindung, kombiniert, um eine wirksame Vaccine zu erhalten. Andererseits liefert auch die Behandlung gereinigter Toxine, wie gereinigtes Diphtherietoxin, mit Formaldehyd allein kein befriedigendes Ergebnis, da selbst bei vollständiger Umsetzung in Toxoid dieses nach dem Abtrennen des Formaldehydüberschusses beim Verdünnen und bei der Lagerung Zei chen von Übergang in den toxischen Zustand zeigen kann.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren aus gereinigten Diphtherietoxinen herstellbaren Toxoide sind als lösliche Toxoide hoch antigen und verhä]tnis- mässig stabil; sie sind geeignete Komponenten für Vaccinen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden ist dadurch gekennzeichnet, dass man gereinigtes Diphtherietoxin mit Formaldehyd in Gegenwart eines zweibasischen Amins von niedrigem Molekulargewicht behandelt, wobei mindestens eine der basischen Gruppen des Amins eine primäre oder sekundäre, nicht an einen aromatischen oder heterocyclischen Ring aromatischen Charakters gebundene Aminogruppe ist und die beiden basischen Gruppen sich voneinander in ihrer Reaktivität gegenüber Formaldehyd unterscheiden.
Beispiele für verwendbare Amine sind zweibasische aliphatische Amine, wie Lysin (I) und Äthylendiamin (II), in denen die eine Aminogruppe primär oder sekundär ist und sich in ihrer Basizität von der andern unterscheidet.
H2NCH(CO [CH24-NH (1)
H2N-CH2-CH2-NH2 (II)
Vorzugsweise werden für das erfindungsgemässe Verfahren solche gereinigte Diphtherietoxinpräparate verwendet, die wenig oder kein stickstoffhaltiges Mate rial- mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, wie es anfangs in den ungereinigten Toxinpräparaten vorkommen kann, weil möglicherweise in Gegenwart von einigen Aminen, die nicht der definierten Klasse angehören, erheblich weniger antigene Toxoide erzeugt werden. Es können jedoch zufriedenstellende Toxoide in Gegenwart von Mischungen aus Aminen hergestellt werden, die zum Teil aus Aminen der definierten Klasse und zum Teil aus andern Aminen bestehen, z. B. Mischungen aus Lysin und Alanin.
Das im Rahmen der Erfindung verwendete Mengenverhältnis Formaldehyd zu Amin der definierten Klasse kann den Umständen angepasst werden. Wird gereinigtes Diphtherietoxin nur in Gegenwart eines solchen Amins mit Formaldehyd behandelt, dann soll die molare Konzentration des Amins vorzugsweise nicht höher sein als die des Formaldehyds; sie kann beispielsweise von 20 bis 100 % der des Formaldehyds betragen.
Es kann angenommen werden, dass der Formaldehyd die Moleküle des zugegebenen Amins mit den Toxinmolekülen verbindet, die durch die folgende Formel als [T] . H dargestellt werden und zwar durch Reaktion mit den aktiven Wasserstoffatomen der Aminogruppen oder anderer Gruppen, die gegenüber Formaldehyd reaktionsfähig sind. In Gegenwart von Lysin kann beispielsweise die Reaktion wie folgt ver lufen: [T].
H. + CII3O + H2N-CH(CO2H). [CH2]4-NH2 rn . CH2-NHCH(CO2H) . [CH2]4-NH2 + H20
Die hoch antigene Wirkung und verhältnismässig grosse Beständigkeit der Toxoide der vorliegenden Art ist möglicherweise an das Vorhandensein basischer Seitenketten, die sich von dem zugegebenen Amin ableiten, gebunden. Es ist möglich, dass ein Toxoid, das durch Behandeln gereinigter Toxine mit Formaldehyd allein gewonnen worden ist, wegen der reversiblen Bildung reaktiver Hydromethylgruppen und wegen Verkettung der Toxinmoleküle ungenügend ist.
[TJ . H + CHO = [T] . CH2OH 2[T].H + CH2O#[T].CH2.[T] + H2O
Das erfindungsgemässe Verfahren dient zur Herstellung neuartiger Toxoide der Struktur [T] . CH2 . wobei [T] ein Radikal darstellt, das aus dem Molekül des Diphtherietoxins durch Verlust eines Wasserstoffatoms aus einer gegenüber Formaldehyd reaktiven Gruppe hervorgeht, und wobei Y ein Radikal ist, das aus einem Aminmolekül der oben definierten Klasse durch Verlust eines Wasserstoffatoms aus der Aminogruppe entsteht.
Zwecks Verdeutlichung ist das Toxinmolekül [T]. H im vorangehenden nur mit einem aktiven Wasserstoffatom dargestellt worden; es kann aber als Proteinmolekül tatsächlich viele aktive Wasserstoffatome enthalten und könnte genauer durch die Strukturformel [t] Hn dargestellt werden. Die neuartigen Toxoide können deshalb auch mehrere Aminomethylradikale CH2Y pro Molekül des Toxoids enthalten und können genauer durch die Strukturformel [t] (CH2Y)11 dargestellt wer den.
In diesen Strukturformeln bedeutet ein Radikal, das aus einem Molekül Diphtherietoxin durch Verlust eines Wasserstoffatoms oder mehrerer Wasserstoffatome aus gegenüber Formaldehyd reaktionsfähigen Gruppen entstanden ist; für ein bestimmtes Toxoidmolekül ist n eine positive ganze Zahl, braucht aber nicht notwendig für alle Toxoidmoleküle eines Präparates dieselbe ganze Zahl zu sein; n kann deshalb für das Präparat als Ganzes eine gebrochene ganze Zahl darstellen.
Beispiel I
Eine Lösung von 27 g L-Lysinmonohydrochlorid (0,15 Mol), welches 2 % D-Enantiomeres enthielt, in 2000 ml destilliertem Wasser wurde nacheinander mit 15 g Natriumbicarbonat, 15 ml 36 prozentiger (Gewicht/Vol) Formaldehydlösung (0,18 Mol) und 600 ml einer Lösung von gereinigtem Diphtherietoxin behandelt, das einen Gehalt von etwa 3000 Lf-Einheiten/ml und mindestens 2200 Lf-Einheiten/mg Proteinstickstoff, bestimmt gegenüber dem internationalen Stan dardantitoxin (Ausflockung), hatte. Die Mischung wurde auf 3000 ml aufgefüllt, auf pH = 7,6 eingestellt und durch Filtrieren sterilisiert; sie enthielt dann 500 Lf-Einheiten/ml.
Das Gemisch wurde 3 Wochen lang bei 18-20 C aufbewahrt, und dann auf pH 7,1 eingestellt; es enthielt darauf 560 Lf-Einheiten/ml. Eine Probe, die zehnfach in Boratpufferlösung verdünnt war, erwies sich gegenüber Meerschweinchen und Kaninchen bei intracutaner Einspritzung als nichttoxisch. Um die Umsetzung des Toxins in Toxoid zu Ende zu führen, wurde die Mischung 3 Wochen lang bei 320 C eingelagert und anschliessend auf pH = 7,25 eingestellt. Sie enthielt dann 540 Lf-Einheiten/ml, zeigte also eine nur unbedeutende Abschwächung.
Ein geringes Volumen einer Toxoidlösung wurde gegen destilliertes Wasser mit einem Gehalt von 0,01 0/o Natrium-o-(äthylmercurithio-benzoat dialysiert und anschliessend intracutan bei Kaninchen geprüft; es erwies sich, dass das Produkt nach Abtrennung des Formaldehyds völlig nichttoxisch war. Die Hauptmenge der Toxoidlösung wurde mit Ammoniumsulfat und Natriumbicarbonat im Verhältnis 44 g Ammoniumsulfat und 0,5 g Natriumbicarbonat auf 100 ml Lösung behandelt und über Nacht stehen gelassen. Das ausgefallene Toxoid wurde abfiltriert, in etwa 600 ml einer 0,01 prozentigen Bicarbonatlösung aufgenommen und dialysiert, bis es sulfatfrei war.
Beispiel 2
Nach der in Beispiel 1 angegebenen Verfahrensweise wurde aus gereinigtem Diphtherietoxin in Anwesenheit von 0,05 Mol L-Lysin, 0,05 Mol L-Alanin und 0,06 Mol Formaldehyd ein Toxoid hergestellt.
Beispiel 3
Gemäss Beispiel 1 wurde aus gereinigtem Diphtherietoxin in Anwesenheit von 0,025 Mol L-Lysin, 0,075 Mol L-Alanin und 0,06 Mol Formaldehyd ein Toxoid hergestellt.
Beispiel 4
5 ml (0,06 Mol) einer 36 prozentigen (Gewicht/ Vol) Formaldehydlösung wurden pro Liter einer Lösung von gereinigtem Diphtherietoxin zugesetzt, die 500 Lf-Einheiten/ml in 0,5 prozentiger (Gewicht/Vol) Natriumbicarbonatlösung enthielt. Dann wurde in kleinen Portionen 0,1 Mol pro Liter Äthylendiamin zugegeben, dabei auf jede Portion folgend Chlorwasserstoff, um zu verhindern, dass die Lösung zu stark alkalisch würde; anstatt dessen kann das Äthylendiamin vor dem Zugeben auch neutralisiert werden. Die Mischung wurde am Ende auf pH = 7,6 eingestellt und 11 Wochen lang bei 1820O C aufbewahrt. Nach den ersten 3 Wochen wurden 0,06 Mol Formaldehyd pro Liter, nach den ersten 6 Wochen weitere 0,06 Mol Formaldehyd pro Liter zugegeben.
Die Mischung wurde anschliessend 3 Wochen lang bei 320 C eingelagert und darauf zwecks Abtrennung des Formaldehyds dialysiert. Man erhielt eine Lösung eines zufriedenstellend antigenen Diphtherietoxoids, welches stabil und nichttoxisch blieb.
Beispiel 5 0,06 Mol Formaldehyd pro Liter und 0,05 Mol Äthylendiamin pro Liter wurden zu einer Lösung von gereinigtem Diphtherietoxin zugegeben, wie dies unter Beispiel 4 beschrieben ist. Die Mischung wurde 7 Wochen lang bei 18-20 C aufbewahrt; nach 3 Wochen wurden weitere 0,06 Mol Formaldehyd pro Liter, nach 7 Wochen weitere 0,012 Mol pro Liter zugegeben. Die Mischung wurde 3 Wochen lang bei 32 C eingelagert und dialysiert, wobei man eine Lösung von Diphtherietoxoid erhielt.
Beispiel 6
0,06 Mol Formaldehyd pro Liter und 0,0125 Mol Äthylendiamin pro Liter wurden zu einer Lösung von gereinigtem Diphtherietoxin zugegeben, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist; die Mischung wurde 7 Wochen lang bei 18-20 C aufbewahrt. Sie wurde 3 Wochen lang bei 32 C eingelagert und dialysiert, wobei eine Lösung von Diphtherietoxoid entstand.
Vaccinen
Sterile injizierbare Lösungen der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Diphtherietoxoide in luftdicht abgeschlossenen Einfach- oder Mehrfachbehältern können als Vaccinen für vorbeugende Behandlung gegen Diphtherie verwendet werden. So ist z. B. das Toxoid nach Beispiel 1 zu Diphterievacdne (gereinigtes Toxoid-Aluminiumphosphat), Diphtherie-Tetanusvaccine und Diphtherie-Pertussis-Tetanusvaccine der British Pharmacopoeia zugesetzt worden. Die relativ grosse Stabilität des Toxoids verleiht den erfindungsgemäss herstellbaren Vaccinen eine grössere Lagerbeständigkeit, sofern die Diphtheriekomponente der bestimmende Faktor hierfür ist.
Process for making diphtheria toxoids
One can protect against various bacterial diseases, e.g. B. human diphtheria and sheep enterotoxemia can be achieved by immunizing the host with toxoids obtained from the toxins produced by the pathogenic bacteria. The toxoids can be made by treating the toxins with formaldehyde.
The toxins obtained in this way from unpurified toxin preparations have the disadvantage that they do not have a uniform antigenic effect; as soluble toxoids, their antigenic effect can be low, so that they can usually be treated with an excipient, e.g. B. an aluminum compound, combined to obtain an effective vaccine. On the other hand, the treatment of purified toxins, such as purified diphtheria toxin, with formaldehyde alone does not give a satisfactory result, since even with complete conversion into toxoid this can show signs of transition to the toxic state after the excess formaldehyde has been separated off during dilution and storage.
The toxoids which can be prepared from purified diphtheria toxins by the process according to the invention are, as soluble toxoids, highly antigenic and relatively stable; they are suitable components for vaccines.
The process according to the invention for the production of diphtheria toxoids is characterized in that purified diphtheria toxin is treated with formaldehyde in the presence of a dibasic amine of low molecular weight, at least one of the basic groups of the amine being a primary or secondary ring that is not aromatic on an aromatic or heterocyclic ring Character is bound amino group and the two basic groups differ from each other in their reactivity to formaldehyde.
Examples of usable amines are dibasic aliphatic amines, such as lysine (I) and ethylenediamine (II), in which one amino group is primary or secondary and differs in its basicity from the other.
H2NCH (CO [CH24-NH (1)
H2N-CH2-CH2-NH2 (II)
Purified diphtheria toxin preparations are preferably used for the process according to the invention which contain little or no nitrogenous material with a low molecular weight, as can initially occur in the unpurified toxin preparations, because possibly in the presence of some amines that do not belong to the defined class, considerably fewer antigenic toxoids are produced. However, satisfactory toxoids can be prepared in the presence of mixtures of amines, some of which are amines of the defined class and some of other amines, e.g. B. Mixtures of Lysine and Alanine.
The quantitative ratio of formaldehyde to amine of the defined class used in the context of the invention can be adapted to the circumstances. If purified diphtheria toxin is treated with formaldehyde only in the presence of such an amine, then the molar concentration of the amine should preferably not be higher than that of the formaldehyde; it can be, for example, from 20 to 100% that of the formaldehyde.
It can be assumed that the formaldehyde connects the molecules of the added amine with the toxin molecules represented by the following formula as [T]. H can be represented by reaction with the active hydrogen atoms of the amino groups or other groups which are reactive towards formaldehyde. In the presence of lysine, for example, the reaction can proceed as follows: [T].
H. + CII3O + H2N-CH (CO2H). [CH2] 4-NH2 mn. CH2-NHCH (CO2H). [CH2] 4-NH2 + H20
The highly antigenic effect and relatively high resistance of the toxoids of the present type is possibly linked to the presence of basic side chains which are derived from the added amine. It is possible that a toxoid obtained by treating purified toxins with formaldehyde alone is insufficient because of the reversible formation of reactive hydromethyl groups and because of the concatenation of the toxin molecules.
[TJ. H + CHO = [T]. CH2OH 2 [T] .H + CH2O # [T] .CH2. [T] + H2O
The process according to the invention is used to produce novel toxoids of structure [T]. CH2. where [T] represents a radical which arises from the molecule of diphtheria toxin by loss of a hydrogen atom from a group reactive towards formaldehyde, and where Y is a radical which arises from an amine molecule of the class defined above by loss of a hydrogen atom from the amino group.
For the sake of clarity, the toxin molecule is [T]. H has been represented in the foregoing with only one active hydrogen atom; However, as a protein molecule it can actually contain many active hydrogen atoms and could be represented more precisely by the structural formula [t] Hn. The novel toxoids can therefore also contain several aminomethyl radicals CH2Y per molecule of the toxoid and can be represented more precisely by the structural formula [t] (CH2Y) 11.
In these structural formulas, means a radical that has arisen from a molecule of diphtheria toxin through the loss of one hydrogen atom or several hydrogen atoms from groups which are reactive towards formaldehyde; for a certain toxoid molecule n is a positive integer, but need not necessarily be the same integer for all toxoid molecules of a preparation; n can therefore represent a fractional whole number for the preparation as a whole.
Example I.
A solution of 27 g of L-lysine monohydrochloride (0.15 mol), which contained 2% D-enantiomer, in 2000 ml of distilled water was successively mixed with 15 g of sodium bicarbonate, 15 ml of 36 percent (w / v) formaldehyde solution (0.18 mol ) and 600 ml of a solution of purified diphtheria toxin, which had a content of about 3000 Lf units / ml and at least 2200 Lf units / mg protein nitrogen, determined against the international standard antitoxin (flocculation). The mixture was made up to 3000 ml, adjusted to pH = 7.6 and sterilized by filtration; it then contained 500 Lf units / ml.
The mixture was stored at 18-20 C for 3 weeks and then adjusted to pH 7.1; it contained 560 Lf units / ml. A sample that was diluted tenfold in borate buffer solution was found to be non-toxic to guinea pigs and rabbits when injected intracutaneously. In order to complete the conversion of the toxin into toxoid, the mixture was stored at 320 ° C. for 3 weeks and then adjusted to pH = 7.25. It then contained 540 Lf units / ml, showing only an insignificant attenuation.
A small volume of a toxoid solution was dialyzed against distilled water with a content of 0.01% sodium o- (ethylmercurithio-benzoate and then tested intracutaneously in rabbits; it was found that the product was completely non-toxic after separation of the formaldehyde. The bulk of the toxoid solution was treated with ammonium sulfate and sodium bicarbonate in a ratio of 44 g ammonium sulfate and 0.5 g sodium bicarbonate per 100 ml solution and left to stand overnight The precipitated toxoid was filtered off, taken up in about 600 ml of a 0.01 percent strength bicarbonate solution and dialyzed until it was sulfate free.
Example 2
According to the procedure given in Example 1, a toxoid was prepared from purified diphtheria toxin in the presence of 0.05 mol of L-lysine, 0.05 mol of L-alanine and 0.06 mol of formaldehyde.
Example 3
According to Example 1, a toxoid was prepared from purified diphtheria toxin in the presence of 0.025 mol of L-lysine, 0.075 mol of L-alanine and 0.06 mol of formaldehyde.
Example 4
5 ml (0.06 mole) of a 36 percent (w / v) formaldehyde solution was added per liter of a solution of purified diphtheria toxin containing 500 Lf units / ml in 0.5 percent (w / v) sodium bicarbonate solution. Then 0.1 mol per liter of ethylenediamine was added in small portions, hydrogen chloride following each portion in order to prevent the solution from becoming too strongly alkaline; instead, the ethylenediamine can also be neutralized before adding. The mixture was finally adjusted to pH = 7.6 and stored at 180 ° C. for 11 weeks. After the first 3 weeks, 0.06 mol of formaldehyde per liter and after the first 6 weeks a further 0.06 mol of formaldehyde per liter were added.
The mixture was then stored for 3 weeks at 320 ° C. and then dialyzed to separate off the formaldehyde. A solution of a satisfactorily antigenic diphtheria toxoid which remained stable and non-toxic was obtained.
Example 5 0.06 mol of formaldehyde per liter and 0.05 mol of ethylenediamine per liter were added to a solution of purified diphtheria toxin, as described in Example 4. The mixture was stored at 18-20 C for 7 weeks; after 3 weeks a further 0.06 mol of formaldehyde per liter, after 7 weeks a further 0.012 mol per liter were added. The mixture was stored at 32 ° C. for 3 weeks and dialyzed to obtain a solution of diphtheria toxoid.
Example 6
0.06 moles of formaldehyde per liter and 0.0125 moles of ethylenediamine per liter were added to a solution of purified diphtheria toxin as described in Example 4; the mixture was stored at 18-20 ° C for 7 weeks. It was stored at 32 C for 3 weeks and dialyzed, a solution of diphtheria toxoid being formed.
Vaccines
Sterile injectable solutions of the diphtheria toxoids described in the preceding examples in single or multiple airtight containers can be used as vaccines for preventive treatment against diphtheria. So is z. B. the toxoid according to Example 1 has been added to Diphterievacdne (purified toxoid aluminum phosphate), diphtheria tetanus vaccines and diphtheria pertussis tetanus vaccines from the British Pharmacopoeia. The relatively high stability of the toxoid gives the vaccines which can be produced according to the invention a greater shelf life, provided the diphtheria component is the determining factor for this.