La présente invention se rapporte à la récupération de sousproduits de fermentation exploitables, provenant de culture de micro-organismes.
Dans le processus de production de protéines par culture de microrganismes sur divers substrats, les cellules du micro-orga- nisme sont d'abord séparées du bouillon de culture puis soumises à des traitements d'extraction et de purification destinés à isoler la protéine. Cette protéine, qui convient à l'alimentation humaine et animale, peut également être destinée à des usages non alimentaires, par exemple à la fabrication de résines, matiéres adhésives et autres produits du meme genre.
Les liquides, libérés au cours des opérations de récupération de la protéine, nommés habituellement ( < surnageants parce que la protéine est séparée des cellules le plus fréquemment par centrifugation, contiennent diverses substances organiques dans différents états de polymérisation et ou d'association tels que des acides aminés, des peptides, des vitamines, des nucléotides et des hydrates de carbone. Ces substances organiques sont produites pendant la fermentation ou libérées au cours des traitements subséquents que subissent les cellules. Les surnageants peuvent également, selon les techniques de séparation de la protéine mises en oeuvre, contenir des sels minéraux.
La présente invention se rapporte essentiellement à la récupération de ces substances organiques et!ou minérales. Elle a trait notamment à un procédé de récupération de sous-produits de fermentation à partir d'une suspension de cellules d'un micro-orga- nisme, ce procédé étant caractérisé par le fait que l'on ajoute à cette suspension au moins un acide en quantité suffisante pour établir un pH inférieur à 1,5,
que l'on chauffe ensuite la suspension acidifiée à une température comprise entre 50 et 100 C, que l'on sépare les cellules de la suspension acidifiée et enfin que l'on chauffe le liquide résiduel à une température d'au moins 100 C afin d'obtenir une solution de sous-produits de fermentation utilisables.
C'est ainsi que des composés nutritifs intéressants, utilisables pour la culture de micro-organismes ou à titre d'additifs dans les aliments pour animaux, ont été préparés par traitement acide d'une suspension de cellules à une température relativement plus élevée, comprise entre 50 et 100 C, puis, après séparation des cellules, par hydrolyse du sumageant à une température d'au moins 100-C.
Par l'expression suspension de cellules d'un micro-organisme , on entend désigner, dans l'exposé qui suit, soit le bouillon de culture tel qu'il est extrait du milieu de fermentation, soit une forme concentrée et; ou purifiée de bouillon, soit une suspension de cellules dont les parois ont été rompues, par exemple par un traitement mécanique.
Le traitement acide de la suspension, effectué à un pH inférieur à 1,5, de préférence compris entre 0,5 et 1,0 provoque la so- lubilisation des acides nucléiques sans toutefois entraîner une dégradation des constituants protéiques.
Bien qu'il soit préférable d'utiliser un acide minéral tel que l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique, il est possible d'utiliser d'autres acides. Selon un mode d'exécution particuliérement avantageux, le traitement est exécuté à une température n'excédant pas 80 C, afin d'éviter une dégradation des protéines ainsi que d'autres réactions secondaires indésirables.
Il est également possible d'utiliser de l'acide sulfureux, seul ou mélangé avec un autre acide minéral, pour atteindre le pH désiré.
L'acide sulfureux est de préférence formé in sifu par injection d'anhydride sulfureux sous une pression appropriée.
Les valeurs des trois paramétres: concentration en acide, durée du traitement et température, doivent être ajustées en fonction du choix de l'utilisation ultérieure de la protéine contenue dans les cellules du micro-organisme. A ce titre, il est généralement préférable, pour les utilisations alimentaires, d'exécuter le traitement à une température de 60' C environ pendant 60 minutes au plus.
L'acidité du milieu est suffisamment importante pour réduire au minimum la dissolution de la protéine tout en assurant la dégradation des acides nucléiques. Cette acidité provoque également une aggrégation partielle des cellules et facilite ainsi leur séparation du milieu.
Aprés séparation des cellules du microrganisme, cette séparation pouvant être exécutée par exemple par décantation ou centrifugation, le surnageant acide est chauffé à une température d'au moins 1000 C de façon à provoquer une dégradation des composants macromoléculaires et à libérer les agents de croissance liés à ces composants. Selon un mode d'exécution préféré on chauffe le surnageant à une température comprise entre 120 et 1 SOC, la durée de l'hydrolyse étant choisie en fonction de la concentration en acide de la pression, et de la température. De préférence, I'hydrolysat est ensuite neutralisé et peut être concentré puis séché.
Si l'on utilise de l'acide sulfureux, celui-ci peut être éliminé de l'hydrolysat par chauffage puis être récupéré par adsorption ou compression et condensation, en vue d'une nouvelle utilisation.
Si l'on utilise d'autres acides, le choix de ceux-ci ainsi que celui des agents de neutralisation pourra être effectué en fonction de l'utilisation ultérieure du produit fabriqué. Si, par exemple, le produit est destiné à l'alimentation animale, les sels sont indésirables, et il est nécessaire d'éviter leur présence à de fortes concentrations. Dans ces conditions, I'acide sulfurique est de préférence neutralisé par une base contenant du calcium (oxyde, carbonate ou hydroxyde de ce métal) de telle sorte que le sel formé, insoluble, puisse être éliminé facilement.
Selon une variante on peut également utiliser l'ammoniaque à titre d'agent neutralisant. Le produit obtenu dans ces conditions contient un sel d'ammonium qui constitue un ingrédient particulièrement avantageux lorsqu'on utilise le produit pour la culture des micro-organismes.
Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur des bouillons de fermentation obtenus par culture de divers micro-organismes sur différents milieux. Ainsi, par exemple, les micro-organismes peuvent être des levures ou des bactéries, telles que Candida Utilis, Lipolytiera, Candida Lipolytica, Micrococcus cerificans, etc., et le milieu de culture peut contenir, à titre de sources de carbone, des hydrates de carbone, des hydrocarbures (gas-oil, paraffines normales, etc.) ou des hydrocarbures oxygénés tels que le méthanol ou l'éthanol.
Lorsque le bouillon de fermentation contient un hydrocarbure à titre de source de carbone, il est préférable de séparer en premier lieu les cellules du substrat, puis de les traiter afin d'éliminer
les traces d'hydrocarbure. Ce traitement, antérieur à l'acidifica
tion, est avantageusement exécuté par mélange en suspension
aqueuse des cellules séparées du substrat avec une certaine quanti
té de l'hydrocarbure du substrat ou avec un solvant de celuici non miscible à l'eau, par exemple de l'hexane ou un hydrocarbure halogéné.
L'hydrocarbure ou le solvant est ajouté de préférence à
raison de 0,5 à 20% en volume. Aprés mélange intime, une partie
de la phase aqueuse peut être séparée par décantation et recyclée
vers le fermenteur, le reste étant soumis au traitement acide avec
les cellules de micro-organisme, I'hydrocarbure ou le solvant.
Après traitement acide trois phases distinctes se séparent. En pre
mier lieu une phase contenant l'hydrocarbure ou le solvant, en se
cond lieu une phase aqueuse contenant les substances nutritives
résiduelles et les sous-produits de fermentation, et enfin une sus
pension aqueuse de cellules agglomérées. La phase contenant l'hy
drocarbure ou le solvant forme la couche supérieure ou inférieure
du bain de séparation selon qu'elle contient ou non le solvant et
selon la densité de ce solvant. Ces trois phases peuvent être sépa
rées par simple décantation, la phase intermédiaire étant soumise
à l'opération d'hydrolyse finale décrite précédemment.
Le résidu organique soluble obtenu par hydrolyse de la phase
intermédiaire peut être concentré et séché, éventuellement aprés
neutralisation ou, si l'on utilise de l'acide sulfureux, après élimina
tion de l'anhydride sulfureux par chauffage.
Le produit obtenu peut être utilisé à titre de produit de remplacement de la liqueur de trempage de mais ou de l'extrait de levure dans la culture de micro-organismes ou à titre d'additif dans l'alimentation animale.
Le procédé selon l'invention, qui permet d'obtenir des matériaux nutritifs intéressants à partir de sous-produits de fermentation, présente également l'avantage très important de résoudre le problème de l'élimination des effluents produits par les fermentations effectuées à l'échelle industrielle. L'importance de ce problème apparaît lorsque l'on sait que l'obtention de 100 tonnes de protéine à partir d'une biomasse implique la production simultanée de 30 à 50 tonnes de sous-produits organiques qui se présentent sous forme d'une solution aqueuse contenant 5 à 20% de matières séches. Dans ces conditions, même si ces effluents peuvent être concentrés par évaporation, il reste une quantité appréciable de sous-produits liquides dont l'existence pose un problème d'élimination auquel le procédé selon l'invention apporte une solution.
Les.exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Dans ces exemples, les parties et pourcentages sont exprimés en valeurs pondérales.
Exemple 1
On ajoute 10 parties d'une solution d'acide sulfurique à 25% à 90 parties d'un bouillon de fermentation concentré obtenu par culture de Micrococcus oenficans dans un milieu contenant de l'éthanol à titre de source de carbone, ce bouillon contenant 5% de matière cellulaire sèche. Le bouillon acidifié, dont le pH est de 0,75, est chauffé à 600 C et maintenu à cette température pendant 60 minutes.
Le bouillon est ensuite refroidi à 300 C par dilution dans 200 parties d'eau et centrifugé. L'effluent obtenu, soit 250 parties, est chauffé à 120"C pendant 30 minutes puis neutralisé avec 2 parties d'hydroxyde de calcium. Le surnageant libéré par décantation du sulfate de calcium est concentré jusqu'à teneur en matières solides de 15%, filtré et séché par atomisation.
La composition chimique du produit ainsi obtenu est la suivante:
EMI2.1
<tb> <SEP> Vitamines <SEP> mg/100 <SEP> g
<tb> <SEP> Lipides <SEP> J
<tb> Acides <SEP> aminés <SEP> Hydrates <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> Pantothénate
<tb> <SEP> Peptides <SEP> Nucléotides <SEP> de <SEP> carbone <SEP> + <SEP> cendres <SEP> BJ <SEP> B2 <SEP> Bo <SEP> PP <SEP> de <SEP> calcium <SEP> Biotine
<tb> <SEP> 23 <SEP> O/o <SEP> 29 <SEP> O/o <SEP> 13 <SEP> O/o <SEP> 30 <SEP> oxo <SEP> 0,65 <SEP> 7,3 <SEP> 0,8 <SEP> 35 <SEP> 10 <SEP> 1,1
<tb>
Ce produit peut être ajouté à un aliment pour animaux à raison de 1%, ou être utilisé à titre de supplément nutritif dans un milieu de culture de
micro-organisme.
Exemple 2
On obtient un bouillon de fermentation par culture de Candida lypolitica dans un milieu contenant à titre de sources de carbone, des paraffines linéaires comportant 10 à 24 atomes de carbone. 1000 parties de ce bouillon, contenant 2% de matière cellulaire séche ainsi que des traces de ces paraffines linéaires sont intimement mélangées avec 5 parties du mélange de paraffines li néaires comportant 10 à 24 atomes de carbone utilisé comme substrat. Le mélange étant maintenu au repos on sépare par décantation une phase aqueuse et une phase contenant les hydrocarbures, les cellules de micro-organisme et les sous-produits de fermentation en solution.
On ajoute ensuite à 250 parties de la phase non aqueuse 25 parties d'une solution d'acide sulfurique à 25% et la solution obtenue, dont la concentration en acide est de 0,5 N, est chauffée à 700 C et laissée au repos pendant 45 minutes. Le mélange, en se refroidissant, se sépare en trois phases distinctes: une phase contenant les hydrocarbures, une phase aqueuse et des sédiments constitués par les cellules de micro-organisme. La phase contenant les hydrocarbures est récupérée afin d'être neutralisée, les cellules sont soumises aux traitements d'extraction de la protéine, et la phase aqueuse contenant l'acide, les sous-produits de fermentation et les sels résiduels est chauffée à 1400 C et maintenue au repos pendant 30 minutes.
Après cette réaction d'hydrolyse, on neutralise l'acide en ajoutant 10 parties d'une solution d'ammoniaque à 20%. Après concentration et séchage du surnageant on obtient 14 parties d'un produit dont la composition est la suivante:
Acides aminés Lipides Sulfate d'ammonium
Peptides Nucléotides Hydrates de carbone et cendres
11 O/o 10 /o 19 O/o 57 oxo
Ce produit peut être utilisé à titre de supplément nutritif dans un milieu de fermentation à raison de 0,1 à 1,0%.
Exemple 3
1000 parties d'un bouillon de fermentation obtenu par culture de Micrococcus cenficans sur des paraffines linéaires comportant 10 à 24 atomes de carbone, contenant 1,5% de matière cellulaire sèche ainsi que des traces de paraffines sont concentrées par centrifugation jusqu'à une teneur en matière cellulaire séche de 6%.
La suspension obtenue est ensuite soumise à un traitement mécanique en vue de provoquer la rupture des cellules. A cet effet on soumet la suspension à l'action d'un homogénéisateur du type
Manton Gaulin en trois passes successives effectuées à 700 at et 15 C
300 parties de la suspension ainsi traitée sont ensuite saturées avec de l'anhydride sulfureux jusqu'à une teneur de 70 g d'anhydride sulfureux par litre de suspension puis chauffées à 900 C pendant 60 minutes sous agitation dans une enceinte pressurisée à 4,5 at. A la fin de ce traitement la pression régnant dans l'enceinte est ramenée à la pression atmosphérique, puis l'anhydride sulfureux est éliminé sous vide. La masse de protéine coagulée est ensuite séparée par centrifugation à pH 3,5, lavée à l'eau et séchée par atomisation.
Le surnageant, concentré par évaporation, est finalement séché par atomisation. On obtient ainsi 5 parties d'un produit dont la composition est la suivante:
Acides aminés Lipides
Peptides Nucléotides Hydrates de carbone Cendres
35,5 O/o 34 O/o 20,5 O/o 50 O/o