CH514841A - Dry stable reagents for testing biological liquids - Google Patents

Dry stable reagents for testing biological liquids

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CH514841A
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Abstract

Method for the preparation of a stable reagent for the detection and measurement of the presence of certain components in a biological sample. The dry components of the test reagent are separately stabilised to give a stable reagent which does not require to be used within a specified time as do other liquid test reagents. The test reagents can be used for detecting material of four types, viz. enzymes, biochemical intermediates or metabolites, chemical components of cells or biochemical fluids, or drugs. The dry reagent contng. a stabiliser and material to increase the volume and facilitate handling, usually mannitol, is mixed with water to give a liquid reagent.

Description

  

  
 



  Trockenes stabiles Reagens zur Bestimmung von Substanzen in biologischem Untersuchungsmaterial
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein trokkenes stabiles Reagens zur Bestimmung von Substanzen in biologischem Untersuchungsmaterial mittels einer enzymatischen Reaktion, welches Reagens mindestens ein feuchtigkeitsempfindliches biologisch aktives Enzym oder Coenzym und einen Puffer in solchen Mengen enthält, dass ein gleichmässiger und optimaler Umsetzungsgrad gewährleistet wird. Dieses Reagens ist dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Polyhydroxyverbindung als stabilisierendes Streckmittel enthält. Daneben kann noch ein Stabilisator anwesend sein.



   Der Biochemiker oder der klinische Chemiker muss oft die Menge bestimmter Substanzen messen, die in einem Muster einer biologischen Flüssigkeit oder eines biologischen Gewebes anwesend sind. Zur Untersuchung solcher Probleme kann man ein flüssiges Reagens benützen, das einen oder mehrere biologische Stoffe enthält, die mit der zu untersuchenden Substanz eine enzymatische Reaktion eingehen. Durch quantitative Beobachtung dieser Reaktion mittels physikalischer Messmethoden ist es möglich, die Menge der ursprünglich vorhandenen Unbekannten genau zu bestimmen.



   Da solche Reagenzien eine oder mehrere biologische Komponenten wie Enzyme, Coenzyme und/oder deren Substrate usw. enthalten, ist das Reagens unstabil und hat eine sehr kurze Lebensdauer. Weiterhin sind Mischungen solcher Komponenten sogar noch unstabiler. Um sicher zu gehen, dass das Reagenz seine optimale Stärke hat, muss es gleichzeitig mit der Untersuchung hergestellt werden, da die im Reagenz vorhandenen Enzyme, Coenzyme, Substrate usw. instabil sind. Damit diese Komponenten auch bestimmt mit der richtigen Stärke vorliegen, muss man die Komponenten in konzentrierter Form stabilisieren.



   Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, stabile und lagerfähige Untersuchungsmischungen zu schaffen, die solche instabile Komponenten enthalten. Die Stabilisatoren, die die Grundlage der Erfindung bilden, sind in den Reagenzmischungen vorhanden und bewirken eine Aufrechterhaltung oder Konservierung der Aktivität jeder Komponente und des gesamten Reagenzmaterials.



  Jede Komponente, darunter die enzymhaltigen, kann für sich stabilisiert und in dieser Form für jeden erwünschten Zweck benutzt werden. Die Komponenten können auch miteinander gemischt werden und ein neuartiges Reagenzmaterial bilden. Daher enthält das sich ergebende Reagenzmaterial alle Bestandteile ausser Wasser zur Herstellung einer Reagenzflüssigkeit, die die Ausführung biologischer Untersuchungen wie oben beschrieben gestattet.



   Auf diese Weise kann man das Reagenzmaterial in Behälter verpacken, die leicht zu handhaben und zu verwenden sind. Jede Packung kann eine solche Menge an Reagenzmaterial enthalten, die für eine bestimmte Anzahl Untersuchungen, z. B. für eine Untersuchung, benötigt wird. Das erfindungsgemässe Reagenzmaterial enthält ein Stabilisier- und Streckmittel, welches einerseits dazu dient, das Volumen des Reagenzmaterials auf eine bestimmte Normalgrösse zu bringen, wobei als Normalgrösse die für eine Untersuchung benötigte Menge gilt, und andererseits die Enzykomponenten der Reagenzmischung stabilisiert.



   Zur Ausführung einer Untersuchung wird der Inhalt einer Einheitspackung nach der Erfindung mit einer bestimmten Wassermenge gemischt, so dass eine Reagenzflüssigkeit für eine Einzeluntersuchung entsteht.



  Vorzugsweise verwendet man als Streck- und Stabilisiermittel Mannit; es können auch andere, ähnliche Polyhydroxylverbindungen benutzt werden.



   Im vorliegenden Falle gehören die zu bestimmenden unbekannten Verbindungen einer Klasse an, die in vier getrennte Gruppen aufgeteilt werden kann. Die erste Gruppe besteht aus Enzymen wie Carboxylasen, Dehydrogenasen, Hydrolasen, Isomerasen, Oxidasen, Phos  phorylasen und Transferasen. Beispiele sind Lactatdehydrogenase, Alkaliphosphatase, Glucoseoxidase, Mus   kelphosphorylase,    Glutamat-Oxalacetat-Trans aminase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Cholinesterase, Glu   tamat-Pyruvat-Trans aminase,    Malatdehydrogenase, Säurephosphatase, Prostatinsäure-(prostatic acid)-Phosphatase, Esterase, Diesterase, Lipase, Amylase, Sorbitdehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Isocitrat-Dehydrogenase, a-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Aldolase, Glutamat-Decarboxylase, Uricase, Galactowaldenase, Triosephosphat-Isomerase, Carbonsäureanhydrase,

   Trypsin und Chymotrypsin, Leucinaminopeptidase, 3-Phosphoglyceraldehyd-Dehydrogenase, einschliesslich Kinasen wie Creatinkinase.



   Die zweite Gruppe enthält biochemische Zwischenprodukte oder Stoffwechselprodukte. Beispiele sind Glucose, Milchsäure, Brenztraubensäure, Adenosintriphosphat, Phenylbrenztraubensäure, 3-Methoxy-4-hydroxymandelsäure, Cholestrein, Creatin, Creatinin, Harnstoff, Harnsäure, Asparaginsäure und Glycin.



   Die dritte Gruppe umfasst chemische Zellbestandteile oder biologische Flüssigkeiten, z. B. gelöstes Kohlendioxid, Triglyceride, Proteine, Stärke, Glycogen, Hämoglobin und Insulin.



   In die vierte Gruppe gehören Drogen und Gifte wie Antimycin A, Diisopropylfluophosphat, Sulfathiazol, Äthanol, Acetaldehyd und Barbiturate.



   Um eine Probe auf eine dieser Unbekannten zu untersuchen, wird das aus den erfindungsgemässen stabilisierten Reagenzmischungen hergestellte flüssige Reagenz mit der Probe gemischt, um eine enzymatische Reaktion hervorzurufen. Die auftretende Reaktion sollte einen physikalischen Effekt zur Folge haben, der leicht zu messen ist. Beispielsweise kann die optische Dichte der Probemischung bei einer bestimmten Wellenlänge im Verhältnis des Reaktionsablaufes ändern.



   Wenn die Einheitsmenge des aufgelösten Reagens mit der Probe gemischt wird, ist ein Substrat vorhanden, das an der Reaktion teilnimmt, ein die Reaktion katalysierendes Enzym sowie ein Coenzym, das im Verlaufe der Reaktion oxydiert oder reduziert wird, so dass eine erwünschte   Anderung    in der Probenmischung eintritt, z. B. seiner optischen Dichte. Alle Bestandteile, die die Probe nicht enthält, sind im stabilisierten Reagenzmaterial enthalten. Ausserdem enthält das Reagenzmaterial eine oder mehrere Substanzen, wie z. B. das vorzugsweise verwendete Mannit, um das Reagenzmaterial zu stabilisieren und die Aktivität der verschiedenen Komponenten zu erhalten. Weiterhin können eine oder mehrere Puffersubstanzen vorgesehen sein, die die Wirkung haben, in der Probemischung geeignete Bedingungen zu schaffen, damit die Reaktion mit optimaler Geschwindigkeit abläuft.



   Wenn die zu untersuchende Unbekannte ein Enzym ist, so enthält das Reagenz nicht notwendigerwise auch ein Enzym. Gemäss einer Ausführungsform ist das Reagenzmaterial frei von Enzymen, enthält aber einen oder mehrere andere Bestandteile, wie z. B. ein Substrat, welches mit einer Geschwindigkeit resp. bis zu einem Grade reagiert, die durch den Grad der Aktivität der ursprünglich in der Probe vorhandenen Unbekannten resp. des Enzyms gegeben sind.



   Eine zweite Ausführungsart des Reagenzmaterials enthält ein Substrat, das mit der unbekannten Substanz und einem im Reagenzmaterial vorhandenen Enzym, das die Reaktion katalysiert, reagiert. Zur Herstellung des Reagenzmaterials dieser Ausführungsform wählt man zuerst ein oder mehrere Substrate und ein oder mehrere Enzyme, die eine enzymatische Prüfreaktion hervorrufen und deren wunschgemässen Ablauf sichern.



  Das jeweils gewählte Enzym hängt natürlich von der Art der zu bestimmenden unbekannten Substanz ab und von der Reaktion, die es hervorrufen soll. Im allgemeinen wählt man die Enzyme aus der Klasse der Carboxylasen, Dehydrogenasen, Hydrolasen, Isomerasen, Oxidasen, Phosphorylasen und Transferasen. In diese Klasse gehören beispielsweise Lactatdehydrogenase, Alkaliphosphatase, Glucoseoxidase, Muskelphosphorylase, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Cholinesterase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Malatdehydrogenase, Säurephosphatase, Prostatinsäurephosphatase, Esterase, Diesterase, Lipase, Amylase, Sorbitdehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Isocitratdehydrogenase, a-Hydroxy-butyrat-Dehydrogenase, Aldolase, Glutamatdecarboxylase, Uricase, Galactowaldenase, Triosephosphatisomerase, Carbonsäureanhydrase, Leucinaminopeptidase,

   3-Phosphoglyceraldehyd-Dehydrogenase, Trypsin, Chymotrypsin, ss-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase.



   In den erfindungsgemässen Reagenzmischungen können bestimmte spezifische Stabilisatoren der Enzymkomponente selbst zugegeben werden wie Schleimgummis oder Polysaccharide, z. B. Gummi arabicum, Isländisch Moos, Pektin usw., Polymere wie Polyvinylpyrrolidin, Polyvinylalkohol, ein Puffer wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, ein Komplexbildner wie   Athylen-    diamintetraessigsäure; ein inertes lösliches Protein wie Rinderserumalbumin, ein Salz eines mehrwertigen Ions wie Natrium-Kalium-tartrat oder eine Sulfhydrylverbindung wie Dithioerythrit, Cystein oder reduziertes Glutathion.



   Ausserdem wurde gefunden, dass es erwünscht ist und den Gegenstand dieser Erfindung darstellt, zu den genannten spezifischen Verbindungen ein Streck- und Stabilisiermittel der Mischung zuzugeben. Dieses Mittel kann eine Polyhydroxylverbindung wie Mannit, Sorbit, Lactose, oder Polymere von Polyhydroxylverbindungen mit 1-5 Hydroxylgruppen pro Monomereinheit, wie Polyvinylalkohol, sein. Dieses Mittel ist bei der Untersuchungsreaktion ohne Wirkung. Daher ist die zugegebene Menge an Streckmittel nicht kritisch und kann in weiten Grenzen schwanken. Das Streckmittel übt jedoch mehrere unerwartete und nützliche Funktionen aus. Zuerst neigt es dazu, die Stabilität des Reagenzmaterials weiter zu erhöhen.

  Derartige Mittel haben die Fähigkeit, begrenzte Mengen an Feuchtigkeit zu absorbieren und zurückzuhalten, so dass das Reagenzmaterial praktisch nicht angegriffen wird, wenn es nicht zu grossen Feuchtigkeitsmengen ausgesetzt wird. Dadurch wird die Stabilität des Reagenzmaterials erhöht und dessen Aktivitätsverlust verhindert. Es wurde ausserdem ermittelt, dass das Streckmittel das Reagenzmaterial konserviert, indem die Verträglichkeit seiner Bestandteile erhöht wird. Ausserdem wurde gefunden, dass derartige Streckmittel die Widerstandsfähigkeit des Rea   genzmaterials    gegen relativ hohe Temperaturen, etwa 500 C, für längere Zeiten erhöhen. Bisher verursachten Temperaturen in diesem Bereich eine schnelle Zerstörung der Enzyme, Coenzyme und anderer Bestandteile.

 

   Zweitens wurde ermittelt, dass durch die Gegenwart des Streckmittels sich das Reagenzmaterial schneller in Wasser löst. Dadurch wird nicht nur die Zeit zur Her  stellung der Reagenzlösung verkürzt, sondern auch die Bequemlichkeit der Herstellung erhöht, indem nicht mehr so sehr gerührt oder geschüttelt werden muss.



   Da das Streckmittel nicht an der Reaktion teilnimmt oder die Komponenten des   Reaktionsmaterials    beeinflusst, kann die Menge an zugegebenem Streckmittel in weiten Grenzen schwanken. Nach Herstellung einer Reaktionsmaterialcharge kann man seine Stärke resp. Aktivität bestimmen. Dann kann das Streckmittel zur Standardisierung des Reagenzmaterials auf ein bestimmtes Aktivitätsniveau zugegeben werden. Dadurch hat das Reagenzmaterial stets einen bestimmten Aktivitätswert pro Mengeneinheit, unabhängig von der jeweiligen Herstellungscharge. Von den erwähnten Mitteln wird vorzugsweise Mannit verwendet.



   Nach Zugabe des Streckmittels zum Reagenzmaterial kann es in Einheitsmengen mit einer bestimmten, gleichmässigen Grösse aufgeteilt werden. Diese Menge ist im allgemeinen gerade gross genug, um eine Einzeluntersuchung auszuführen, oder eine ganze Zahl von Untersuchungen. Jede dieser Einheitsmengen kann dann in ein Gefäss wie Kapsel, Ampulle oder Tablette verpackt werden.



   Auf diese Weise kann man eine Vielzahl von praktisch identischen Packungen wie Folienkapseln oder andere Kapseln vorsehen. Jede Kapsel enthält dann die zur Ausführung einer Einzeluntersuchung gerade benötigte Menge an Reaktionsmaterial. Zur Ausführung einer Untersuchung nimmt man eine Packung mit dem zur betreffenden Untersuchung geeigneten Reagenzmaterial. Dieses ist in bezug auf Menge und Aktivität vereinheitlicht. Es kann nun unmittelbar in einer Standardmenge Wasser zu einem flüssigen Reagenz gelöst werden. Dieses flüssige Reagenz wird dann mit dem Muster gemischt, um die enzymatische Reaktion auszuführen. Der Verlauf oder die Geschwindigkeit der Reaktion ist eine Funktion der Menge oder der Aktivität der unbekannten Substanz.

  Jede Untersuchung hat unabhängig vom jeweiligen Untersuchungsfall die Umwandlung eines Coenzyms von einer Form in eine andere zur Folge, wobei die eine Form bei einer bestimmten Wellenlänge optisch absorbierend ist. Demgemäss ändert sich die optische Dichte der Probe als Funktion der unbekannten Substanz. Durch Messung der optischen Dichte des Mediums zu verschiedenen Zeiten ist es also möglich, die Menge resp. den Aktivitätsgrad der unbekannten Substanz in der Originalprobe zu berechnen.



   Die folgenden Beispiele veranschaulichen beispielsweise stabilisierte Reagenzmischungen gemäss der Erfindung.



   Beispiel 1
Ein Reagenz zur Bestimmung der Aktivität von Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) in einem Serum durch Beobachtung der   Anderung    der optischen Dichte besteht aus einer trockenen Mischung folgender Stoffe: Enzym: Lactatdehydrogenase (LDH) Puffer: Phosphatpuffer   (NaH2PO4      +      Na2HPO4)    Stabilisator:   Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan    und sein Sulfat, Ammoniumsulfat, Äthylendi amintetraessigsäure, Gummi arabicum und Albumin Substrat: L-Alanin und a-Ketoglutarsäure Coenzym: Reduziertes Diphosphopyridinnucleotid  (DPNH) Streckmittel: Mannit
Beispiel 2
Eine Reagenzmischung zur Messung der Aktivität von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) in einem Serum enthält folgende Stoffe in trockener Mischung: Enzym: Malatdehydrogenase (MDH) Puffer:

  Dinatriumhydrogenphosphat Stabilisator: Gummi arabicum, Tris-(hydroxymethyl) aminomethan und sein Sulfat, Ammo niumsulfat,   Athylendiamintetraessigs äure    Substrat: Asparaginsäure und a-Ketoglutarsäure Coenzym: Reduziertes Diphosphopyridin-Nucleotid  (DPNH) Streckmittel: Mannit.



   Beispiel 3
Ein Reagenz zur Messung oder Bestimmung des Aktivitätsgrades von Aldolase in einem Serum enthält folgende Stoffe in trockener Mischung: Enzym: Triosephosphatisomerase und Glycerin aldehydphosphat-Dehydrogenase Puffer: Glykokoll und Natriumpyrophosphat Stabilisator: Gummi arabicum, Albumin, Äthylendi amintetraessigsäure Substrat: Fructose-1,6-diphosphat Coenzym: DPN Entkoppler: Natriumarsenat Streckmittel: Mannit
Beispiel 4
Ein festes Reagenz zur Messung der Menge an Glucose in einem Serum enthält die folgenden Chemikalien: Enzym: Hexokinase und Glucose-6-phosphat-De hydrogenase Puffer: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan succinat Stabilisator: Gummi arabicum, Tris-(hydroxymethyl) aminomethansulfat und Ammoniumsulfat Substrat: keines Beschleuniger: Insulin und Magnesiumasparaginat Coenzyme: Adenosintriphosphat und Triphosphopy ridinnucleotid Streckmittel: Mannit.



   Beispiel 5
Ein festes Reagenz zur Messung des Aktivitätsgrades von Adenosintriphosphat (ATP) in einer biologischen Probe besteht aus der trockenen Mischung folgender trockener Stoffe: Enzym: Hexokinase und Glucose-6-phosphat-de hydrogenase Puffer: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan succinat Stabilisator: Gummi arabicum, Tris-(hydroxymethyl) aminomethan und Ammoniumsulfat Beschleuniger: Insulin und Magnesiumasparaginat Substrat: Glucose Coenzym: TPN Streckmittel: Mannit  
Beispiel 6
Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an Malatdehydrogenase (MDH) in einem Serum besteht aus der trockenen Mischung folgender Substanzen: Puffer: Natriumphosphat und Kaliumphosphat Substrat: Oxalessigsäure Coenzym: DPNH Streckmittel:

  Mannit
Beispiel 7
Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an Lactatdehydrogenase (LDH) in einer Serumprobe besteht aus der trockenen Mischung folgender Stoffe: Puffer:   NasHPO4    und   KH2P04    Substrat:   Natriumpyruvat    Coenzym: DPNH Streckmittel: Mannit.



   Beispiel 8
Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an a Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH) in einem Serum besteht aus der Trockenmischung folgender Stoffe: Puffer:   Na2HPO4    und KH2PO4 Substrat: Natrium-a-ketobutyrat Coenzym: DPNH Streckmittel: Mannit
Beispiel 9
Ein Reagenz zur Bestimmung des Aktivitätsgrades von Glucose-6-phosphatdehydrogenase besteht aus der Trockenmischung folgender Stoffe: Puffer: Tris-succinat Substrat: Glucose-6-phosphat, Natriumsalz Coenzym: TPN Beschleuniger: Magnesiumsulfat, -glutamat oder  -asparaginat Streckmittel: Mannit
Beispiel 10
Ein festes Reagenz zur Messung der Menge an Harnstoff oder Harnstoff-N in einer Serumprobe besteht aus einer Trockenmischung folgender Stoffe: Enzym: Urease und Glutamindehydrogenase Stabilisator: Dithioerythrit und Natriumkaliumtartrat Puffer:

  Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan Substrate: a-Ketoglutarsäure oder ihre Salze Coenzym: Reduziertes Diphosphopyridinnucleotid  (DPNH) Aktivator: Adenosindiphosphat, Natriumsalz Streckmittel: Mannit
Dithioerythrit wurde als bevorzugte Sulfhydrylverbindung ermittelt; andere Komponenten, wie Cystein und Glutathion, sind aber gleichfalls brauchbar. Ein bevorzugtes Salz ist Natriumkaliumtartrat; man kann aber auch andere Salze wie Natriumsulfat, -tartrat und -glutamat sowie Kaliumsulfat mit Vorteil verwenden.



   Beispiel 11
Ein festes Reagenz zur Messung des Aktivitätsgrades von Creatinkinase, Creatinphosphokinase (CPK) in einer biologischen Probe besteht aus einer Trockenmischung der folgenden festen Substanzen: Enzym: Hexokinase und Glucose-6-phosphat-de hydrogenase Puffer: Tris-succinat Stabilisator: Gummi arabicum, Tris-sulfat, Ammo niumsulfat und Cystein Substrate: Creatinphosphat und Glucose Aktivator: Magnesiumsulfat Beschleuniger: Insulin Coenzyme: Adenosintriphosphat und Triphosphopy ridinnucleotid (TPN) Inhibitor: Adenosinmonophosphat Streckmittel: Mannit
Beispiel 12
Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an Lactatdehydrogenase (LDH) in einem Serum besteht aus der Trockenmischung der folgenden Substanzen: Puffer: Glycin und Natriumcarbonat Substrat: Lithiumlactat Coenzym: Diphosphopyridinnucleotid (DPN) Streckmittel:

  Mannit
PATENTANSPRUCH 1
Trockenes stabiles Reagens zur Bestimmung von Substanzen in biologischem Untersuchungsmaterial mittels einer enzymatischen Reaktion, welches Reagens mindestens ein feuchtigkeitsempfindliches biologisch aktives Enzym oder Coenzym und einen Puffer in solchen Mengen enthält, dass ein gleichmässiger und optimaler Umsetzungsgrad gewährleistet wird, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Polyhydroxyverbindung als stabilisierendes Streckmittel enthält.



   UNTERANSPRÜCHE
1. Reagens nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es neben dem stabilisierenden Streckmittel noch einen besonderen Stabilisator enthält.



   2. Reagens nach Unteranspruch 1 zur Bestimmung von Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase, dadurch gekennzeichnet, dass es als Substrat trockene Asparagin Malatdehydrogenase, das trockene Coenzym Diphospphopyridinnucheotid in reduzierter Form, als Puffer ein Alkalimetallphosphat, als Stabilisator einen Schleim Gummi, ein Polysaccharid, ein Hydroxyalkylamin,   At-    hylendiamin-tetraessigsäure oder deren Salze oder ein Sulfatanion, und als stabilisierendes Streckmittel Mannit enthält.

 

   3. Reagens nach Unteranspruch 1 zur Bestimmung von Harnstoff, dadurch gekennzeichnet, dass es a Ketoglutarsäure als Substrat, Urease und Glutamindehydrogenase als Enzym, ein Coenzym aus der Gruppe der   Pyridinnucleotide,    Natriumadenosindiphosphat als Aktivator, Natrium- oder Kaliumphosphate, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Natrium- oder Kaliumbicarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat oder Glycin als Puffer, Dithioerythrit und Natriumkaliumtartrat als Stabilisator und Mannit als stabilisierendes Streckmittel enthält.



   4. Reagens nach Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan ist. 

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  Dry stable reagent for the determination of substances in biological test material
The present invention relates to a dry, stable reagent for the determination of substances in biological test material by means of an enzymatic reaction, which reagent contains at least one moisture-sensitive biologically active enzyme or coenzyme and a buffer in such amounts that a uniform and optimal degree of conversion is ensured. This reagent is characterized in that it further contains a polyhydroxy compound as a stabilizing extender. A stabilizer can also be present.



   The biochemist or clinical chemist often has to measure the amount of certain substances that are present in a sample of biological fluid or tissue. To investigate such problems, one can use a liquid reagent that contains one or more biological substances that enter into an enzymatic reaction with the substance under investigation. By quantitative observation of this reaction using physical measuring methods, it is possible to precisely determine the amount of the originally present unknowns.



   Since such reagents contain one or more biological components such as enzymes, coenzymes and / or their substrates, etc., the reagent is unstable and has a very short life. Furthermore, mixtures of such components are even more unstable. To ensure that the reagent is at its optimal strength, it must be prepared at the same time as the test, as the enzymes, coenzymes, substrates, etc. present in the reagent are unstable. In order for these components to be available with the correct strength, the components must be stabilized in a concentrated form.



   It is an object of the present invention to provide stable and storable test mixtures which contain such unstable components. The stabilizers which form the basis of the invention are present in the reagent mixtures and act to maintain or preserve the activity of each component and of the entire reagent material.



  Each component, including the enzyme-containing ones, can be stabilized by itself and used in this form for any desired purpose. The components can also be mixed together to form a novel reagent material. Therefore, the resulting reagent material contains all of the ingredients except water for the preparation of a reagent liquid that allows biological studies to be carried out as described above.



   In this way, the reagent material can be packaged in containers that are easy to handle and use. Each pack can contain an amount of reagent material necessary for a certain number of examinations, e.g. B. for an investigation is required. The reagent material according to the invention contains a stabilizer and extender, which serves on the one hand to bring the volume of the reagent material to a certain normal size, the normal size being the amount required for an investigation, and on the other hand to stabilize the enzyme components of the reagent mixture.



   To carry out an examination, the contents of a unit pack according to the invention are mixed with a certain amount of water, so that a reagent liquid is produced for an individual examination.



  Mannitol is preferably used as an extender and stabilizer; other similar polyhydroxyl compounds can also be used.



   In the present case, the unknown compounds to be determined belong to a class that can be divided into four separate groups. The first group consists of enzymes such as carboxylases, dehydrogenases, hydrolases, isomerases, oxidases, phosphorylases and transferases. Examples are lactate dehydrogenase, alkali phosphatase, glucose oxidase, muscle phosphorylase, glutamate oxaloacetate trans aminase, phosphoenolpyruvate carboxylase, cholinesterase, glutamate pyruvate trans aminase, malate dehydrogenase, ester, lipophosphate (lipid) phosphatase, prostate acidase, lipophosphate , Amylase, sorbitol dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, a-hydroxybutyrate dehydrogenase, aldolase, glutamate decarboxylase, uricase, galactowaldenase, triose phosphate isomerase, carboxylic acid anhydrase,

   Trypsin and chymotrypsin, leucine aminopeptidase, 3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase, including kinases such as creatine kinase.



   The second group contains biochemical intermediates or metabolites. Examples are glucose, lactic acid, pyruvic acid, adenosine triphosphate, phenylpyruvic acid, 3-methoxy-4-hydroxymandelic acid, cholestrein, creatine, creatinine, urea, uric acid, aspartic acid and glycine.



   The third group includes chemical cell components or biological fluids, e.g. B. dissolved carbon dioxide, triglycerides, proteins, starch, glycogen, hemoglobin and insulin.



   The fourth group includes drugs and poisons such as antimycin A, diisopropylfluophosphate, sulfathiazole, ethanol, acetaldehyde and barbiturates.



   In order to examine a sample for one of these unknowns, the liquid reagent produced from the stabilized reagent mixtures according to the invention is mixed with the sample in order to cause an enzymatic reaction. The reaction that occurs should result in a physical effect that is easy to measure. For example, the optical density of the sample mixture can change at a certain wavelength in relation to the course of the reaction.



   When the unit amount of the dissolved reagent is mixed with the sample, there is a substrate which takes part in the reaction, an enzyme which catalyzes the reaction, and a coenzyme which is oxidized or reduced in the course of the reaction, so that a desired change in the sample mixture occurs, e.g. B. its optical density. All components that the sample does not contain are contained in the stabilized reagent material. In addition, the reagent material contains one or more substances, such as. B. the preferably used mannitol to stabilize the reagent material and to maintain the activity of the various components. Furthermore, one or more buffer substances can be provided which have the effect of creating suitable conditions in the sample mixture so that the reaction proceeds at an optimal rate.



   If the unknown to be examined is an enzyme, the reagent does not necessarily also contain an enzyme. According to one embodiment, the reagent material is free from enzymes, but contains one or more other components, such as. B. a substrate which, respectively, at a speed. reacts to a degree that resp. by the degree of activity of the unknowns originally present in the sample. of the enzyme are given.



   A second embodiment of the reagent material contains a substrate which reacts with the unknown substance and an enzyme which is present in the reagent material and which catalyzes the reaction. In order to produce the reagent material of this embodiment, one or more substrates and one or more enzymes are first selected which cause an enzymatic test reaction and ensure that it proceeds as desired.



  The particular enzyme chosen depends of course on the type of unknown substance to be determined and on the reaction that it is intended to cause. In general, the enzymes are selected from the class of the carboxylases, dehydrogenases, hydrolases, isomerases, oxidases, phosphorylases and transferases. This class includes, for example, lactate dehydrogenase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, muscle phosphorylase, glutamate oxaloacetate transaminase, phosphoenolpyruvate carboxylase, cholinesterase, glutamate pyruvate transaminase, malate dehydrogenase, lipid dehydrogenase, aminate dehydrogenase, glucose, esterylase, esterylase, ester-6-phosphatase, ester-6-phosphatase, ester-6-phosphate phosphate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, a-hydroxy-butyrate dehydrogenase, aldolase, glutamate decarboxylase, uricase, galactowaldenase, triosephosphate isomerase, carboxylic acid anhydrase, leucine aminopeptidase,

   3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase, trypsin, chymotrypsin, β-hydroxybutyrate dehydrogenase.



   In the reagent mixtures according to the invention, certain specific stabilizers can be added to the enzyme component itself, such as gums or polysaccharides, e.g. B. gum arabic, Iceland moss, pectin, etc., polymers such as polyvinylpyrrolidine, polyvinyl alcohol, a buffer such as tris (hydroxymethyl) aminomethane, a complexing agent such as ethylene diamine tetraacetic acid; an inert soluble protein such as bovine serum albumin, a salt of a polyvalent ion such as sodium potassium tartrate, or a sulfhydryl compound such as dithioerythritol, cysteine, or reduced glutathione.



   It has also been found that it is desirable and the subject matter of this invention to add an extender and stabilizer to the mixture for the specific compounds mentioned. This agent can be a polyhydroxyl compound such as mannitol, sorbitol, lactose, or polymers of polyhydroxyl compounds having 1-5 hydroxyl groups per monomer unit, such as polyvinyl alcohol. This agent has no effect on the test reaction. The amount of extender added is therefore not critical and can vary within wide limits. However, the extender performs several unexpected and useful functions. First, it tends to further increase the stability of the reagent material.

  Such agents have the ability to absorb and retain limited amounts of moisture, so that the reagent material is practically not attacked if it is not exposed to excessive amounts of moisture. This increases the stability of the reagent material and prevents its loss of activity. It has also been determined that the extender preserves the reagent material by increasing the compatibility of its components. It has also been found that such extenders increase the resistance of the reagent material to relatively high temperatures, about 500 ° C., for longer times. Previously, temperatures in this area caused rapid destruction of enzymes, coenzymes and other components.

 

   Second, it was found that the presence of the diluent causes the reagent material to dissolve more rapidly in water. This not only shortens the time to prepare the reagent solution, but also increases the convenience of preparation, as there is no longer so much need to stir or shake.



   Since the extender does not take part in the reaction or influences the components of the reaction material, the amount of extender added can vary within wide limits. After producing a batch of reaction material, you can set its strength or Determine activity. Then the diluent can be added to standardize the reagent material to a certain level of activity. As a result, the reagent material always has a certain activity value per unit of quantity, regardless of the respective production batch. Of the agents mentioned, mannitol is preferably used.



   After the extender has been added to the reagent material, it can be divided into unit quantities of a certain, uniform size. This amount is generally just large enough to carry out a single test or a whole number of tests. Each of these unit quantities can then be packaged in a container such as a capsule, ampoule or tablet.



   In this way, a large number of practically identical packs such as foil capsules or other capsules can be provided. Each capsule then contains the amount of reaction material needed to carry out an individual test. To carry out an examination, one takes a pack with the reagent material suitable for the examination in question. This is unified in terms of quantity and activity. It can now be dissolved directly in a standard amount of water to form a liquid reagent. This liquid reagent is then mixed with the sample to carry out the enzymatic reaction. The course or speed of the reaction is a function of the amount or activity of the unknown substance.

  Regardless of the particular case, every examination results in the conversion of a coenzyme from one form to another, with one form being optically absorbent at a certain wavelength. Accordingly, the optical density of the sample changes as a function of the unknown substance. By measuring the optical density of the medium at different times, it is possible to determine the amount, respectively. calculate the activity level of the unknown substance in the original sample.



   The following examples illustrate, for example, stabilized reagent mixtures according to the invention.



   example 1
A reagent for determining the activity of glutamate pyruvate transaminase (GPT) in a serum by observing the change in optical density consists of a dry mixture of the following substances: Enzyme: lactate dehydrogenase (LDH) buffer: phosphate buffer (NaH2PO4 + Na2HPO4) stabilizer: Tris - (hydroxymethyl) aminomethane and its sulphate, ammonium sulphate, ethylenediaminetetraacetic acid, gum arabic and albumin Substrate: L-alanine and a-ketoglutaric acid Coenzyme: reduced diphosphopyridine nucleotide (DPNH) Extender: mannitol
Example 2
A reagent mixture for measuring the activity of glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) in a serum contains the following substances in a dry mixture: Enzyme: Malate dehydrogenase (MDH) Buffer:

  Disodium hydrogen phosphate stabilizer: Gum arabic, tris (hydroxymethyl) aminomethane and its sulfate, ammonium sulfate, ethylenediaminetetraacetic acid. Substrate: aspartic acid and a-ketoglutaric acid Coenzyme: Reduced diphosphopyridine nucleotide (DPNH) Extender: mannitol.



   Example 3
A reagent for measuring or determining the level of activity of aldolase in a serum contains the following substances in a dry mixture: Enzyme: triosephosphate isomerase and glycerol aldehyde phosphate dehydrogenase Buffer: glycocolland sodium pyrophosphate Stabilizer: gum arabic, albumin, ethylenediaminetetraacetic acid Substrate: fructose-1,6- diphosphate coenzyme: DPN decoupler: sodium arsenate extender: mannitol
Example 4
A solid reagent for measuring the amount of glucose in a serum contains the following chemicals: Enzyme: hexokinase and glucose-6-phosphate de hydrogenase buffer: tris (hydroxymethyl) aminomethane succinate stabilizer: gum arabic, tris (hydroxymethyl) aminomethane sulfate and ammonium sulfate substrate: none accelerator: insulin and magnesium asparaginate coenzymes: adenosine triphosphate and triphosphopyridine nucleotide diluent: mannitol.



   Example 5
A solid reagent for measuring the degree of activity of adenosine triphosphate (ATP) in a biological sample consists of a dry mixture of the following dry substances: Enzyme: hexokinase and glucose-6-phosphate-de-hydrogenase buffer: tris (hydroxymethyl) aminomethane succinate stabilizer: rubber arabic, tris (hydroxymethyl) aminomethane and ammonium sulphate accelerator: insulin and magnesium asparaginate substrate: glucose coenzyme: TPN extender: mannitol
Example 6
A reagent for determining the amount of malate dehydrogenase (MDH) in a serum consists of a dry mixture of the following substances: Buffer: sodium phosphate and potassium phosphate Substrate: oxaloacetic acid coenzyme: DPNH extender:

  Mannitol
Example 7
A reagent for determining the amount of lactate dehydrogenase (LDH) in a serum sample consists of the dry mixture of the following substances: Buffer: NasHPO4 and KH2P04 Substrate: Sodium pyruvate Coenzyme: DPNH Extender: mannitol.



   Example 8
A reagent for determining the amount of a hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH) in a serum consists of the dry mixture of the following substances: Buffer: Na2HPO4 and KH2PO4 Substrate: Sodium a-ketobutyrate Coenzyme: DPNH Extender: Mannitol
Example 9
A reagent for determining the level of activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase consists of a dry mixture of the following substances: Buffer: Tris-succinate Substrate: Glucose-6-phosphate, sodium salt Coenzyme: TPN Accelerator: Magnesium sulfate, glutamate or asparaginate Extender: mannitol
Example 10
A solid reagent for measuring the amount of urea or urea-N in a serum sample consists of a dry mixture of the following substances: Enzyme: urease and glutamine dehydrogenase Stabilizer: dithioerythritol and sodium potassium tartrate Buffer:

  Tris (hydroxymethyl) aminomethane substrates: a-ketoglutaric acid or its salts coenzyme: reduced diphosphopyridine nucleotide (DPNH) activator: adenosine diphosphate, sodium salt extender: mannitol
Dithioerythritol has been identified as the preferred sulfhydryl compound; however, other components such as cysteine and glutathione can also be used. A preferred salt is sodium potassium tartrate; but you can also use other salts such as sodium sulfate, sodium tartrate and glutamate and potassium sulfate with advantage.



   Example 11
A solid reagent for measuring the activity level of creatine kinase, creatine phosphokinase (CPK) in a biological sample consists of a dry mixture of the following solid substances: Enzyme: hexokinase and glucose-6-phosphate-de-hydrogenase buffer: tris-succinate stabilizer: gum arabic, tris sulfate, ammonium sulfate and cysteine substrates: creatine phosphate and glucose activator: magnesium sulfate accelerator: insulin coenzymes: adenosine triphosphate and triphosphopyridine nucleotide (TPN) inhibitor: adenosine monophosphate extender: mannitol
Example 12
A reagent for determining the amount of lactate dehydrogenase (LDH) in a serum consists of a dry mixture of the following substances: Buffer: Glycine and sodium carbonate Substrate: Lithium lactate Coenzyme: Diphosphopyridine nucleotide (DPN) Extender:

  Mannitol
PATENT CLAIM 1
Dry, stable reagent for the determination of substances in biological test material by means of an enzymatic reaction, which reagent contains at least one moisture-sensitive biologically active enzyme or coenzyme and a buffer in such amounts that a uniform and optimal degree of conversion is ensured, characterized in that it also contains a polyhydroxy compound contains as a stabilizing extender.



   SUBCLAIMS
1. Reagent according to claim I, characterized in that it contains a special stabilizer in addition to the stabilizing extender.



   2. Reagent according to dependent claim 1 for the determination of glutamate oxaloacetate transaminase, characterized in that it contains dry asparagine malate dehydrogenase as the substrate, the dry coenzyme diphosphopyridine neeotide in reduced form, an alkali metal phosphate as a buffer, a mucilage gum, a polysaccharide, a hydroxyalkylamine, a hydroxyalkylamine as a buffer Contains, ethylenediamine-tetraacetic acid or its salts or a sulfate anion, and mannitol as a stabilizing extender.

 

   3. Reagent according to dependent claim 1 for the determination of urea, characterized in that there is a ketoglutaric acid as substrate, urease and glutamine dehydrogenase as enzyme, a coenzyme from the group of pyridine nucleotides, sodium adenosine diphosphate as activator, sodium or potassium phosphates, tris (hydroxymethyl) - contains aminomethane, sodium or potassium bicarbonate, sodium or potassium carbonate or glycine as a buffer, dithioerythritol and sodium potassium tartrate as a stabilizer and mannitol as a stabilizing extender.



   4. Reagent according to dependent claim 3, characterized in that the buffer is tris (hydroxymethyl) aminomethane.

** WARNING ** End of DESC field could overlap beginning of CLMS **.

Claims (1)

**WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. Beispiel 6 Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an Malatdehydrogenase (MDH) in einem Serum besteht aus der trockenen Mischung folgender Substanzen: Puffer: Natriumphosphat und Kaliumphosphat Substrat: Oxalessigsäure Coenzym: DPNH Streckmittel: Mannit Beispiel 7 Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an Lactatdehydrogenase (LDH) in einer Serumprobe besteht aus der trockenen Mischung folgender Stoffe: Puffer: NasHPO4 und KH2P04 Substrat: Natriumpyruvat Coenzym: DPNH Streckmittel: Mannit. ** WARNING ** Beginning of CLMS field could overlap end of DESC **. Example 6 A reagent for determining the amount of malate dehydrogenase (MDH) in a serum consists of the dry mixture of the following substances: Buffer: sodium phosphate and potassium phosphate Substrate: oxaloacetic acid coenzyme: DPNH extender: mannitol Example 7 A reagent for determining the amount of lactate dehydrogenase (LDH) in a serum sample consists of the dry mixture of the following substances: Buffer: NasHPO4 and KH2P04 Substrate: Sodium pyruvate Coenzyme: DPNH Extender: mannitol. Beispiel 8 Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an a Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH) in einem Serum besteht aus der Trockenmischung folgender Stoffe: Puffer: Na2HPO4 und KH2PO4 Substrat: Natrium-a-ketobutyrat Coenzym: DPNH Streckmittel: Mannit Beispiel 9 Ein Reagenz zur Bestimmung des Aktivitätsgrades von Glucose-6-phosphatdehydrogenase besteht aus der Trockenmischung folgender Stoffe: Puffer: Tris-succinat Substrat: Glucose-6-phosphat, Natriumsalz Coenzym: TPN Beschleuniger: Magnesiumsulfat, -glutamat oder -asparaginat Streckmittel: Mannit Beispiel 10 Ein festes Reagenz zur Messung der Menge an Harnstoff oder Harnstoff-N in einer Serumprobe besteht aus einer Trockenmischung folgender Stoffe: Enzym: Urease und Glutamindehydrogenase Stabilisator: Dithioerythrit und Natriumkaliumtartrat Puffer: Example 8 A reagent for determining the amount of a hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH) in a serum consists of the dry mixture of the following substances: Buffer: Na2HPO4 and KH2PO4 Substrate: Sodium a-ketobutyrate Coenzyme: DPNH Extender: Mannitol Example 9 A reagent for determining the level of activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase consists of a dry mixture of the following substances: Buffer: Tris-succinate Substrate: Glucose-6-phosphate, sodium salt Coenzyme: TPN Accelerator: Magnesium sulfate, glutamate or asparaginate Extender: mannitol Example 10 A solid reagent for measuring the amount of urea or urea-N in a serum sample consists of a dry mixture of the following substances: Enzyme: urease and glutamine dehydrogenase Stabilizer: dithioerythritol and sodium potassium tartrate Buffer: Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan Substrate: a-Ketoglutarsäure oder ihre Salze Coenzym: Reduziertes Diphosphopyridinnucleotid (DPNH) Aktivator: Adenosindiphosphat, Natriumsalz Streckmittel: Mannit Dithioerythrit wurde als bevorzugte Sulfhydrylverbindung ermittelt; andere Komponenten, wie Cystein und Glutathion, sind aber gleichfalls brauchbar. Ein bevorzugtes Salz ist Natriumkaliumtartrat; man kann aber auch andere Salze wie Natriumsulfat, -tartrat und -glutamat sowie Kaliumsulfat mit Vorteil verwenden. Tris (hydroxymethyl) aminomethane substrates: a-ketoglutaric acid or its salts coenzyme: reduced diphosphopyridine nucleotide (DPNH) activator: adenosine diphosphate, sodium salt extender: mannitol Dithioerythritol has been identified as the preferred sulfhydryl compound; however, other components such as cysteine and glutathione can also be used. A preferred salt is sodium potassium tartrate; but you can also use other salts such as sodium sulfate, sodium tartrate and glutamate and potassium sulfate with advantage. Beispiel 11 Ein festes Reagenz zur Messung des Aktivitätsgrades von Creatinkinase, Creatinphosphokinase (CPK) in einer biologischen Probe besteht aus einer Trockenmischung der folgenden festen Substanzen: Enzym: Hexokinase und Glucose-6-phosphat-de hydrogenase Puffer: Tris-succinat Stabilisator: Gummi arabicum, Tris-sulfat, Ammo niumsulfat und Cystein Substrate: Creatinphosphat und Glucose Aktivator: Magnesiumsulfat Beschleuniger: Insulin Coenzyme: Adenosintriphosphat und Triphosphopy ridinnucleotid (TPN) Inhibitor: Adenosinmonophosphat Streckmittel: Mannit Beispiel 12 Ein Reagenz zur Bestimmung der Menge an Lactatdehydrogenase (LDH) in einem Serum besteht aus der Trockenmischung der folgenden Substanzen: Puffer: Glycin und Natriumcarbonat Substrat: Lithiumlactat Coenzym: Diphosphopyridinnucleotid (DPN) Streckmittel: Example 11 A solid reagent for measuring the activity level of creatine kinase, creatine phosphokinase (CPK) in a biological sample consists of a dry mixture of the following solid substances: Enzyme: hexokinase and glucose-6-phosphate-de-hydrogenase buffer: tris-succinate stabilizer: gum arabic, tris sulfate, ammonium sulfate and cysteine substrates: creatine phosphate and glucose activator: magnesium sulfate accelerator: insulin coenzymes: adenosine triphosphate and triphosphopyridine nucleotide (TPN) inhibitor: adenosine monophosphate extender: mannitol Example 12 A reagent for determining the amount of lactate dehydrogenase (LDH) in a serum consists of a dry mixture of the following substances: Buffer: Glycine and sodium carbonate Substrate: Lithium lactate Coenzyme: Diphosphopyridine nucleotide (DPN) Extender: Mannit PATENTANSPRUCH 1 Trockenes stabiles Reagens zur Bestimmung von Substanzen in biologischem Untersuchungsmaterial mittels einer enzymatischen Reaktion, welches Reagens mindestens ein feuchtigkeitsempfindliches biologisch aktives Enzym oder Coenzym und einen Puffer in solchen Mengen enthält, dass ein gleichmässiger und optimaler Umsetzungsgrad gewährleistet wird, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Polyhydroxyverbindung als stabilisierendes Streckmittel enthält. Mannitol PATENT CLAIM 1 Dry, stable reagent for the determination of substances in biological test material by means of an enzymatic reaction, which reagent contains at least one moisture-sensitive biologically active enzyme or coenzyme and a buffer in such amounts that a uniform and optimal degree of conversion is ensured, characterized in that it also contains a polyhydroxy compound contains as a stabilizing extender. UNTERANSPRÜCHE 1. Reagens nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es neben dem stabilisierenden Streckmittel noch einen besonderen Stabilisator enthält. SUBCLAIMS 1. Reagent according to claim I, characterized in that it contains a special stabilizer in addition to the stabilizing extender. 2. Reagens nach Unteranspruch 1 zur Bestimmung von Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase, dadurch gekennzeichnet, dass es als Substrat trockene Asparagin Malatdehydrogenase, das trockene Coenzym Diphospphopyridinnucheotid in reduzierter Form, als Puffer ein Alkalimetallphosphat, als Stabilisator einen Schleim Gummi, ein Polysaccharid, ein Hydroxyalkylamin, At- hylendiamin-tetraessigsäure oder deren Salze oder ein Sulfatanion, und als stabilisierendes Streckmittel Mannit enthält. 2. Reagent according to dependent claim 1 for the determination of glutamate oxaloacetate transaminase, characterized in that it has as substrate dry asparagine malate dehydrogenase, the dry coenzyme diphosphopyridine neeotide in reduced form, an alkali metal phosphate as a buffer, a mucilage gum, a polysaccharide, a hydroxyalkylamine, a hydroxyalkylamine as a buffer Contains, ethylenediamine-tetraacetic acid or its salts or a sulfate anion, and mannitol as a stabilizing extender. 3. Reagens nach Unteranspruch 1 zur Bestimmung von Harnstoff, dadurch gekennzeichnet, dass es a Ketoglutarsäure als Substrat, Urease und Glutamindehydrogenase als Enzym, ein Coenzym aus der Gruppe der Pyridinnucleotide, Natriumadenosindiphosphat als Aktivator, Natrium- oder Kaliumphosphate, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Natrium- oder Kaliumbicarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat oder Glycin als Puffer, Dithioerythrit und Natriumkaliumtartrat als Stabilisator und Mannit als stabilisierendes Streckmittel enthält. 3. Reagent according to dependent claim 1 for the determination of urea, characterized in that there is a ketoglutaric acid as substrate, urease and glutamine dehydrogenase as enzyme, a coenzyme from the group of pyridine nucleotides, sodium adenosine diphosphate as activator, sodium or potassium phosphates, tris (hydroxymethyl) - contains aminomethane, sodium or potassium bicarbonate, sodium or potassium carbonate or glycine as a buffer, dithioerythritol and sodium potassium tartrate as a stabilizer and mannitol as a stabilizing extender. 4. Reagens nach Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan ist. 4. Reagent according to dependent claim 3, characterized in that the buffer is tris (hydroxymethyl) aminomethane. 5. Reagens nach Patentanspruch I, zur Bestimmung 5. Reagent according to claim I, for determination von Lactatdehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, dass es als trockenes Substrat Natriumpyruvat, als trockenes Coenzym Diphosphopyridinnucleotid in reduzierter Form, als trockenen Puffer Dinatriumhydrogenphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat, und als stabilisierendes Streckmittel Mannit enthält. of lactate dehydrogenase, characterized in that it contains sodium pyruvate as the dry substrate, diphosphopyridine nucleotide as the dry coenzyme in reduced form, disodium hydrogen phosphate or potassium dihydrogen phosphate as the dry buffer, and mannitol as the stabilizing extender. 6. Reagens nach Unteranspruch 1, zur Bestimmung von Kreatinkinase, dadurch gekennzeichnet, dass es als Substrat Kreatinphosphat und Glucose, als Enzyme Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase, als Coenzyme Adenosindiphosphat und Triphosphopyridinnucleotid, als Aktivator ein Magnesiumsalz, einen Puffer, der zur Einhaltung eines pH-Bereiches von 6,5-7,5 geeignet ist, als Stabilisator Gummi arabicum, Tris-sulfat, Ammoniumsulfat oder Cystein und Mannit als stabilisierendes Streckmittel enthält. 6. Reagent according to dependent claim 1, for the determination of creatine kinase, characterized in that there is creatine phosphate and glucose as substrate, hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase as enzymes, adenosine diphosphate and triphosphopyridine nucleotide as coenzymes, a magnesium salt as activator, a buffer that is required to comply a pH range of 6.5-7.5 is suitable, contains gum arabic, tris-sulfate, ammonium sulfate or cysteine and mannitol as a stabilizing extender as a stabilizer. 7. Reagens nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator Magnesiumsulfat ist. 7. Reagent according to dependent claim 6, characterized in that the activator is magnesium sulfate. 8. Reagens nach Patentanspruch I zur Bestimmung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, dass es als trokkene Enzyme Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase, als trockene Coenzyme Adenosintriphosphat und Triphosphopyridinnucleotid, als Puffer Tris-succinat, als Stabilisator Gummi arabicum, Trissulfat oder Ammoniumsulfat, und als stabilisierendes Streckmittel Mannit enthält. 8. Reagent according to claim I for the determination of glucose, characterized in that it contains hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase as dry enzymes, adenosine triphosphate and triphosphopyridine nucleotide as dry coenzymes, tris-succinate as buffer, gum arabic, trisulfate or ammonium sulfate as stabilizer contains mannitol as a stabilizing extender. 9. Reagens nach Patentanspruch I zur Bestimmung von Lactatdehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, dass es Lithiumlactat als trockenes Substrat, Diphosphopyridinnucleotid als trockenes Coenzym, einen trockenen Puffer, der zur Einhaltung eines pH-Bereiches von 8,0-9,0 geeignet ist, und Mannit als stabilisierendes Streckmittel enthält. 9. Reagent according to claim I for the determination of lactate dehydrogenase, characterized in that it contains lithium lactate as a dry substrate, diphosphopyridine nucleotide as a dry coenzyme, a dry buffer which is suitable for maintaining a pH range of 8.0-9.0, and mannitol contains as a stabilizing extender. 10. Reagens nach Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer Glycin und Natriumcarbonat enthält. 10. Reagent according to dependent claim 9, characterized in that the buffer contains glycine and sodium carbonate. PATENTANSPRUCH II Verfahren zur Herstellung des Reagens gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym bzw. Coenzym und den Puffer in trockener körniger Form mit einer Polyhydroxyverbindung mischt. PATENT CLAIM II Process for the preparation of the reagent according to claim 1, characterized in that the enzyme or coenzyme and the buffer are mixed in dry granular form with a polyhydroxy compound. UNTERANSPRUCH 11. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polyhydroxyverbindung Mannit verwendet. SUBClaim 11. The method according to claim II, characterized in that the polyhydroxy compound used is mannitol. PATENTANSPRUCH III Verwendung des Reagens gemäss Patentanspruch I, zur Bestimmung von Substanzen in biologischem Untersuchungsmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reagens in Wasser löst und dabei eine Lösung mit einer messbaren optischen Dichte herstellt, die so hergestellte Lösung mit dem zu untersuchenden Material mischt und nach erfolgter Reaktion die Änderung der optischen Dichte der Lösung bestimmt. PATENT CLAIM III Use of the reagent according to claim I for the determination of substances in biological test material, characterized in that the reagent is dissolved in water and a solution with a measurable optical density is produced, the solution produced in this way is mixed with the material to be tested and after the reaction has taken place the change in the optical density of the solution is determined.
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