Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptide
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Pentacosapeptide der allgemeinen Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norlcucyl
X-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl
L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L-tyrosyl-Lprolyl-L-valinamid, worin X einen SGlutamyl- oder L-Ghataminylrest be deutet, ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditions salze und Schwermetallkomplexen.
Die unter die allgemeine Formel fallenden Pentacosapeptide können in abgekürzter Schreibweise auch wie folgt bezeichnet werden: D-Ser1-Nloe1-Orn17-(val-NH2)2@-ACTH-1-25 und
D-Ser1-NIC4-Gln3-ORn17-(Val-NH2)25
ACTH-1-25 und besitzen, ebenso wie ihre Salze und Schwermetallkomplexe, eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit.
Es war bereits bekannt, dass man ein Pentacosapeptid der Sequenz D-seryl-ctyrosyl-L-seryl-Gnorleucyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl
L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl
L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl J,arginyl-Garginyl-Gprolyl-Gvalyl-
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-vatinamid mit corticotroper Wirkung, im Nachstehenden mit D-Ser1-Nlc4-(Val-NH2)25-ACTH-1-25 bezeichnet, synthetisieren kann.
DSer1-Nle4-(Val-NH2)5-ACfH- 1-25 besitzt gegenüber dem natürlichen ACTH den Vorteil, dass es keine antigenen Eigenschaften aufweist. Ein weiterer Vorteil des D4erl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-l-25 ist, dass es in Stellung 4 nicht wie natürliches ACTH einen Methioninrest besitzt, der leicht oxydierbar ist und dadurch das Hormon in eine inaktivierte Form umwandelt, sondern einen Norleucinrest, der dieselben sterischen Eigenschaften wie der Methioninrest aufweist, hingegen gegen Oxydation beständig ist. Überdies weist das D-Serl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-l-25 in Stellung
1 einen D-Serinrest und in Stellung 25 einen Valinamidrest auf, die beim natürlichen ACTH an dieser Stelle nicht vorkommen.
Diese beiden endständigen Aminosäurereste gewährleisten eine Beständigkeit gegen die abbauende Wirkung von Exopeptidasen, wie Leucinaminopeptidasen und Carboxypeptidasen.
Gleich dem natürlichen ACTH weist jedoch das D-Serl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-1-25 in Stellung 17 einen L-Argininrest auf, der bekanntlich gegenüber der abbauenden Wirkung von Endopeptidasen, wie Trypsin, sehr empfindlich ist.
Es wurde aus diesem Grunde versucht, den L-Argininrest in Stellung 17 des D4er-Nle4-(Val-NH2)25- ACTH-1-25 durch einen Rest zu ersetzen, der gegen über der abbauenden Wirkung der Endopeptidasen stabiler ist. Tatsächlich gelang es, durch den Ersatz des DArgininrestes in Stellung 17 mit dem L-Ornithinrest beim D-Ser1-Nle6-(Val-NH2)25-ACTH-1-25, das gegenüber Endopeptidasen weniger empfindliche D-Ser' Nle4-Ornl7-(Val-NH2)25-ACTH-l-25 zu erhalten.
Da aber bekanntlich Ornithinreste in den natürlichen, biologisch aktiven Peptidhormonen vom ACTH-Typus nicht vorhanden sind, war es überraschend und nicht vorauszusehen, dass eine Verbindung erhalten wird, die nicht nur qualitativ dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche ACTH aufweist, sondern auch noch quantitativ dem natürlichen ACTH, wie später eingehend dargelegt wird, überlegen ist.
Überraschenderweise wurde nun auch festgestellt, dass beirn D-Ser1-Nle4-Orn17-(val-NH2)25-ACTH-1-2 5 der Glutaminsäurerest in Stellung 5 durch einen Glutaminrest chne Verlust der biologischen Wirkung ersetzt werden kann. D-Ser1-Nlei-Gln4-Orn17-(Val-NH2)25 ACTH-1-25 weist die oben beschriebenen Vorteile des D-Ser1-Nle4-Orn17-(Val-NH2)25-ACTH-1-25 gegen über dem natürlichen ACTH auf.
Die neuen Pentacosapeptide können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Beim Aufbau der neuen Pentacosapeptide haben sich für die Blockierung der endständigen aminogruppe des Serins die Triphchylmcthyl, dic Carbo-tert.-butoxy-und die Carbo-tert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbobenzoxy-, die Trifluoracetyl-, die Acetyl-, die Chloracetyl-, die Formyl- oder die 2-Nitrophenylsulfenylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der E-Aminogruppe des Lysinrestes und der b-Aminogruppe des Ornithinrestes haben sich die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbo-tert.-amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbobenzoxy-, die Toluolsulfonyl-, die Phthalyl-, die Formyl- und die Trifluoracetyl-Gruppe, verwendet werden.
Für die Blockierung der y-Carboxylgruppe des Glutaminsäurerestes hat sich die tert.-Butyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Athoxy-, die tert.-Amyloxyoder die Benzyloxygruppe verwendet werden, oder man führt die Carboxylgruppe in die Amidfunktion über.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes hat sich die Triphenylmethylgtuppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes wurde die Nitro-Gruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachloro- benzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Erfindungsgemäss können die neuen Pentacosapeptide beispielsweise hergestellt werden, indem man L-valyl-E-N-R-clysyl-cvalyl-Gtyrosyl-
Gprolyl-Gvalinamid, worin R eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-tert.amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Formyl- oder eine Trifluoracetyl-Gruppe bedeutet, mit dem N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl-@-N-R-L lysyl-@-N-R-L-lysyl-@-N-R-L-ornithyl- nitro-L-arginyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl-@-N-R-L lysyl-@-N-R-L-lysyl-@-N-R-L-ornithyl- nitro-L-arginyl-L-prolin, lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl L-valinamid, worin R obige Bedeutung hat,
nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und der Nitrogruppe mit dem N-Triphenylmethyl-L-glutarninyl(oder-@-O- tert.-butyl-L-glutamyl)-Im-triphenylmethyl
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophanyl-glycyl-e-N-R-L-lysyl-L prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Triphenyimethyl-L-glutaminyl(oder-@-O- tert.-butyl-L-glutamyl)-Im-triphenylmethyl
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophanyl-glycyl-@-N-R-Llysyl-L prolyl-L-valyl-glycyl-@-N-R-L-lysyl-L
E-N-R-lysyl-a-N-R-L-ornithyl-D arginyl-L-prolyl-L-valyl-@-N-R-L-lysyl
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der a-N-Triphenylmethylgruppe mit dem N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- norleucylazid, worin R' eine Triphenylmethyl-,
eine Carbo-tert.butoxy- oder eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl- oder eine Formylgruppe bedeutet, kondensiert und die gesamten Schutzgruppen des erhaltenen neuen, geschützten Pentacosapeptids
N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-serly-L-norleucyl L-glutaminyl(oder-y-O-tert.-butyl-L- glutamyl)-im-triphenylmethyl-L-bistidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-@-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-@-N-R-L-lysyl-@-N-R-L-lysyl b-N-R-L-onnithyl-Warginyl-L-prolyl-
L-vaWl-e-N-R-LWsyl-Lvalyl-L- tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R und R' obige Bedeutung haben, in einer oder in mehreren Stufen in saurem Milieu abspaltet.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Pentacosapeptide können, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Pentacosapeptide lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Sithansulfon- säure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure, Äthylendiamintetraessigsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige des Zinks in Frage.
Die neuen Pentacosapeptide, ihre Salze und Schwermetallkomplexe können beispielsweise für die Behandlung der folgenden Erkrankungen verwendet werden:
Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus,
Colitis ulcerosa,
Nephrose,
Kollagenosen, wie z. B. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw., allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie Asthma bronchiale, Ekzem, Urticaria, Dermatitis exfoliativa, anaphylaktischer Schock usw.,
Tumoren, wie z. B. Leukämien, Lymphosarcomen, Reticulosarcomen usw., zur Verhinderung der Nebennierenrindenatrophie bei der Therapie mit Corticosteroiden,
Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse.
Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahiertem Hormon liegt darin, dass den neuen synthetischen Pentacosapeptiden antigene Eigenschaften fehlen. Sie können somit bei den oben erwähnten Erkrankungen auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf einer früheren Behandlung mit natürlichem ACTH allergische Erscheinungen auftraten.
In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten Tests besitzen die neuen Pentacosapeptide im Vergleich zum natürlichen Corticotropin folgende biologische Wirksamkeit:
770 + 160 Corticotropin IE pro mg D-Serl-NlelOrnl7-(Va1-NHz)25¯ACTH- 1-25
720 + 150 Corticotropin IE pro mg D-Ser-Nle4-Gln5-Ornt7-(Val-NH2)25-
ACTH-1-25.
So dienten zur Testung der verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptide der 3. Internationale Standard für Corticotropin, welcher in Form des International Standard for Corticotropin zur Verfügung steht und die Einstellung von ACTH-Präparaten auf Internationale Einheiten ermöglicht. Es hat sich herausgestellt, dass die neuen Pentacosapeptide nach parenteraler Verabreichung eine längere Wirkungsdauer besitzen als die bisher bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate, was einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellt.
Die unterwartete, bei der Standardisierung festgestellte hohe Wirksamkeit der neuen Pentacosapeptide hat sich bei der therapeutischen Anwendung voll bestätigt, so dass die neuen Pentacosapeptide auf Gewichtsbasis stärker und länger wirken als alle, bis jetzt bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate.
Die Dosierung der verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptide variiert zwischen 40 und 60 IE pro Tag, in besonderen Fällen zwischen 10 und 100 IE pro Tag.
Die neuen Pentacosapeptide können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können - wie natürliches ACTH - auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neuen Pentacosapeptide und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
CBO = Carbobenzoxy
Trit = Trityl = Triphenylmethyl
CTB = Carbo-tert.-butyloxy
NPS = 2-Nitrophenylsulfenyl
NO2 = nitro
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OTB = tert.-Butyloxy
OMe = Methoxy
OEt = Athoxy
Arg = L-arginyl
Glu = glutamyl
Gln = L-glutaminyl
Gly = glycyl
His = L-histidyl
Lys = L-lysyl Nle = Snorleucyl
Orn = L-ornithyl
Phe = L-phenylalanyl
Pro = L-prolyl
Ser = Gseryl DSer = D-seryl
Try = Gtryptophanyl
Tyr = Tyrosyl
Val = L-valyl
Im = Imidazolyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Fig. A Herstellung von H-Val-Gly-(R)Lys-(R)Lys-Orn-Arg-Pro-Val-(R)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2
EMI4.1
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<tb> Fig. B Herstellung von H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-(R2)His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2
EMI5.1
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Darstellung der Zwischenprodukte:
a) @ N 2 Nitrophenylsulfenyl-@-N-carbo-tert- buloxy-L-ornitbin-dicyclohexylaminsalz (NPS-(CTB)Orn-OH dicyclohexylamin)
Man löst 232 g H-(CTB)Orn-OH in 500 ml 2n Natronlauge und gibt unter heftigem Rühren bei 0 eine Lösung von 188 g 2-Nitrophenylsulfenylchlorid in 250 ml Dioxan zu, während das pH bei 8,5 unter Zugabe von 2n Natronlauge konstant gehalten wird.
Man konzentriert die erhaltene Mischung auf 1000 ml, filtriert und stellt das pH des Filtrates auf 3 ein. Man extrahiert mit 1000 ml Essigester, trocknet die organische Phase, gibt 1000 ml Diäthyläther und 190 g Dicyclohexylamin zu, filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab und trocknet. Man erhält 450 g NPS-(CTB) Orn-OH dicyclohexylamin vom Smp. 1360, [a] = -340 in Essigester 95 %.
b) L-Valyl-glycyl-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl carbo-tert,-butoxy-L-lysyl-carbo-tert,-butoxy
L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-carbo tert.-butoxy-clyyl-cvalyl-L-tyrosyl-G prolyl-l=valinamid (H-Val-Gly-(CTB)Lys (CTB)Lys-(CTB)Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 120 g NPS-(CTB)Orn-OH dicyclohexylamin und 102 g H-Arg(NO2)-Pro-OMe .HBr in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf 00, gibt 50 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt 16 Stunden bei 250.
Nach Filtration gibt man 1000 ml Essigester zu, wäscht mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält 155 g NPS-(CTB)Orn (NO2)Arg Pro-OMc vom Smp. 1350 (mit Zers.).
Man löst 74 g NPS(CTB)Orn-(NO.2)Arg-Pro-OMe in einem 90 %igen Dioxan-Wasser-Gemisch und versetzt mit 220 ml 2n Natronlauge. Nach 2 Stunden wird mit 1 Liter Wasser verdünnt und wiederholt mit Essigester ausgewaschen. Anschliessend säuert man die wässrige Lösung mit 4n Weinsäure an, löst das ausgefallene Produkt in einem Gemisch von Methanol-Aceton (1:1) auf und fällt durch Zugabe von Äthyläther. Man erhält 66,6 g NPS-(CTB)Orn-(NO2)Arg-Pro-OH vom Smp.
1150 (mit Zers.), [a]D = -290 in Dimethylformarnid.
Man löst das oben erhaltene Tripeptid in 400 ml einer in Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan, lässt 1 Stunde bei 200 stehen, filtriert, konzentriert auf 200 ml, fällt mit Äthyl äther aus, filtriert, wäscht mit Äthylacetat und trocknet. Man erhält 54 g H-(CTB)Orn (NO2. )Arg-Pro=OH HCl vom Smp. 1040 (mit Zers.), [a3 21d = -19 in 95 %iger Essigsäure. In eine Lösung von 54 g H (CTB)Orn-(NO2) Arg-Pro-OH Hydrochlorid in 600 ml Dimethylformamid und 18 ml Tri äthylamin wird bei 0 C 63 g CBO-Val-Gly-(CTB)- Lys-(CTB)Lys-N3 (aus 65 g des entsprechenden Hydrazids hergestellt) eingetragen. Man lässt die Lösung 16 Stunden stehen und dampft das Lösungsmittel ein.
Der Rückstand wird in einem Gemisch von n-Butanol-Essigester (2: 8) gelöst und wiederholt mit verdünnter Schwefelsäure nachgewaschen. Man konzentriert die Lösung im Vakuum ein und fällt mit Äther aus. Man erhält 71 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB)Orn (NO,)Arg-Pro-OH vom Smp. 1400 (mit Zers.), [a]D = -360 in Methanol.
Man löst 58 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys (CTB)Orn-(NO2)Arg-Pro-OH in 900 ml Dimethylformamid und 900 ml Tetrahydrofuran. Nach Zugabe von 6,2 ml Triäthylamin wird die Lösung auf -10 C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 4,2 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten werden 36 g H-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 in 160 ml Dimethylformamid zugegeben und über 16 Stunden bei 200 weitergerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Wasser ausgewaschen. Man löst das Peptid in heissem Äthanol und fällt mit Essigester aus. Nach Abnutschen und Trocknen erhält man 74 g
CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB)Orn (NO2)Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr
Pro-Val-NH2 vom Smp. 1900 (mit Zers.), [a]D = -380 in Dimethylformamid.
Man löst 74 g
CB O-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB) Orn (NO2)Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr
Pro-Val-NH2 in 1,5 Liter 80%iger Essigsäure, versetzt mit Palladium Katalysator, hydriert bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme und filtriert vom Katalysator ab. Nach Einengen löst man den Rückstand in 500 ml Methanol auf, kühlt auf -5 , versetzt mit 2,8 g p-Toluolsulfonsäure und fällt anschliessend mit Äther. Man erhält 67 g
H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB)Orn Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-
Val-NH2 als Di-toluolsulfonat vom Smp. 1850 (mit Zers.), [a]D = 440 in Dimethylformamid.
c) O-text.-Butyl-L-glutamyl-Im-trityl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-prolyl
N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-N-carbo-tert. butoxy-L-rnithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl
N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (H-(OTB)Glu (Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro
Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB)Orn-Arg
Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val NH2)
Man löst 65 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB) Orn
Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2 2 Tos-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf.
Anschliessend gibt man 57
Trit-(OTB) Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try
Gly-(CTB)Lys-Pro-OH zu und, wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 00 ab und versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 24stündigem Schütteln bei 200 wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mit Äther gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt. Man erhält 96
Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys (CTB)Lys-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 Di-totuol sulfonat.
Smp. 1630 mit Zers., [α] 20 = 50 in Methanol.
Man löst 49 g Trit-(OTB) Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys- (CTB)Lys-(CTB)Orn-Arg-Pro Val- (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2- 2 Tos-OH in 500 ml 80%iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 300 stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Acetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Äther erhält man 44 g H-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys (CTB)Lys-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Acetat.
Zersetzung bei 175 , [α]20D = -53 in Methanol.
d) N-Trityl-L-glutaminyl-Im-trityl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-prolin (Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB)Lys-Pro-OH)
Man löst 45 g H-His-Phe-OMe 2 HBr und 26 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid, rührt 10 Minuten bei 00, filtriert, gibt dem Filtrat 45 g CBO Gln-OCP zu und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Man dampft das Dimethylformamid ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünntem Essigsäure-Wasser und in Natriumbicarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigester. Man erhält 38 g CBO-Gln-His-Phe OMe. Smp. 1870.
Man löst das oben erhaltene Tripeptid in 300 ml Methanol und 33 ml 2n Salzsäure, hydriert in Gegenwart von 5 g 10A Palladium-Kohle, filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in 150 ml Methylenchlorid, kühlt auf 00, gibt 21 ml Triäthylamin und anschliessend 27 g Triphenylchlormethan zu, lässt 16 Stunden bei 200 stehen, wäscht mit verdünnter Essigsäure, Wasser und in Natriumbicarbonatlösung, trocknet und dampft ab.
Man löst den Rückstand in Diäthyläther und fällt mit Petroläther. Man erhält 49 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe OMe, das man in 100 ml Methanol löst. Man gibt 5 ml Hydrazin zu, lässt 24 Stunden bei 200 stehen, konzentriert auf 50 ml, gibt 500 ml Diäthyläther zu, wäscht mit 0,1n Kochsalzlösung, trocknet, konzentriert auf 50 ml und fällt mit Petroläther. Man erhält 40 g Trit Gln-(Trit)His-Phe-NHNH2. Smp. 850 mit Zers., a] 2r0 = -150 in Dimethylformamid.
Man löst 40 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe-NHNH2 in 100 ml Dimethylformamid und 100 ml Isopropanol, kühlt auf -10 und gibt 40 ml 4n Salzsäure und anschliessend unter Rühren 9 ml 5n Natriumnitritlösung zu. Nach 5 Minuten fügt man 28 ml Triäthylamin und 1000 ml Eiswasser zu, nutscht ab, löst den Niederschlag in Essigester, wäscht mit einer gesättigten Kochsalzlösung, trocknet, dampft bei 0 ab, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, gibt 26 g H-Arg-Try Gly-(CTB)Lys-Pro-OH, 3 AcOH und 4,5 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 1000 ml Essigester zu, wäscht mit 0,5n Essigsäure, Wasser und 0,5n Pyridin, dampft ab, löst den Rückstand in 100 ml Essigester und fällt mit Diäthyläther. Man erhält 55 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg. Try Gly (CTB)Lys-Pro-OH.
Smp. 1850, Lol 2r) = -15 in Dimethylformamid.
e) L-Glutaminyl-Im-trityl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl
N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-prolyl-L valyl-glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl N-carbo-tert.-butoxy-Glysyl-N-carbo-tert butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl
N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (H-Gln-(Trit)His
Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly (CTB) Lys-(CTB) Lys-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 65 g
H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(CTB)Orn
Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2.2 Tos-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf. Anschliessend gibt man 57 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-OH zu und, wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 0 ab und versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid.
Nach 24stündigem Schütteln bei 200 wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mit Äther gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt. Man erhält 96 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys (CTB)Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val- Tyr-Pro-Val-NH2- Di-toluolsulfonat.
Smp. 1650 mit Zers., [a] 2E0 = -50 in Methanol.
Man löst 49 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys- (CTB)Orn-Arg-Pro-Val- (CTB)Lys-Val-
Tyr-Pro-Val-NH2. 2 Tos-OH in 500 mol 80 %iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 300 stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Acetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Äther erhält man 44 g
H-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val Tyr-Pro-Val-NH2 - Acetat.
Zersetzung bei 1750, [a] 2v) = -58 in Methanol.
Beispiel I
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-trytophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl-L arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (D-Ser-Tyr-Ser-Nie-Glu-His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Arg Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHz)
Man löst 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf -10 , gibt 2 ml 6n Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Minuten bei -5 , gibt 300 ml 0,2n Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert.
Man löst das erhaltene CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-N3 in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 12,0 g
H-Glu-(OTB)-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys- (CTB)Lys-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 Acetat, lässt 12 Stunden bei 0 stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-DSer-TyrSer-Nle-NHNH2 hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Stunden bei 0 stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Aceton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 ml 90%iger Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 200 unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet.
Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2n Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit IRA-410 in Acetatform, filtriert und lyophilisiert. Nach Trocknen über Natriumhydroxid erhält man 7,2 g
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg
Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val- NH @ Dodecaacetat Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält (Totalhydrolyse gibt die folgende Aminosäurezusammensetzung:
Ser1,9Tyr1,9NIe1,1Glu1,0His1,0Phe1,1Orn0,9Arg2,0
Gly2,0Lys4,1Pro3,0Val3,9)
Mikroanalyse:
Berechnet: C 51,2 H 7,5 N 14,5 0 26,9%
Gefunden: C 51,1 H 7,5 N 14,6 0 26,8% Smp. 1950 mit Zers., [a] 20 = -830 in 1n Essigsäure.
Beispiel 2
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-l-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl
L-arginyl-L-proyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl Ltyrosyl-L-proWl-I=valin amid (D-Ser-Tyr-Ser-NIc-Gln-His-Phc-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Arg
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 2,0 g CTB-DSer-TyrSer-Nle-NHNH2 in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf -100, gibt 2 ml 6n Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Minuten bei -5 , gibt 300 ml 0,2n Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert.
Man löst das erhaltene CTB-D-Ser-Tyr-Ser Nle-N in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 12,0 g
H-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys (CTB) Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val
Tyr-Pro-Val-NH2.Acetat, lässt 12 Stunden bei 0 stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Stunden bei 00 stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Aceton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 ml 90%IGER Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 200 unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet. Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2n Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit IRA-410 in Acetatform, filtriert und lyophilisiert.
Nach Trocknen über Natriumhydroxid erhält man 7,2 g
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg
Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val
NH2. Dodecaacetat. Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält (Totalhydrolyse gibt die folgende Aminosäurezusammensetzung:
Ser1,9Tyr1,9Nle1,1Glu1.0HIs1,0Ph31,1Orn0,9Arg2,0
Gly2,0Lys4,1Pro3,0Val3,9)
Mikroanalyse:
Berechnet: C 51,2 H 7,5 N 14,8 0 26,5S
Gefunden: C 51,2 H 7,7 N 14,5 0 26,3 % Smp. 2000 mit Zers., [ce] 20D = -850 in 1n Essigsäure.
Process for the production of previously unknown polypeptides
The present invention relates to a process for the preparation of new pentacosapeptides of the general formula
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norlcucyl
X-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl
L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L-tyrosyl-Lprolyl-L-valinamide, in which X denotes an SGlutamyl or L-ghataminyl radical, of their therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes.
The pentacosapeptides falling under the general formula can also be abbreviated as follows: D-Ser1-Nloe1-Orn17- (val-NH2) 2 @ -ACTH-1-25 and
D-Ser1-NIC4-Gln3-ORn17- (Val-NH2) 25
ACTH-1-25 and, like their salts and heavy metal complexes, have a high adrenocorticotropic activity.
It was already known that a pentacosapeptide of the sequence D-seryl-ctyrosyl-L-seryl-Gnorleucyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl
L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl
L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl J, arginyl-Garginyl-Gprolyl-Gvalyl-
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-vatinamide with corticotropic activity, hereinafter referred to as D-Ser1-Nlc4- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25.
DSer1-Nle4- (Val-NH2) 5-ACfH- 1-25 has the advantage over natural ACTH that it has no antigenic properties. Another advantage of D4erl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-l-25 is that in position 4 it does not have a methionine residue like natural ACTH, which is easily oxidized and thus converts the hormone into an inactivated form, but a norleucine residue, which has the same steric properties as the methionine residue, but is resistant to oxidation. In addition, the D-Serl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25 is in position
1 has a D-serine residue and in position 25 a valinamide residue, which does not occur in natural ACTH at this point.
These two terminal amino acid residues ensure resistance to the degrading action of exopeptidases such as leucine aminopeptidases and carboxypeptidases.
Like the natural ACTH, however, the D-Serl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25 has an L-arginine residue in position 17, which is known to be very sensitive to the degrading action of endopeptidases such as trypsin.
For this reason, an attempt was made to replace the L-arginine residue in position 17 of D4er-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25 by a residue that is more stable to the degrading action of the endopeptidases. In fact, by replacing the D-arginine residue in position 17 with the L-ornithine residue in D-Ser1-Nle6- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25, the D-Ser'Nle4-Ornl7- less sensitive to endopeptidases (Val-NH2) 25-ACTH-1-25.
However, since ornithine residues are known not to be present in the natural, biologically active peptide hormones of the ACTH type, it was surprising and not foreseeable that a compound will be obtained which not only has qualitatively the same biological and therapeutic properties as natural ACTH, but also is quantitatively superior to natural ACTH, as will be explained in detail later.
Surprisingly, it has now also been found that in the case of D-Ser1-Nle4-Orn17- (val-NH2) 25-ACTH-1-2 5 the glutamic acid residue in position 5 can be replaced by a glutamine residue without loss of biological activity. D-Ser1-Nlei-Gln4-Orn17- (Val-NH2) 25 ACTH-1-25 has the advantages of D-Ser1-Nle4-Orn17- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25 compared to the above natural ACTH on.
The new pentacosapeptides can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked to one another individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units.
In the construction of the new pentacosapeptides, triphchylmethyl, carbo-tert-butoxy and carbo-tert-amyloxy groups have proven useful for blocking the terminal amino group of the serine, but other suitable protective groups, such as the carbobenzoxy, the trifluoroacetyl, the acetyl, the chloroacetyl, the formyl or the 2-nitrophenylsulfenyl group can be used.
For the blocking of the E-amino group of the lysine residue and the b-amino group of the ornithine residue, the carbo-tert-butoxy and the carbo-tert-amyloxy group have proven useful, but other suitable protective groups, such as the carbobenzoxy, the toluenesulfonyl, the phthalyl, the formyl and the trifluoroacetyl groups can be used.
The tert-butyloxy group has proven useful for blocking the γ-carboxyl group of the glutamic acid residue, but other suitable protecting groups such as the methoxy, ethoxy, tert-amyloxy or benzyloxy groups can also be used, or the Carboxyl group into the amide function.
The triphenylmethylg group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue, but other suitable protective groups such as the carbo-tert-butoxy, the carbo-tert-amyloxy, the carbobenzoxy or the benzyl group can also be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue, but other suitable protective groups such as the tosyl group, the p-nitrocarbobenzoxy group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3,4,5,6-tetrachlorobenzoxy group can also be used . The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
According to the invention, the new pentacosapeptides can be prepared, for example, by L-valyl-E-N-R-clysyl-cvalyl-Gtyrosyl-
Gprolyl-gvalinamide, in which R is a carbo-tert-butoxy or a carbo-tert-amyloxy, a toluenesulfonyl, a phthalyl, a formyl or a trifluoroacetyl group, with the N-carbobenzoxy-L-valyl -glycyl - @ - NRL lysyl - @ - NRL-lysyl - @ - NRL-ornithyl-nitro-L-arginyl-L-proline, where R has the above meaning, condenses, the obtained N-carbobenzoxy-L-valyl-glycyl- @ -NRL lysyl - @ - NRL-lysyl - @ - NRL-ornithyl-nitro-L-arginyl-L-proline, lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl L-valinamide, where R has the above meaning,
after splitting off the carbobenzoxy group and the nitro group with N-triphenylmethyl-L-glutarninyl (or - @ - O-tert.-butyl-L-glutamyl) -Im-triphenylmethyl
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophanyl-glycyl-eNRL-lysyl-L proline, in which R has the above meaning, condenses, the resulting N-triphenymethyl-L-glutaminyl (or - @ - O-tert. -butyl-L-glutamyl) -Im-triphenylmethyl
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophanyl-glycyl - @ - N-R-Llysyl-L prolyl-L-valyl-glycyl - @ - N-R-L-lysyl-L
E-N-R-lysyl-a-N-R-L-ornithyl-D arginyl-L-prolyl-L-valyl - @ - N-R-L-lysyl
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide, in which R has the above meaning, after cleavage of the aN-triphenylmethyl group with the N-R'-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl azide , where R 'is a triphenylmethyl,
denotes a carbo-tert-butoxy or a carbo-tert-amyloxy, a carbobenzoxy, a trifluoroacetyl, an acetyl, a chloroacetyl or a formyl group, condensed and all the protective groups of the new, protected pentacosapeptide obtained
N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-serly-L-norleucyl L-glutaminyl (or -y-O-tert-butyl-L-glutamyl) -im-triphenylmethyl-L-bistidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl - @ - N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl - @ - N-R-L-lysyl - @ - N-R-L-lysyl b-N-R-L-onnithyl-warginyl-L-prolyl-
L-vaWl-e-N-R-LWsyl-Lvalyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide, where R and R 'have the above meaning, splits off in one or more stages in an acidic medium.
The starting products for the production of the new pentacosa peptides can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new pentacosapeptides can also be obtained or used in the form of their salts. Salts include those with organic acids, such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxy-benzoic acid, mandelic acid, Methanesulphonic acid, sithanesulphonic acid, hydroxyethanesulphonic acid, benzene or toluenesulphonic acid, naphthalenesulphonic acid, sulphanilic acid, ethylenediaminetetraacetic acid and polymeric acids such as tannic acid, alginic acid, polygalacturonic acid, polyphloric acid, hydrochloric acid, hydrohalogenous acid and carboxymethyl cellulose. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question.
As a heavy metal complex z. B. that of zinc in question.
The new pentacosapeptides, their salts and heavy metal complexes can be used, for example, for the treatment of the following diseases:
Acute and chronic rheumatoid arthritis,
Ulcerative colitis,
Nephrosis,
Collagenoses, such as B. lupus erythematosus, scleroderma, etc., allergic diseases of the various organ systems, such as bronchial asthma, eczema, urticaria, exfoliative dermatitis, anaphylactic shock, etc.,
Tumors such as B. leukemias, lymphosarcomas, reticulosarcomas, etc., to prevent adrenal atrophy during therapy with corticosteroids,
Symptoms of insufficiency of the pituitary gland.
A major advantage over natural hormones extracted from animal material is that the new synthetic pentacosapeptides lack antigenic properties. They can therefore be used safely for the diseases mentioned above even if the patient developed allergic symptoms in the course of previous treatment with natural ACTH.
In the tests that are customary and recognized for standardization, the new pentacosapeptides have the following biological effectiveness compared to natural corticotropin:
770 + 160 corticotropin IU per mg D-Serl-NlelOrnl7- (Va1-NHz) 25¯ACTH- 1-25
720 + 150 corticotropin IU per mg D-Ser-Nle4-Gln5-Ornt7- (Val-NH2) 25-
ACTH-1-25.
The 3rd International Standard for Corticotropin, which is available in the form of the International Standard for Corticotropin and enables ACTH preparations to be set to international units, was used to test the pentacosapeptides produced according to the method. It has been found that the new pentacosapeptides have a longer duration of action after parenteral administration than the previously known natural and synthetic ACTH preparations, which represents a significant technical advance.
The unexpected high effectiveness of the new pentacosapeptides found during the standardization has been fully confirmed in the therapeutic application, so that the new pentacosapeptides act stronger and longer on a weight basis than all natural and synthetic ACTH preparations known to date.
The dosage of the pentacosapeptides produced according to the method varies between 40 and 60 IU per day, in special cases between 10 and 100 IU per day.
The new pentacosapeptides can be used as medicines, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B.
Gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. Like natural ACTH, the new compounds can also be administered in the form of a depot preparation.
The new pentacosapeptides and their salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
CBO = carbobenzoxy
Tritol = trityl = triphenylmethyl
CTB = carbo-tert-butyloxy
NPS = 2-nitrophenylsulfenyl
NO2 = nitro
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OTB = tert-butyloxy
OMe = methoxy
OEt = ethoxy
Arg = L-arginyl
Glu = glutamyl
Gln = L-glutaminyl
Gly = glycyl
His = L-histidyl
Lys = L-lysyl Nle = snorleucyl
Orn = L-ornithyl
Phe = L-phenylalanyl
Pro = L-prolyl
Ser = Gseryl DSer = D-seryl
Try = gtryptophanyl
Tyr = tyrosyl
Val = L-valyl
Im = imidazolyl
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Figure A Preparation of H-Val-Gly- (R) Lys- (R) Lys-Orn-Arg-Pro-Val- (R) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2
EMI4.1
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<tb> Fig. B Production of HD-Ser-Tyr-Ser-Nle- (R2) His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Arg-Pro-Val -Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2
EMI5.1
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Representation of the intermediate products:
a) @ N 2 nitrophenylsulfenyl - @ - N-carbo-tert-buloxy-L-ornitbin-dicyclohexylamine salt (NPS- (CTB) Orn-OH dicyclohexylamine)
232 g of H- (CTB) Orn-OH are dissolved in 500 ml of 2N sodium hydroxide solution and a solution of 188 g of 2-nitrophenylsulfenyl chloride in 250 ml of dioxane is added with vigorous stirring at 0, while the pH is 8.5 with the addition of 2N sodium hydroxide solution is kept constant.
The mixture obtained is concentrated to 1000 ml, filtered and the pH of the filtrate is adjusted to 3. It is extracted with 1000 ml of ethyl acetate, the organic phase is dried, 1000 ml of diethyl ether and 190 g of dicyclohexylamine are added, the crystalline mass which has separated out is filtered off and dried. 450 g of NPS- (CTB) Orn-OH dicyclohexylamine with a melting point of 1360, [a] = -340 in ethyl acetate 95% are obtained.
b) L-valyl-glycyl-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-carbo-tert, -butoxy-L-lysyl-carbo-tert, -butoxy
L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-carbo tert.-butoxy-clyyl-cvalyl-L-tyrosyl-G prolyl-l = valinamide (H-Val-Gly- (CTB) Lys (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Dissolve 120 g of NPS- (CTB) Orn-OH dicyclohexylamine and 102 g of H-Arg (NO2) -Pro-OMe .HBr in 500 ml of dimethylformamide, cool to 00, add 50 g of dicyclohexylcarbodiimide and stir for 16 hours at 250.
After filtration, 1000 ml of ethyl acetate are added, the mixture is washed with water, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether. 155 g of NPS- (CTB) Orn (NO2) Arg Pro-OMc with a melting point of 1350 (with decomposition) are obtained.
74 g of NPS (CTB) Orn- (NO.2) Arg-Pro-OMe are dissolved in a 90% dioxane-water mixture, and 220 ml of 2N sodium hydroxide solution are added. After 2 hours, it is diluted with 1 liter of water and washed repeatedly with ethyl acetate. The aqueous solution is then acidified with 4N tartaric acid, the precipitated product is dissolved in a mixture of methanol-acetone (1: 1) and precipitated by adding ethyl ether. 66.6 g of NPS- (CTB) Orn- (NO2) Arg-Pro-OH with a melting point are obtained.
1150 (with dec.), [A] D = -290 in dimethylformamide.
The tripeptide obtained above is dissolved in 400 ml of a solution of hydrogen chloride in dioxane, left to stand at 200 for 1 hour, filtered, concentrated to 200 ml, precipitated with ethyl ether, filtered, washed with ethyl acetate and dried. 54 g of H- (CTB) Orn (NO2.) Arg-Pro = OH HCl of melting point 1040 (with decomposition), [a3 21d = -19 in 95% acetic acid are obtained. In a solution of 54 g of H (CTB) Orn- (NO2) Arg-Pro-OH hydrochloride in 600 ml of dimethylformamide and 18 ml of triethylamine, 63 g of CBO-Val-Gly- (CTB) - Lys- (CTB ) Lys-N3 (prepared from 65 g of the corresponding hydrazide) entered. The solution is left to stand for 16 hours and the solvent is evaporated.
The residue is dissolved in a mixture of n-butanol / ethyl acetate (2: 8) and washed repeatedly with dilute sulfuric acid. The solution is concentrated in vacuo and precipitated with ether. 71 g of CBO-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn (NO,) Arg-Pro-OH of melting point 1400 (with decomposition), [a] D = -360 are obtained in methanol.
58 g of CBO-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys (CTB) Orn- (NO2) Arg-Pro-OH are dissolved in 900 ml of dimethylformamide and 900 ml of tetrahydrofuran. After 6.2 ml of triethylamine have been added, the solution is cooled to -10 ° C. and 4.2 ml of ethyl chloroformate are added at this temperature. After 10 minutes, 36 g of H-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 in 160 ml of dimethylformamide are added and stirring is continued at 200 for 16 hours. The solvent is evaporated in vacuo and the residue is washed out with water. The peptide is dissolved in hot ethanol and precipitated with ethyl acetate. After suction filtration and drying, 74 g are obtained
CBO-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn (NO2) Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr
Pro-Val-NH2 of m.p. 1900 (with decomposition), [a] D = -380 in dimethylformamide.
74 g are dissolved
CB O-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn (NO2) Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr
Pro-Val-NH2 in 1.5 liters of 80% acetic acid, mixed with palladium catalyst, hydrogenated until hydrogen uptake ceases and the catalyst is filtered off. After concentration, the residue is dissolved in 500 ml of methanol, cooled to -5, treated with 2.8 g of p-toluenesulfonic acid and then precipitated with ether. 67 g are obtained
H-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-
Val-NH2 as di-toluenesulphonate of m.p. 1850 (with decomposition), [a] D = 440 in dimethylformamide.
c) O-text.-Butyl-L-glutamyl-Im-trityl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-N-carbo-tert-butoxy-L-prolyl
N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-N-carbo-tert. butoxy-L-rnithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl
N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (H- (OTB) Glu (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro
Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg
Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val NH2)
Dissolve 65 g of H-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn
Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2 2 Tos-OH in 300 ml of pyridine and 300 ml of acetonitrile.
Then give 57
Trit- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try
Add Gly- (CTB) Lys-Pro-OH and, when everything is in solution, cool to 00 and add 28.6 g of dicyclohexylcarbodiimide. After shaking at 200 for 24 hours, the urea is filtered off and the solution is precipitated with ether. The product is repeatedly dissolved in methanol and precipitated with ethyl acetate. You get 96
Trit- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val ( CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 di-totuene sulfonate.
M.p. 1630 with dec., [Α] 20 = 50 in methanol.
Dissolve 49 g of Trit- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn- Arg-Pro Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2-2 Tos-OH in 500 ml of 80% acetic acid and let stand for 2 hours at 300. 50 ml of Amberlite IRA-410 in acetate form are added, the mixture is filtered and evaporated in vacuo and the residue is dissolved in methanol. After precipitation with ether, 44 g of H- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys (CTB) Lys- (CTB) are obtained ) Orn-Arg-Pro-Val (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Acetate.
Decomposes at 175, [α] 20D = -53 in methanol.
d) N-trityl-L-glutaminyl-im-trityl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-proline (Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-OH)
45 g of H-His-Phe-OMe 2 HBr and 26 ml of triethylamine are dissolved in 100 ml of dimethylformamide, stirred for 10 minutes at 00, filtered, 45 g of CBO Gln-OCP are added to the filtrate and the mixture is left to stand at 200 for 16 hours. The dimethylformamide is evaporated off, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed with dilute acetic acid-water and in sodium bicarbonate solution, dried over sodium sulfate and evaporated, and the residue is crystallized from ethyl acetate. 38 g of CBO-Gln-His-Phe OMe are obtained. M.p. 1870.
The tripeptide obtained above is dissolved in 300 ml of methanol and 33 ml of 2N hydrochloric acid, hydrogenated in the presence of 5 g of 10A palladium-carbon, filtered, evaporated, the residue is dissolved in 150 ml of methylene chloride, cooled to 00, 21 ml of triethylamine are added and then 27 g of triphenylchloromethane are added, left to stand for 16 hours at 200, washed with dilute acetic acid, water and in sodium bicarbonate solution, dried and evaporated.
The residue is dissolved in diethyl ether and precipitated with petroleum ether. 49 g of Trit-Gln- (Trit) His-Phe OMe are obtained, which are dissolved in 100 ml of methanol. 5 ml of hydrazine are added, the mixture is left to stand at 200 for 24 hours, concentrated to 50 ml, 500 ml of diethyl ether are added, washed with 0.1N saline solution, dried, concentrated to 50 ml and precipitated with petroleum ether. 40 g of Trit Gln- (Trit) His-Phe-NHNH2 are obtained. M.p. 850 with decomp., A] 2r0 = -150 in dimethylformamide.
40 g of Trit-Gln- (Trit) His-Phe-NHNH2 are dissolved in 100 ml of dimethylformamide and 100 ml of isopropanol, cooled to -10 and 40 ml of 4N hydrochloric acid and then 9 ml of 5N sodium nitrite solution are added with stirring. After 5 minutes, 28 ml of triethylamine and 1000 ml of ice water are added, suction filtered, the precipitate is dissolved in ethyl acetate, washed with a saturated saline solution, dried, evaporated at 0, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, 26 g of H-Arg are added -Try Gly- (CTB) Lys-Pro-OH, 3 AcOH and 4.5 ml of triethylamine, leave to stand for 16 hours at 0, add 1000 ml of ethyl acetate, wash with 0.5N acetic acid, water and 0.5N pyridine, evaporates, dissolves the residue in 100 ml of ethyl acetate and precipitates with diethyl ether. 55 g are obtained
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg. Try Gly (CTB) Lys-Pro-OH.
M.p. 1850, Lol 2r) = -15 in dimethylformamide.
e) L-glutaminyl-im-trityl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl
N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-prolyl-L valyl-glycyl-N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl N-carbo-tert-butoxy-glysyl-N-carbo-tert butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl
N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (H-Gln- (Trit) His
Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val -NH2)
65 g are dissolved
H-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn
Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2.2 Tos-OH in 300 ml of pyridine and 300 ml of acetonitrile. Then 57 g of Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-OH are added and, when everything is in solution, it is cooled to 0 and 28.6 g are added Dicyclohexylcarbodiimide.
After shaking at 200 for 24 hours, the urea is filtered off and the solution is precipitated with ether. The product is repeatedly dissolved in methanol and precipitated with ethyl acetate. 96 g are obtained
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2-di-toluenesulfonate.
M.p. 1650 with decomp., [A] 2E0 = -50 in methanol.
49 g are dissolved
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB ) Lys-Val-
Tyr-Pro-Val-NH2. 2 Tos-OH in 500 mol of 80% acetic acid and left to stand at 300 for 2 hours. 50 ml of Amberlite IRA-410 in acetate form are added, the mixture is filtered and evaporated in vacuo and the residue is dissolved in methanol. After precipitation with ether, 44 g are obtained
H-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB ) Lys-Val Tyr-Pro-Val-NH2 - acetate.
Decomposition at 1750, [a] 2v) = -58 in methanol.
Example I.
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-trytophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl-L arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L -tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (D-Ser-Tyr-Ser-Nie-Glu-His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Arg Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHz)
2.0 g of CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 are dissolved in 12 ml of dimethylformamide, 4 ml of water are added, the mixture is cooled to -10, 2 ml of 6N hydrochloric acid are added, 280 mg of sodium nitrite are added and the mixture is stirred Minutes at -5, add 300 ml of 0.2N potassium bicarbonate solution and centrifuge.
The CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-N3 obtained is dissolved in 50 ml of dimethylformamide, mixed with 12.0 g
H-Glu- (OTB) - (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (CTB) Orn-Arg-Pro- Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 acetate, left to stand at 0 for 12 hours, allows another amount of tetrapeptide azide made from 2.0 g of CTB-DSer-TyrSer-Nle-NHNH2, left to stand for 6 hours at 0, evaporated, processed with ethyl acetate, washed with hot acetone and ethyl acetate and dried in vacuo. The product obtained is dissolved in 100 ml of 90% strength trifluoroacetic acid, left to stand under nitrogen at 200 for 1 hour, evaporated, processed with ethyl acetate, filtered and dried.
The product obtained is dissolved in 500 ml of 0.2N acetic acid, the solution is treated with Amberlite IRA-410 in acetate form, filtered and lyophilized. After drying over sodium hydroxide, 7.2 g are obtained
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg
Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH @ dodecaacetate decahydrate that behaves homogeneously during chromatography and electrophoresis (total hydrolysis gives the following amino acid composition:
Ser1,9Tyr1,9NIe1,1Glu1,0His1,0Phe1,1Orn0,9Arg2,0
Gly2,0Lys4,1Pro3,0Val3,9)
Microanalysis:
Calculated: C 51.2 H 7.5 N 14.5 0 26.9%
Found: C 51.1 H 7.5 N 14.6 0 26.8% m.p. 1950 with dec., [A] 20 = -830 in 1N acetic acid.
Example 2
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-l-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl
L-arginyl-L-proyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl Ltyrosyl-L-proWl-I = valin amide (D-Ser-Tyr-Ser-NIc-Gln-His-Phc-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Arg
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
2.0 g of CTB-DSer-TyrSer-Nle-NHNH2 are dissolved in 12 ml of dimethylformamide, 4 ml of water are added, the mixture is cooled to -100, 2 ml of 6N hydrochloric acid are added, 280 mg of sodium nitrite are added, and the mixture is stirred for 5 minutes at -5 , add 300 ml of 0.2N potassium bicarbonate solution and centrifuge.
The CTB-D-Ser-Tyr-Ser Nle-N obtained is dissolved in 50 ml of dimethylformamide, to which 12.0 g are added
H-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val
Tyr-Pro-Val-NH2.Acetate, left to stand at 0 for 12 hours, gives an additional amount of tetrapeptide azide made from 2.0 g of CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2, leaves 6 hours 00 stand, evaporated, processed with ethyl acetate, washed with hot acetone and ethyl acetate and dried in vacuo. The product obtained is dissolved in 100 ml of 90% IGER trifluoroacetic acid, left to stand for 1 hour at 200 under nitrogen, evaporated, processed with ethyl acetate, filtered and dried. The product obtained is dissolved in 500 ml of 0.2N acetic acid, the solution is treated with Amberlite IRA-410 in acetate form, filtered and lyophilized.
After drying over sodium hydroxide, 7.2 g are obtained
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg
Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val
NH2. Dodecaacetate. Decahydrate, which behaves homogeneously during chromatography and electrophoresis (total hydrolysis gives the following amino acid composition:
Ser1,9Tyr1,9Nle1,1Glu1.0HIs1,0Ph31,1Orn0,9Arg2,0
Gly2,0Lys4,1Pro3,0Val3,9)
Microanalysis:
Calculated: C 51.2 H 7.5 N 14.8 O 26.5S
Found: C 51.2 H 7.7 N 14.5 0 26.3% m.p. 2000 with dec., [Ce] 20D = -850 in 1N acetic acid.