Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptide
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Pentacosapeptide der Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl
X-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-ornithyl L-ornithyl-Garginyl-L-prolyl-Gvalyl-
L-lysyl--L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin X einen L-Glutamyl- oder L-Glutaminylrest bedeutet, ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Die unter die allgemeine Formel fallenden Pentacosapeptide können in abgekürzter Schreibweise auch wie folgt bezeichnet werden: D-Serl-Nle4-Ornl5-Ornt6-Ornl7- (Val-NH3)25-ACTH-1-25 und
D-Ser1-NIc4-Gln5-Orn15-Orn10-Orn17 (Val-NH2)25-ACTH-l-25 und besitzen, ebenso wie ihre Salze und Schwermetallkomplexe, eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit.
Es war bereits bekannt, dass man ein Pentacosapeptid der Sequenz
D-Seryl-L-tyrosyl-L-scryl-L-norlcucyl L-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl- cprolyl-cvalyl-glycy1-L-lysyl-Glysyl-
L-arginyl-L-argmyl-L-prolyl-L-valyi
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valinamid mit corticotroper Wirkung, im Nachstehenden mit D-Ser1-Nle4-(Val-NH2)5-ACTH- 1-25 bezeichnet, synthetisieren kann.
D-Serl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-1-25 besitzt gegenüber dem natürlichen ACTH den Vorteil, dass es keine antigenen Eigenschaften aufweist. Ein weiterer Vorteil des D-Ser1-Nle4-(Val-NH55-ACTH- 1-25 ist, dass es in Stellung 4 nicht wie natürliches ACTH einen Methioninrest besitzt, der leicht oxydierbar ist und dadurch das Hormon in eine inaktivierte Form umwandelt, sondern einen Norleucinrest, der dieselben sterischen Eigenschaften wie der Methioninrest aufweist, hingegen gegen Oxydation beständig ist. Überdies weist das D-Serl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-125 in Stellung
1 einen D-Serinrest und in Stellung 25 einen Valinamidrest auf, die beim natürlichen ACTH an dieser Stelle nicht vorkommen.
Diese beiden endständigen Aminosäurereste gewährleisten eine Beständigkeit gegen die abbauende Wirkung von Exopeptidasen, wie Leucinaminopeptidasen und Carboxypeptidasen.
Gleich dem natürlichen ACTH weist jedoch das D-Serl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-1-25 in Stellung 15 und 16 zwei Lysinreste und in Stellung 17 einen Argininrest auf, die bekanntlich gegenüber der abbauenden Wirkung von Endopeptidasen, wie Trypsin, sehr empfindlich sind.
Es wurde aus diesem Grunde versucht, die beiden Lysinreste in Stellung 15 und 16 und den Argininrest in Stellung 17 des D-Serl-Nle4-(Val-NH2)25-ACTH-
1-25 durch Reste zu ersetzen, die gegenüber der abbauenden Wirkung der Endopeptidasen stabiler sind.
Tatsächlich gelang es, durch den Ersatz der Lysinreste in Stellung 15 und 16 und der Argininrestes in Stellung 17 mit je einem Ornithinrest beim D-Serl-Nle4 (Val-NH 25-ACTH-1-25, das gegenüber Endopeptidasen weniger empfindliche D-Serl-Nle4-Ornl5-Ornl6- Ornl7-(Val-NH2)25-ACTH-1-25 zu erhalten. Da aber bekanntlich Ornithinreste in den natürlichen, biologisch aktiven Peptidhormonen vom ACTH-Typus nicht vorhanden sind, war es überraschend und nicht vorauszusehen, dass eine Verbindung erhalten wird, die nicht nur qualitativ dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche ACTH aufweist, sondern auch noch quantitativ dem natürlichen ACTH, wie später dargelegt wird, überlegen ist.
Überraschenderweise wurde nun auch festgestellt, dass beim D-Ser1-Nle4-Orn15-Orn16-Orn17-(Val-NH2)25 ACTH-1-25 der Glutaminsäurerest in Stellung 5 durch einen Glutaminrest ohne Verlust der biologischen Wirkung ersetzt werden kann. D-Ser1-Nic4-Gln5-Orn15- Om1Orn17-(Val-NH2)-5-ACTH-1 -25 weist die oben beschriebenen Vorteile des Der1-NleOrn15-Orn1 Ornl7-(Val-NH2325-ACTH-l-25 gegenüber dem natürlichen ACTH auf.
Die neuen Pentacosapeptide können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Beim Aufbau der neuen Pentacosapeptide haben sich für die Blockierung der Aminogruppe des Serinrestes die Triphenylmethyl-, die Carbo-tert.-butoxy- und die Carbo-tert.-amyloxygruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbobenzoxy-, die Trifluoracetyl-, die Acetyl-, die Chloracetyl-, die Formyl- oder die 2-Nitrophenylsulfenylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der a > -Aminogruppe des Ornithinrestes und des Lysinrestes haben sich die Carbotert.-butoxy- und die Carbo-tert.-amyloxy-Grnppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbobenzoxy-, die Toluolsulfonyl-, die Phthalyl-, die Formyl- und die Trifluoracetyl-Gruppe, verwendet werden.
Für die Blockierung der y-Carboxylgruppe des Glutaminsäurerestes hat sich die tert.-Butyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Athoxy-, die tert.-Amyloxyoder die Benzyloxygruppe, verwendet werden, oder man führt die Carboxylgruppe in die Amidfunktion über.
Für die Blockierung der Imidazolgtuppe des Histidinrestes hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe, verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes wurde die Nitro-Gruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachloro- benzoylgruppe, verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der
Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Erfindungsgemäss können die neuen Pentacosapeptide beispielsweise hergestellt werden, indem man L-Valyl-E-N-R-Glyyl-Gvalyl-Gtyrosyl-
L-prolyl-L-valinamid, worin R eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-tert. amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Formyl- oder eine Trifluoracetyl-Gruppe bedeutet, mit dem N-Carbobenzoxy-Gvalyl-glycyl-8-N-;R-G ornithyl-@-N-R-L-ornithyl-@-N-R-L ornithyl-nitro-Darginyl-I=prolin (Herstellung siehe z.
B. die nachstehenden Abschnitte 1 bis 3), worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene
N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl-@-N-R-L ornithyl-#-N-R-L-ornithyl-#-N-R-L- ornithyl-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl @-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl bvalinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und der Nitrogruppe mit dem N-Triphenylmethyl-cglutaminyl(oder-y-8- tert.-butyl-L-glutamyl)-Im-triphenylmethyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophanyl-glycyl-@-N-R-L-lysyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert,
das erhaltene N-Triphenylmethyl-L-glutaminyl(oder-@-O- tert.-butyl-Lglutamyl)-Im-triphenylmethyl
L-histidyl-L-phcnylalanyl-L-arginyl-L tryptophanyl-glycyl-@-N-R-L-lysyl-L prolyl-L-valyl-glycyl-@-N-R-L-ornithyl @-N-R-L-ornithyl-@-N-R-L-ornithyl-L arginyl-L-prolyl-L-valyl-@-N-R-L-lysyl-
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der N-Triphenylmethyl-Gruppe mit dem
N-R-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L norleucylazid, worin R' eine Triphenylmethyl-, eine Carbo-tert.butoxy- oder eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl-, eine 2-Nitrophenylsulfenyl- oder eine Formylgruppe bedeutet, kondensiert und die gesamten Schutzgruppen der erhaltenen neuen,
geschützten Pentacosapeptide
N-R-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl L-glutaminyl(oder-@-O-tert.-butyl-L- glutamyl)-Im-triphenylmthyl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-@-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-o-N-R-L-ornithyl-o-N-R-L- ornithyl-@-N-R-L-ornithyl-L-arginyl-L prolyl-L-valyl-@-N-R-L-lysyl-L-valyl
L-tyrosyl-L-prolyiLvalinamid, worin R und R' obige Bedeutung haben, in einer oder in mehreren Stufen in saurem Milieu abspaltet.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Pentacosapeptide können, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Pentacosapeptide lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure, Äthylendiamintetraessigs äure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige des Zinks in Frage.
Die neuen Pentacosapeptide, ihre Salze und Schwermetallkomplexe können beispielsweise für die Behandlung der folgenden Erkrankungen verwendet werden:
Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus,
Colitis ulcerosa,
Kollagenosen, wie z. B. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw., allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie Asthma bronchiale, Ekzem, Urticaria, Dermatitis exfoliativa, anaphylaktischer Schock usw.,
Tumoren, wie z. B. Leukämien, Lymphosarcome, Reticulosarcome usw., zur Verhinderung der Nebennierenrindenatrophie bei der Therapie mit Corticosteroiden,
Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse.
Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahiertem Hormon liegt darin, dass den neuen synthetischen Pentacosapeptiden antigene Eigenschaften fehlen. Sie können somit bei den oben erwähnten Erkrankungen auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf einer früheren Behandlung mit natürlichem ACTH allergische Erscheinungen auftraten.
In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten Tests besitzen die neuen Pentacosapeptide im Vergleich zum natürlichen Corticotropin folgende biologische Wirksamkeit:
920 + 180 Corticotropin IE pro mg D-Sert-Nle4¯0rnlϯornl6¯ornl7¯ (Val-NH2)25-ACTH- 1-25
910 + 190 Corticotropin IE pro mg
D-Scr1-Net-Gln5-Om-Om15 Orn15-Orn37 (Val-NH2)25-ACTH-1 -25.
So dienten zur Testung der verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptide der 3. Internationale Standard für Corticotropin, welcher in Form des International Standard for Corticotropin zur Verfügung steht und die Einstellung von ACTH-Präparaten auf Internationale Einheiten ermöglicht. Es hat sich herausgestellt, dass die neuen Pentacosapeptide nach parenteraler Verabreichung eine längere Wirkungsdauer besitzen als die bisher bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate, was einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellt.
Die unterwartete, bei der Standardisierung festgestellte hohe Wirksamkeit der neuen Pentacosapeptide hat sich bei der therapeutischen Anwendung voll bestätigt, so dass die neuen Pentacosapeptide auf Gewichtsbasis stärker und länger wirken als alle bis jetzt bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate.
Die Dosierung der verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptide variiert zwischen 40 und 60 IE pro Tag, in besonderen Fällen zwischen 10 und 100 lis pro Tag.
Die neuen Pentacosapeptide können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können - wie natürliches ACTH - auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neuen Pentacosapeptide und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
CBO = Carbobenzoxy
Trit = Trityl = Triphenylmethyl
CTB = Carbo-tert.-butyloxy
NPS = 2-Nitrophenylsulfenyl
NO2 = nitro
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OTB = tert.-Butyloxy
OMe = Methoxy
OEt = Athoxy
Arg = Arginyl
Glu = Glutamyl
Gln = L-glutaminyl
Gly = glycyl
His = L-histidyl
Lys = L-lysyl Nle = Çnorleucyl
Orn = L-ornithyl
Phe = L-phenylalanyl
Pro = L-prolyl
Ser = Gseryl DSer = D-seryl
Try = L-tryptophanyl
Tyr = L-tyrosyl
Val = Svalyl
Im = Imidazolyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Herstellung von H-Val-Gly-(R)Orn-(R)Orn-(R)Orn-Arg-Pro-Val-(R)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2
EMI4.1
<SEP> #
<tb> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> Fig B Herstellung von V-D-Ser-Tyr-Ser-NIe-Glu-His-Phe-Arg-TryGly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH3
EMI5.1
<SEP> # <SEP> R1 <SEP> = <SEP> NH2 <SEP> oder <SEP> OTB
<tb> <SEP> # <SEP> R2 <SEP> = <SEP> NH3 <SEP> oder <SEP> OH
<tb> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb>
Darstellung der Zwischenprodukte:
a) α-N-2-Nitrophcnylsulfenyl-@-N-carbo-tert- butoxy-Gornithin-dicyclohexylamins alz (NPS-(CTB) Orn-OH dicyclohexylamin)
Man löst 232 g H-(CTB)Orn-OH in 500 ml 2n Natronlauge und gibt unter heftigem Rühren bei 0 eine Lösung von 188 g 2-Nitrophenylsulfenylchlorid in 250 ml Dioxan zu, während das pH bei 8,5 unter Zugabe von 2n Natronlauge konstant gehalten wird.
Man konzentriert die erhaltene Mischung auf 1000 ml, filtriert und stellt das pH des Filtrates auf 3 ein. Man extrahiert mit 1000 ml Essigester, trocknet die organische Phase, gibt 1000 ml Diäthyläther und 190 g Dicyclohexylamin zu, filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab und trocknet. Man erhält 450 g NPS-(CTB) Orn-OH.dicyclohexylamin vom Smp. 1350, [a] rg = -380 in Essigsäure 95 %.
b)Carbo-benzyloxy-L-valyl-glycyl-carbo-tert. butyloxy-L-ornithyl-carbo-tert.-butyloxy-I ornithyl-hydrazid (CBO-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB) Om-NHNH2)
Man löst 470 g CBO-(CTB)Orn-OH in 2 Liter Diäthyläther, tropft bei 150 eine ätherische Lösung von 60 g Diazomethan zu und dampft zur Trockne ein. Man löst den öligen Rückstand in 5 Liter Methanol und hydriert bei normalem Druck in Anwesenheit von 40 g Palladium/Kohle (10 %). Nach Abschluss der Hydrierung dampft man die vom Katalysator abfiltrierte Lösung zur Trockne ab, löst den Rückstand in 6001 ml Dimethylformamid, versetzt mit 550 g CBO-(CTB)Orn-ONP und lässt 16 Stunden bei 250 stehen.
Dann gibt man 8 Liter Diäthyläther zu, wäscht die erhaltene Lösung mit Wasser, in Schwefelsäure und in Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 4 Liter Volumen und lässt bei 0 kristallisieren. Man erhält 610 g CBO-(CTB)Orn-(CTB)Orn-OMe. Smp.
1400, [a] 20 = -130 in Methanol.
Man löst den erhaltenen Dipeptidester in 5 Liter Methanol, gibt 50 g Pd/C 10% und 100 ml Eisessig zu und hydriert bei normalem Druck. Nach Beendigung der Hydrierung filtriert man den Katalysator ab, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 500 ml Dimethylformamid und versetzt mit 505 g CBO-Val-Gly ONP. Nach 16stüudigcm Schütteln bei 250 gibt man 5 Liter Essigester zu, wäscht die erhaltene Lösung mit 1n Schwefelsäure, 1n Ammoniumhydroxid und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in 5 Liter Methanol, dampft ab und wiederholt noch zweimal diese Behandlung, um die Spuren von Essigester zu entfernen. Man löst den kristallinen Rückstand in 4 Liter Methanol, versetzt mit 300 ml Hydrazinhydrat und kocht das Gemisch 5 Stunden auf Rückfluss.
Nach einer Stunde erfolgt eine vollständige Auflösung, und die Kristallisation tritt bald ein. Man kühlt auf 00, filtriert die kristalline Masse ab, wäscht sie mit Methanol und trocknet bei 400 im Hochvakuum. Man erhält 760 g CBO-Val Gly-(CTB)Orn-(CTB)Orn-NHNH2 vom Smp. 2150.
c) L-Valyl-glycyl-carbo-tert-butoxy-L-ornithyl carbo-tert.-butoxy-L-ornithyl-carbo-tert.- butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L-tyroayl L-prolyl- > valinamid (H-Val-Oly- (CTB) Orn- (CTB) Orn-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 120 g NPS-(CTB)Orn-OH dicyclohexylamin und 102 g H-Arg(NOi)-Pro-OMe. HBr in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf 00, gibt 50 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt 16 Stunden bei 250.
Nach Filtration gibt man 1000 ml Essigester zu, wäscht mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält 195 g NPS-(CTB)Orn (NO2)-Ar,-Pro-OMe vom Smp. 1350 (mit Zers.).
Man löst 74 g NPS-(CTB)Orn-(NG2)Arg-Pro-OMe in einem 90%igem Dioxan-Wasser-Gemisch und versetzt mit 220 ml 2n Natronlauge. Nach 2 Stunden wird mit 1 Liter Wasser verdünnt und wiederholt mit Essigester ausgewaschen. Anschliessend säuert man die wässrige Lösung mit 4n Weinsäure an, löst das ausgefallene Produkt in einem Gemisch von Methanol-Aceton (1:1) auf und fällt durch Zugabe von Äthyl äther. Man erhält 66,6 g NPS-(CTB)Orn-(NO2)Arg-Pro-OH vom Smp.
1150 (mit Zersetzung), [a]D = -290 in Dimethylformamid. Man löst das oben erhaltene Tripeptid in 400 ml einer in Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan, lässt
1 Stunde bei 200 stehen, filtriert, konzentriert auf 200 ml, fällt mit Äthyläther aus, filtriert, wäscht mit Äthylacetat und trocknet. Man erhält 54 g H-(CTB) Orn-(NO3)Arg-Pro-OH. HC1 vom Smp. 1040 (mit Zers.), [a] 21D = 190 in 95Siger Essigsäure. In eine Lösung von 54 g H-(CIB-Orn-(NO3)Arg-Pro- OH. hydrochlorid in 600 ml Dimethylformamid und
18 ml Triäthylamin werden bei 0 C 60 g CBO-Val Gly-(CTB)Orn-(CTB)Orn-Ns (aus 60 g des entsprechenden Hydrazids hergestellt) eingetragen. Man lässt die Lösung 16 Stunden stehen und dampft das Lösungsmittel ein.
Der Rückstand wird in einem Gemisch von n-Butanol-Essigester (2: 8) gelöst und wiederholt mit verdünnter Schwefelsäure nachgewaschen. Man konzentriert die Lösung im Vakuum ein und fällt mit Äther aus. Man erhält 88 g CBO-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB) Om-(CTB) Orn-NO2)Arg-Pro-OH vom Smp. 1460 (mit Zers.), [a]D = -270 in Methanol.
Man löst 56 g CBO-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)- Orn-(CTB)Orn-(NO2)Arg-Pro-OH in 900 ml Dimethylformamid und 900 ml Tetrahydrofuran. Nach Zugabe von 6,2 ml Triäthylamin wird die Lösung auf -10 C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 4,2 ml Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach 10 Minuten werden 36 g H-Val-(CTB)Orn-(NO2)Arg-Pro-Val-(CTB)Lys in 160 ml Dimethylformamid zugegeben und über 16 Stunden bei 200 weitergerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Wasser ausgewaschen. Man löst das Peptid in heissem Äthanol und fällt mit Essigester aus.
Nach Abnutschen und Trocknen erhält man 72 g CBO-Val-Gly-(CTB)Orn (CTB)Orn-(CTB)Orn-(NO2)Arg-Pro-Val-(CTB)Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2 vom Smp. 1900 (mit Zersetzung), [a]D = -310 in Dimethylformamid.
Man löst 72 g CBO-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)- Orn-(CTB)Orn-(NOs)Arg-Pro -Val- (CTB) Lys HVal- Tyr-Pro-Val-NH2 in 1,5 Liter 80 %iger Essigsäure, versetzt mit Palladium-Katalysator, hydriert bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme und filtriert vom Katalysator ab. Nach Einengen löst man den Rückstand in 500 ml Methanol auf, kühlt auf -5 , versetzt mit 2,8 g p-Toluolsulfonsäure und fällt anschliessend mit Äther. Man erhält 68 g H-Val-Gly-(CTB)Om-(CTB)- Orn-(CTB)Orn-Arg- Pro -Val- (CTB) Lys -Val -Tyr Pro-Val-NHO als Di-toluolsulfonat vom Smp. 1950 (mit Zers.), [a] D = 470 in Dimethylformamid.
d) O-tert.-Butyl-L-glutamyl-Im-trityl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-Omithyl N-carbo-tert.-butoxy-Gornithyl-N-carbo- tert.-butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl
L-valyl-N-carbo-tert.-butoxyl-L-lysyl-Lvalyl L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (H-(OTB)Glu (Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro
Val-Gly-(CTB) Orn-(CTB)Orn-(CTB)Orn
Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 64 g
H-Val-Gly-(CIB)Orn-(CTB)Orn-(CTB) Orn Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2.2 Tos-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf.
Anschliessend gibt man 57 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-OH zu und, wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 0 ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 24stündigem Schütteln bei 200 wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mit Äther gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt. Man erhält 91 g
Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)-
Orn-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Di-toluolsulfonat vom Smp. 1910 (mit Zers.), [a] 2D = -470 in Methanol.
Man löst 48 g
Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)-
Orn-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys Val-Tyr-Pro-Val-NHe 2 Tos-OH in 500 ml 80Siger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 300 stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Acetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Ather erhält man 40 g H-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB) Orn-(CTB)-
Orn-(CTB) Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys
Val-Tyr-Pro-Val-NH2 . Acetat.
Zersetzung bei 1720, [a] 2r > 0 = -50 in Methanol.
c) N-Trityl-L-glutaminyl-Im-trityl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl N-carbo-tert.-butoxy-Glysyl-Gprolin (Trit
Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-OH)
Man löst 45 g H-His-Phe-OMe 2 HBr und 26 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid, rührt 10 Minuten bei 00, filtriert, gibt dem Filtrat 45 g CBO-Gln OCP zu und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Man dampft das Dimethylformamid ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünntem Essigsäure-Wasser und in Natriumbicarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigester. Man erhält 38 g CBO-Gln-His-Phe OMe. Smp. 1870.
Man löst das oben erhaltene Tripeptid in 300 ml Methanol und 33 ml 2n Salzsäure, hydriert in Gegenwart von 5 g 10 S Palladium-Kohle, filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in 150 ml Methylenchlorid, kühlt auf 00, gibt 21 ml Triäthylamin und anschliessend 27 g Triphenylchlormethan zu, lässt 16 Stunden bei 200 stehen, wäscht mit verdünnter Essigsäure, Wasser und 1n Natriumbicarbonatlösung, trocknet und dampft ab.
Man löst den Rückstand in Diäthyläther und fällt mit Petroläther. Man erhält 49 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe OMe, das man in 100 ml Methanol löst. Man gibt 5 ml Hydrazin zu, lässt 24 Stunden bei 200 stehen, konzentriert auf 50 ml, gibt 500 ml Diäthyläther zu, wäscht mit 0, ln Kochsalzlösung, trocknet, konzentriert auf 50 ml und fällt mit Petroläther. Man erhält 40 g Trit Gln-(Trit)His-Phe-NHNH2. Smp. 850 mit Zers., [a] Do = -15 in Dimethylformamid.
Man löst 40 g Trit-Gln-(Trit)His-Phe-NHNH2 in 100 ml Dimethylformamid und 100 ml Isopropanol, kühlt auf -100 und gibt 40 ml 4n Salzsäure und anschliessend unter Rühren 9 ml 5n Natriumnitritlösung zu. Nach 5 Minuten fügt man 28 ml Triäthylamin und 1000 ml Eiswasser zu, nutscht ab, löst den Niederschlag in Essigester, wäscht mit einer gesättigten Kochsalzlösung, trocknet, dampft bei 0 ab, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, gibt 26 g H-Arg Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-OH, 3 AcOH und 4,5 ml Tri äthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt ]000 ml Essigester zu, wäscht mit 0,5n Essigsäure, Wasser und 0,5n Pyridin, dampft ab, löst den Rückstand in 100 ml Essigester und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält 55 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB)Lys-Pro-OH.
Smp. 1850, [a] 2D0 = -15 in Dimethylformamid.
f) GGlutaminyl-Im-trityl-Ghistidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl giycyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-N carbo tert. butoxy-L ornithyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-ornithyl-N carbo-tert.-butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L prolyl-L-valyl-N-cabo-tert.-butoxy-L-lysyl
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (H-Gln-(Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-
Pro-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)Orn-(CTB)Orn Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH
Man löst 64 g
H-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)Orn-(CTB)Orn
Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr Pro-Val-NH2 . 2 Tos-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf.
Anschliessend gibt man 57 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB)Lys-Pro-OH zu und, wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf 0 ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 24stündigem Schütteln bei 200 wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung mit Äther gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigester gefällt. Man erhält 91 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)Orn (CTB)Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val- Tyr-Pro-Val-NH2 Di-toluolsulfonat vom Smp. 1910 (mit Zers.), [a] 20 = -470 in Methanol.
Man löst 48 g
Trit-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB) Orn (CTB)Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-
Tyr-Pro-Val-NH2 2 Tos-OH in 500 ml 80%iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 300 stehen. Man gibt 50 ml Amberlit IRA-410 in Acetatform zu, filtriert, verdampft im Vakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Äther erhält man 40 g
H-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-Val-Gly-(CTB) Orn-(CTB) Orn (CTB)Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val
Tyr-Pro-Val-NH2. Acetat.
Zersetzung bei 1720, [a] 2D = -50 in Methanol.
Beispiel I DSeryl-Gtyrosyl-Gseryl-Gnorleucyl-G glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L vatyl-glycyl-L-ornithyl-L-ornithyl-L-ornithyl
L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Arg
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf -100, gibt 2 ml 6n Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Minuten bei-5 , gibt 300 ml 0,2n Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert.
Man löst das erhaltene CTB-D-Ser-Tyr-Ser-N1e-N3 in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 11 g H-Glu-(OTB)-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Orn- (CTB)Om-(CTB)Orn-Arg-Pro-Val (CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2- Acetat, lässt 12 Stunden bei 0 stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Stunden bei 0 stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Aceton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 ml 90 obiger Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 200 unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet.
Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2n Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit IRA410 in Acetatform, filtriert und lyophilisiert. Nach Trocknen über Natriumhydroxid erhält man 6,9 g
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2
Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2 Dodecaacetat Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält (Totalhydrolyse gibt die folgende Aminosäurezus ammensetzung:
Ser1.9Tyr1.0Nle1.1Glu1.0His1.0Phe1.1Orn2.2Arg2.0
Cly2.0Lys2.1Pro3.0Vals3.0
Mikroanalyse:
Berechnet: C 51,0 H 7,5 N 14,6 0 27,0%
Gefunden: C 51,1 H 7,5 N 14,9 O 26,8% Smp. 2190 mit Zers., [a] 2D0 = -850 in in Essigsäure.
Beispiel 2 D-Seryl-Gtyrosyl-Gseryl-Gnorleucyl-
L-glutaminyl-L-histidyl-L-phcnylalanyl-L arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl L-valyl-glycyl-cornithyl-Gornithyl-G ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln¯His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Arg
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
Man löst 2,0 g CTB-D4er-TyrEer-Nle-NHNH2 in 12 ml Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf -100, gibt 2 ml 6n Salzsäure zu, versetzt mit 280 mg Natriumnitrit, rührt 5 Minuten bei -5 , gibt 300 ml 0,2n Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentrifugiert.
Man löst das erhaltene CTB-DSer-Tyr-Ser-Nle-N in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 11
H-Gln-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys
Pro-Val-Gly-(CTB)Orn-(CTB)Orn (CTB)Orn-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-
Tyr-Pro-Val-NH2. Acetat, lässt 12 Stunden bei 0 stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CTB-DSer-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Stunden bei 0 stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Aceton und Essigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 ml 90 %iger Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 200 unter Stickstoff stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, filtriert und trocknet.
Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2n Essigsäure, behandelt die Lösung mit Amberlit IRA-410 in Acetatform, filtriert und lyophilisiert. Nach Trocknen über Natriumhydroxid erhält man 6,9 g
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-
Art;-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-
Val-NH2.Dodecaacetat.Dekahydrat das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält (Totalhydrolyse gibt die folgende Aminosäurezus ammensetzung:
Ser1,9Tyr1,9Nic1,1Glu1,0His1,0Phc1,1Orn2,9Arg2,0
Gly2,0Ly2,1Pro8,0Val3,9)
Mikroanalyse:
Berechnet: C 51,0 H 7,5 N 14,9 0 26,6%
Gefunden: C 51,0 H 7,6 N 14,7 0 26,4% Smp. 2240 mit Zers., [aJ 2D0 = -870 in In Essigsäure.
Process for the production of previously unknown polypeptides
The present invention relates to a process for the preparation of new pentacosapeptides of the formula
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl
X-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-ornithyl L-ornithyl-Garginyl-L-prolyl-Gvalyl-
L-lysyl - L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide, in which X is an L-glutamyl or L-glutaminyl residue, of their therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes.
The pentacosapeptides falling under the general formula can also be abbreviated as follows: D-Serl-Nle4-Ornl5-Ornt6-Ornl7- (Val-NH3) 25-ACTH-1-25 and
D-Ser1-NIc4-Gln5-Orn15-Orn10-Orn17 (Val-NH2) 25-ACTH-l-25 and, like their salts and heavy metal complexes, have a high adrenocorticotropic activity.
It was already known that one could get a pentacosapeptide of the sequence
D-Seryl-L-tyrosyl-L-scryl-L-norlcucyl L-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl- cprolyl-cvalyl-glycy1-L-lysyl-glysyl-
L-arginyl-L-argmyl-L-prolyl-L-valyi
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valinamide with corticotropic action, hereinafter referred to as D-Ser1-Nle4- (Val-NH2) 5-ACTH-1-25, can synthesize.
D-Serl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25 has the advantage over natural ACTH that it has no antigenic properties. Another advantage of D-Ser1-Nle4- (Val-NH55-ACTH- 1-25 is that it does not have a methionine residue in position 4 like natural ACTH, which is easily oxidized and thus converts the hormone into an inactivated form, but a norleucine residue, which has the same steric properties as the methionine residue, but is resistant to oxidation, and the D-Serl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-125 in position
1 has a D-serine residue and in position 25 a valinamide residue, which does not occur in natural ACTH at this point.
These two terminal amino acid residues ensure resistance to the degrading action of exopeptidases such as leucine aminopeptidases and carboxypeptidases.
Like the natural ACTH, however, the D-Serl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25 has two lysine residues in positions 15 and 16 and an arginine residue in position 17, which is known to oppose the degrading action of endopeptidases, such as Trypsin, are very sensitive.
For this reason, an attempt was made to remove the two lysine residues in positions 15 and 16 and the arginine residue in position 17 of the D-Serl-Nle4- (Val-NH2) 25-ACTH-
1-25 to be replaced by residues that are more stable to the degrading action of the endopeptidases.
In fact, by replacing the lysine residues in positions 15 and 16 and the arginine residues in position 17 with an ornithine residue each in D-Serl-Nle4 (Val-NH 25-ACTH-1-25, the D-Serl which is less sensitive to endopeptidases -Nle4-Ornl5-Ornl6- Ornl7- (Val-NH2) 25-ACTH-1-25. Since, as is well known, ornithine residues are not present in the natural, biologically active peptide hormones of the ACTH type, it was surprising and not foreseeable that a compound is obtained which not only has qualitatively the same biological and therapeutic properties as natural ACTH, but is also quantitatively superior to natural ACTH, as will be explained later.
Surprisingly, it has now also been found that in D-Ser1-Nle4-Orn15-Orn16-Orn17- (Val-NH2) 25 ACTH-1-25 the glutamic acid residue in position 5 can be replaced by a glutamine residue without loss of the biological effect. D-Ser1-Nic4-Gln5-Orn15-Om1Orn17- (Val-NH2) -5-ACTH-1 -25 has the advantages of Der1-NleOrn15-Orn1 Ornl7- (Val-NH2325-ACTH-l-25 compared to the natural ACTH on.
The new pentacosapeptides can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked to one another individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units.
In the construction of the new pentacosapeptides, the triphenylmethyl, the carbo-tert-butoxy and the carbo-tert-amyloxy groups have proven useful for blocking the amino group of the serine residue, but other suitable protective groups, such as the carbobenzoxy or trifluoroacetyl, can also be used -, the acetyl, the chloroacetyl, the formyl or the 2-nitrophenylsulfenyl group can be used.
The carbotert-butoxy and the carbo-tert-amyloxy groups have proven useful for blocking the a> -amino group of the ornithine residue and the lysine residue, but other suitable protective groups, such as the carbobenzoxy, the toluenesulfonyl, the Phthalyl, the formyl and the trifluoroacetyl groups can be used.
The tert-butyloxy group has proven useful for blocking the γ-carboxyl group of the glutamic acid residue, but other suitable protective groups, such as the methoxy, ethoxy, tert-amyloxy or benzyloxy groups, can also be used or can be used the carboxyl group into the amide function.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazzo group of the histidine residue, but other suitable protective groups such as the carbo-tert-butoxy, the carbo-tert-amyloxy, the carbobenzoxy or the benzyl group can also be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue, but other suitable protective groups such as the tosyl group, the p-nitrocarbobenzoxy group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3,4,5,6-tetrachlorobenzoxy group can also be used will. One can also use the protective effect of the
Use protonization of the guanido group in the synthesis.
According to the invention, the new pentacosapeptides can be prepared, for example, by L-valyl-E-N-R-glyyl-gvalyl-gtyrosyl-
L-prolyl-L-valinamide, where R is a carbo-tert.-butoxy- or a carbo-tert. amyloxy, a toluenesulfonyl, a phthalyl, a formyl or a trifluoroacetyl group, with the N-carbobenzoxy-Gvalyl-glycyl-8-N-; RG ornithyl - @ - NRL-ornithyl - @ - NRL ornithyl- nitro-Darginyl-I = proline (for production see e.g.
B. the following sections 1 to 3), wherein R has the above meaning, condenses the obtained
N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl - @ - NRL ornithyl - # - NRL-ornithyl - # - NRL- ornithyl-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl @ -NRL-lysyl-L-valyl- L-tyrosyl-L-prolylbvalinamide, in which R has the above meaning, after splitting off the carbobenzoxy group and the nitro group with the N-triphenylmethyl-cglutaminyl (or -y-8-tert.-butyl-L-glutamyl) -Im-triphenylmethyl L -histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl - @ - NRL-lysyl-L-proline, where R has the above meaning, condensed,
the N-triphenylmethyl-L-glutaminyl (or - @ - O-tert.-butyl-Lglutamyl) -Im-triphenylmethyl obtained
L-histidyl-L-phcnylalanyl-L-arginyl-L tryptophanyl-glycyl - @ - NRL-lysyl-L prolyl-L-valyl-glycyl - @ - NRL-ornithyl @ -NRL-ornithyl - @ - NRL-ornithyl-L arginyl-L-prolyl-L-valyl - @ - NRL-lysyl-
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide, where R has the above meaning, after cleavage of the N-triphenylmethyl group with the
NRD-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L norleucylazid, where R 'is a triphenylmethyl-, a carbo-tert-butoxy- or a carbo-tert-amyloxy-, a carbobenzoxy-, a trifluoroacetyl-, an acetyl- , a chloroacetyl, a 2-nitrophenylsulfenyl or a formyl group, condensed and the entire protective groups of the obtained new,
protected pentacosapeptide
N-R-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl L-glutaminyl (or - @ - O-tert-butyl-L-glutamyl) -Im-triphenylmethyl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl - @ - NRL-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-oNRL-ornithyl-oNRL- ornithyl - @ - NRL-ornithyl-L-arginyl-L prolyl-L -valyl - @ - NRL-lysyl-L-valyl
L-tyrosyl-L-prololyilvalinamide, in which R and R 'have the above meaning, splits off in one or more stages in an acidic medium.
The starting products for the production of the new pentacosa peptides can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new pentacosapeptides can also be obtained or used in the form of their salts. Salts include those with organic acids such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxy-benzoic acid, mandelic acid Methanesulphonic acid, ethanesulphonic acid, hydroxyethanesulphonic acid, benzene or toluenesulphonic acid, naphthalenesulphonic acid, sulphanilic acid, ethylenediaminetetraacetic acid and polymeric acids, such as tannic acid, alginic acid, polygalacturonic acid, polyphloretin phosphate, or carboxymethyl cellulose with inorganic acids, hydrofluoric acid, or carboxymethyl cellulose. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question.
As a heavy metal complex z. B. that of zinc in question.
The new pentacosapeptides, their salts and heavy metal complexes can be used, for example, for the treatment of the following diseases:
Acute and chronic rheumatoid arthritis,
Ulcerative colitis,
Collagenoses, such as B. lupus erythematosus, scleroderma, etc., allergic diseases of the various organ systems, such as bronchial asthma, eczema, urticaria, exfoliative dermatitis, anaphylactic shock, etc.,
Tumors such as B. leukemias, lymphosarcomas, reticulosarcomas, etc., to prevent adrenal atrophy during therapy with corticosteroids,
Symptoms of insufficiency of the pituitary gland.
A major advantage over natural hormones extracted from animal material is that the new synthetic pentacosapeptides lack antigenic properties. They can therefore be used safely for the diseases mentioned above even if the patient developed allergic symptoms in the course of previous treatment with natural ACTH.
In the tests that are customary and recognized for standardization, the new pentacosapeptides have the following biological effectiveness compared to natural corticotropin:
920 + 180 corticotropin IU per mg D-Sert-Nle4¯0rnlϯornl6¯ornl7¯ (Val-NH2) 25-ACTH- 1-25
910 + 190 corticotropin IU per mg
D-Scr1-Net-Gln5-Om-Om15 Orn15-Orn37 (Val-NH2) 25-ACTH-1 -25.
The 3rd International Standard for Corticotropin, which is available in the form of the International Standard for Corticotropin and enables ACTH preparations to be set to international units, was used to test the pentacosapeptides produced according to the method. It has been found that the new pentacosapeptides have a longer duration of action after parenteral administration than the previously known natural and synthetic ACTH preparations, which represents a significant technical advance.
The unexpected high effectiveness of the new pentacosapeptides found during the standardization has been fully confirmed in the therapeutic application, so that the new pentacosapeptides have a stronger and longer effect on a weight basis than all natural and synthetic ACTH preparations known to date.
The dosage of the pentacosapeptides produced according to the method varies between 40 and 60 IU per day, in special cases between 10 and 100 lis per day.
The new pentacosapeptides can be used as medicines, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B.
Gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. Like natural ACTH, the new compounds can also be administered in the form of a depot preparation.
The new pentacosapeptides and their salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
CBO = carbobenzoxy
Tritol = trityl = triphenylmethyl
CTB = carbo-tert-butyloxy
NPS = 2-nitrophenylsulfenyl
NO2 = nitro
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OTB = tert-butyloxy
OMe = methoxy
OEt = ethoxy
Arg = arginyl
Glu = glutamyl
Gln = L-glutaminyl
Gly = glycyl
His = L-histidyl
Lys = L-lysyl Nle = Çnorleucyl
Orn = L-ornithyl
Phe = L-phenylalanyl
Pro = L-prolyl
Ser = Gseryl DSer = D-seryl
Try = L-tryptophanyl
Tyr = L-tyrosyl
Val = Svalyl
Im = imidazolyl
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Making H-Val-Gly- (R) Orn- (R) Orn- (R) Orn-Arg-Pro-Val- (R) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2
EMI4.1
<SEP> #
<tb> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> Fig B Production of VD-Ser-Tyr-Ser-NIe-Glu-His-Phe-Arg-TryGly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Arg-Pro-Val-Lys-Val -Tyr-Pro-Val-NH3
EMI5.1
<SEP> # <SEP> R1 <SEP> = <SEP> NH2 <SEP> or <SEP> OTB
<tb> <SEP> # <SEP> R2 <SEP> = <SEP> NH3 <SEP> or <SEP> OH
<tb> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb> # <SEP> # <SEP> #
<tb>
Representation of the intermediate products:
a) α-N-2-Nitrophcnylsulfenyl - @ - N-carbo-tert-butoxy-gornithine-dicyclohexylamine alz (NPS- (CTB) Orn-OH dicyclohexylamine)
232 g of H- (CTB) Orn-OH are dissolved in 500 ml of 2N sodium hydroxide solution and a solution of 188 g of 2-nitrophenylsulfenyl chloride in 250 ml of dioxane is added with vigorous stirring at 0, while the pH is 8.5 with the addition of 2N sodium hydroxide solution is kept constant.
The mixture obtained is concentrated to 1000 ml, filtered and the pH of the filtrate is adjusted to 3. It is extracted with 1000 ml of ethyl acetate, the organic phase is dried, 1000 ml of diethyl ether and 190 g of dicyclohexylamine are added, the crystalline mass which has separated out is filtered off and dried. 450 g of NPS- (CTB) Orn-OH.dicyclohexylamine with a melting point of 1350, [a] rg = -380 in acetic acid 95% are obtained.
b) Carbo-benzyloxy-L-valyl-glycyl-carbo-tert. butyloxy-L-ornithyl-carbo-tert.-butyloxy-I ornithyl hydrazide (CBO-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Om-NHNH2)
470 g of CBO- (CTB) Orn-OH are dissolved in 2 liters of diethyl ether, an ethereal solution of 60 g of diazomethane is added dropwise at 150 and evaporated to dryness. The oily residue is dissolved in 5 liters of methanol and hydrogenated at normal pressure in the presence of 40 g of palladium / carbon (10%). After the hydrogenation is complete, the solution filtered off from the catalyst is evaporated to dryness, the residue is dissolved in 6001 ml of dimethylformamide, mixed with 550 g of CBO- (CTB) Orn-ONP and left to stand at 250 for 16 hours.
Then 8 liters of diethyl ether are added, the solution obtained is washed with water, in sulfuric acid and in ammonium hydroxide, dried over sodium sulfate, concentrated to a volume of 4 liters and allowed to crystallize at 0. 610 g of CBO- (CTB) Orn- (CTB) Orn-OMe are obtained. M.p.
1400, [a] 20 = -130 in methanol.
The dipeptide ester obtained is dissolved in 5 liters of methanol, 50 g of Pd / C 10% and 100 ml of glacial acetic acid are added and the mixture is hydrogenated at normal pressure. After the hydrogenation has ended, the catalyst is filtered off, evaporated to dryness, the residue is dissolved in 500 ml of dimethylformamide and 505 g of CBO-Val-Gly ONP are added. After 16 hours of shaking at 250, 5 liters of ethyl acetate are added, the resulting solution is washed with 1N sulfuric acid, 1N ammonium hydroxide and water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue is dissolved in 5 liters of methanol, evaporated and this treatment is repeated twice in order to remove the traces of ethyl acetate. The crystalline residue is dissolved in 4 liters of methanol, 300 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is refluxed for 5 hours.
Complete dissolution occurs after an hour and crystallization soon occurs. It is cooled to 00, the crystalline mass is filtered off, washed with methanol and dried at 400 in a high vacuum. 760 g of CBO-Val Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn-NHNH2 with a melting point of 2150 are obtained.
c) L-valyl-glycyl-carbo-tert-butoxy-L-ornithyl-carbo-tert-butoxy-L-ornithyl-carbo-tert-butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-valyl-L-tyroayl L-prolyl-> valinamide (H-Val-Oly- (CTB) Orn- (CTB) Orn- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val - (CTB) Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
120 g of NPS- (CTB) Orn-OH dicyclohexylamine and 102 g of H-Arg (NOi) -Pro-OMe are dissolved. HBr in 500 ml of dimethylformamide, cool to 00, add 50 g of dicyclohexylcarbodiimide and stir at 250 for 16 hours.
After filtration, 1000 ml of ethyl acetate are added, the mixture is washed with water, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether. 195 g of NPS- (CTB) Orn (NO2) -Ar, -Pro-OMe with a melting point of 1350 (with decomposition) are obtained.
74 g of NPS- (CTB) Orn- (NG2) Arg-Pro-OMe are dissolved in a 90% dioxane-water mixture, and 220 ml of 2N sodium hydroxide solution are added. After 2 hours, it is diluted with 1 liter of water and washed repeatedly with ethyl acetate. The aqueous solution is then acidified with 4N tartaric acid, the precipitated product is dissolved in a mixture of methanol-acetone (1: 1) and precipitated by adding ethyl ether. 66.6 g of NPS- (CTB) Orn- ( NO2) Arg-Pro-OH of m.p.
1150 (with decomposition), [a] D = -290 in dimethylformamide. The tripeptide obtained above is dissolved in 400 ml of a solution of hydrogen chloride in dioxane
Stand at 200 for 1 hour, filtered, concentrated to 200 ml, precipitated with ethyl ether, filtered, washed with ethyl acetate and dried. 54 g of H- (CTB) Orn- (NO3) Arg-Pro-OH are obtained. HCl with a melting point of 1040 (with decomposition), [a] 21D = 190 in 95% acetic acid. In a solution of 54 g of H- (CIB-Orn- (NO3) Arg-Pro-OH. Hydrochloride in 600 ml of dimethylformamide and
18 ml of triethylamine are introduced at 0 ° C., 60 g of CBO-Val Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn-Ns (prepared from 60 g of the corresponding hydrazide). The solution is left to stand for 16 hours and the solvent is evaporated.
The residue is dissolved in a mixture of n-butanol / ethyl acetate (2: 8) and washed repeatedly with dilute sulfuric acid. The solution is concentrated in vacuo and precipitated with ether. 88 g of CBO-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Om- (CTB) Orn-NO2) Arg-Pro-OH of m.p. 1460 (with decomposition), [a] D = -270 in. Are obtained Methanol.
56 g of CBO-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) - Orn- (CTB) Orn- (NO2) Arg-Pro-OH are dissolved in 900 ml of dimethylformamide and 900 ml of tetrahydrofuran. After 6.2 ml of triethylamine have been added, the solution is cooled to -10 ° C. and 4.2 ml of ethyl chloroformate are added at this temperature. After 10 minutes, 36 g of H-Val- (CTB) Orn- (NO2) Arg-Pro-Val- (CTB) Lys in 160 ml of dimethylformamide are added and stirring is continued at 200 for 16 hours. The solvent is evaporated in vacuo and the residue is washed out with water. The peptide is dissolved in hot ethanol and precipitated with ethyl acetate.
After suction filtration and drying, 72 g of CBO-Val-Gly- (CTB) Orn (CTB) Orn- (CTB) Orn- (NO2) Arg-Pro-Val- (CTB) Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2 are obtained of m.p. 1900 (with decomposition), [a] D = -310 in dimethylformamide.
Dissolve 72 g of CBO-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) - Orn- (CTB) Orn- (NOs) Arg-Pro -Val- (CTB) Lys HVal-Tyr-Pro-Val-NH2 in 1 , 5 liters of 80% acetic acid, mixed with palladium catalyst, hydrogenated until the hydrogen uptake ceases and the catalyst is filtered off. After concentration, the residue is dissolved in 500 ml of methanol, cooled to -5, treated with 2.8 g of p-toluenesulfonic acid and then precipitated with ether. 68 g of H-Val-Gly- (CTB) Om- (CTB) -Orn- (CTB) Orn-Arg-Pro -Val- (CTB) Lys -Val -Tyr Pro-Val-NHO are obtained as di-toluenesulfonate from 1950 (with decomposition), [a] D = 470 in dimethylformamide.
d) O-tert-butyl-L-glutamyl-im-trityl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl glycyl-N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-N-carbo-tert-butoxy-L-omithyl N-carbo-tert-butoxy-gornithyl-N-carbo-tert-butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L-prolyl
L-valyl-N-carbo-tert-butoxyl-L-lysyl-Lvalyl L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (H- (OTB) Glu (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- ( CTB) Lys-Pro
Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn- (CTB) Orn
Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
64 g are dissolved
H-Val-Gly- (CIB) Orn- (CTB) Orn- (CTB) Orn Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2.2 Tos-OH in 300 ml of pyridine and 300 ml of acetonitrile.
Then 57 g of Trit- (OTB) Glu- (Trit) His Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-OH are added and, when everything is in solution, it is cooled to 0, mixed with 28 , 6 g of dicyclohexylcarbodiimide. After shaking at 200 for 24 hours, the urea is filtered off and the solution is precipitated with ether. The product is repeatedly dissolved in methanol and precipitated with ethyl acetate. 91 g are obtained
Trit- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) -
Orn- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Di-toluenesulphonate of m.p. 1910 (with decomposition), [a] 2D = -470 in methanol.
48 g are dissolved
Trit- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) -
Orn- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys Val-Tyr-Pro-Val-NHe 2 Tos-OH in 500 ml 80% acetic acid and leave to stand for 2 hours at 300. 50 ml of Amberlite IRA-410 in acetate form are added, the mixture is filtered and evaporated in vacuo and the residue is dissolved in methanol. After precipitation with ether, 40 g of H- (OTB) Glu- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) -
Orn- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys
Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Acetate.
Decomposition at 1720, [a] 2r> 0 = -50 in methanol.
c) N-trityl-L-glutaminyl-im-trityl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl N-carbo-tert.-butoxy-glysyl-gproline (Trit
Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-OH)
45 g of H-His-Phe-OMe 2 HBr and 26 ml of triethylamine are dissolved in 100 ml of dimethylformamide, the mixture is stirred at 00 for 10 minutes, filtered, 45 g of CBO-Gln OCP are added to the filtrate and the mixture is left to stand at 200 for 16 hours. The dimethylformamide is evaporated off, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed with dilute acetic acid-water and in sodium bicarbonate solution, dried over sodium sulfate and evaporated, and the residue is crystallized from ethyl acetate. 38 g of CBO-Gln-His-Phe OMe are obtained. M.p. 1870.
The tripeptide obtained above is dissolved in 300 ml of methanol and 33 ml of 2N hydrochloric acid, hydrogenated in the presence of 5 g of 10 S palladium-carbon, filtered, evaporated, the residue dissolved in 150 ml of methylene chloride, cooled to 00, 21 ml of triethylamine and then 27 g of triphenylchloromethane are added, left to stand at 200 for 16 hours, washed with dilute acetic acid, water and 1N sodium bicarbonate solution, dried and evaporated.
The residue is dissolved in diethyl ether and precipitated with petroleum ether. 49 g of Trit-Gln- (Trit) His-Phe OMe are obtained, which are dissolved in 100 ml of methanol. 5 ml of hydrazine are added, left to stand at 200 for 24 hours, concentrated to 50 ml, 500 ml of diethyl ether are added, washed with 0.1N sodium chloride solution, dried, concentrated to 50 ml and precipitated with petroleum ether. 40 g of Trit Gln- (Trit) His-Phe-NHNH2 are obtained. M.p. 850 with dec., [A] Do = -15 in dimethylformamide.
40 g of Trit-Gln- (Trit) His-Phe-NHNH2 are dissolved in 100 ml of dimethylformamide and 100 ml of isopropanol, cooled to -100, and 40 ml of 4N hydrochloric acid and then 9 ml of 5N sodium nitrite solution are added with stirring. After 5 minutes, 28 ml of triethylamine and 1000 ml of ice water are added, suction filtered, the precipitate is dissolved in ethyl acetate, washed with a saturated saline solution, dried, evaporated at 0, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, 26 g of H-Arg are added Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-OH, 3 AcOH and 4.5 ml of triethylamine, leave to stand at 0 for 16 hours, add 000 ml of ethyl acetate, wash with 0.5N acetic acid, water and 0.5N Pyridine, evaporates, dissolves the residue in 100 ml of ethyl acetate and precipitates with diethyl ether.
55 g are obtained
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB) Lys-Pro-OH.
M.p. 1850, [a] 2D0 = -15 in dimethylformamide.
f) G-glutaminyl-im-trityl-ghistidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl giycyl-N-carbo-tert-butoxy-L-lysyl-L-prolyl
L-valyl-glycyl-N carbo tert. butoxy-L ornithyl-N-carbo-tert.-butoxy-L-ornithyl-N carbo-tert.-butoxy-L-ornithyl-L-arginyl-L prolyl-L-valyl-N-cabo-tert.-butoxy- L-lysyl
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (H-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-
Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn- (CTB) Orn Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH
64 g are dissolved
H-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn- (CTB) Orn
Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr Pro-Val-NH2. 2 Tos-OH in 300 ml of pyridine and 300 ml of acetonitrile.
Then give 57 g
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly (CTB) Lys-Pro-OH and, when everything is in solution, it is cooled to 0, mixed with 28.6 g of dicyclohexylcarbodiimide. After shaking at 200 for 24 hours, the urea is filtered off and the solution is precipitated with ether. The product is repeatedly dissolved in methanol and precipitated with ethyl acetate. 91 g are obtained
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 di-toluenesulfonate of m.p. 1910 (with decomp .), [a] 20 = -470 in methanol.
48 g are dissolved
Trit-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-
Tyr-Pro-Val-NH2 2 Tos-OH in 500 ml of 80% acetic acid and let stand for 2 hours at 300. 50 ml of Amberlite IRA-410 in acetate form are added, the mixture is filtered and evaporated in vacuo and the residue is dissolved in methanol. After precipitation with ether, 40 g are obtained
H-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val
Tyr-Pro-Val-NH2. Acetate.
Decomposes at 1720, [a] 2D = -50 in methanol.
Example I DSeryl-Gtyrosyl-Gseryl-Gnorleucyl-G glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl
L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L vatyl-glycyl-L-ornithyl-L-ornithyl-L-ornithyl
L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Arg
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
2.0 g of CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2 are dissolved in 12 ml of dimethylformamide, 4 ml of water are added, the mixture is cooled to -100, 2 ml of 6N hydrochloric acid are added, 280 mg of sodium nitrite are added and the mixture is stirred Minutes at -5, add 300 ml of 0.2N potassium bicarbonate solution and centrifuge.
The CTB-D-Ser-Tyr-Ser-N1e-N3 obtained is dissolved in 50 ml of dimethylformamide, mixed with 11 g of H-Glu- (OTB) - (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Om- (CTB) Orn-Arg-Pro-Val (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2- acetate, leaves at 0 for 12 hours stand, add another amount of tetrapeptide azide made from 2.0 g of CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2, leave to stand for 6 hours at 0, evaporate, process with ethyl acetate, wash with hot acetone and Ethyl acetate and dry in vacuo. The product obtained is dissolved in 100 ml of the above 90 trifluoroacetic acid, left to stand for 1 hour at 200 under nitrogen, evaporated, processed with ethyl acetate, filtered and dried.
The product obtained is dissolved in 500 ml of 0.2N acetic acid, the solution is treated with Amberlite IRA410 in acetate form, filtered and lyophilized. After drying over sodium hydroxide, 6.9 g are obtained
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2
Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro
Val-NH2 dodecaacetate decahydrate, which behaves homogeneously during chromatography and electrophoresis (total hydrolysis gives the following amino acid composition:
Ser1.9Tyr1.0Nle1.1Glu1.0His1.0Phe1.1Orn2.2Arg2.0
Cly2.0Lys2.1Pro3.0Vals3.0
Microanalysis:
Calculated: C 51.0 H 7.5 N 14.6 0 27.0%
Found: C 51.1 H 7.5 N 14.9 O 26.8% m.p. 2190 with dec., [A] 2D0 = -850 m in acetic acid.
Example 2 D-Seryl-Gtyrosyl-Gseryl-Gnorleucyl-
L-glutaminyl-L-histidyl-L-phcnylalanyl-L arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl L-valyl-glycyl-cornithyl-Gornithyl-G ornithyl-L-arginyl-L-prolyl-L -valyl-L-lysyl
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamide (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln¯His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-Arg
Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2)
2.0 g of CTB-D4er-TyrEer-Nle-NHNH2 are dissolved in 12 ml of dimethylformamide, 4 ml of water are added, the mixture is cooled to -100, 2 ml of 6N hydrochloric acid are added, 280 mg of sodium nitrite are added, and the mixture is stirred at -5 for 5 minutes , add 300 ml of 0.2N potassium bicarbonate solution and centrifuge.
The CTB-DSer-Tyr-Ser-Nle-N obtained is dissolved in 50 ml of dimethylformamide, and 11 is added
H-Gln- (Trit) His-Phe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys
Pro-Val-Gly- (CTB) Orn- (CTB) Orn (CTB) Orn-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-
Tyr-Pro-Val-NH2. Acetate, left to stand at 0 for 12 hours, added another amount of tetrapeptide azide made from 2.0 g of CTB-DSer-Tyr-Ser-Nle-NHNH2, left to stand at 0 for 6 hours, evaporated, processed with ethyl acetate, washes with hot acetone and ethyl acetate and dries in vacuo. The product obtained is dissolved in 100 ml of 90% strength trifluoroacetic acid, left to stand under nitrogen at 200 for 1 hour, evaporated, processed with ethyl acetate, filtered and dried.
The product obtained is dissolved in 500 ml of 0.2N acetic acid, the solution is treated with Amberlite IRA-410 in acetate form, filtered and lyophilized. After drying over sodium hydroxide, 6.9 g are obtained
H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Gln-His-Phe-Arg Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Orn-Orn-Orn-
Art; -Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-
Val-NH2.Dodecaacetat.Decahydrate that behaves homogeneously during chromatography and electrophoresis (total hydrolysis gives the following amino acid composition:
Ser1,9Tyr1,9Nic1,1Glu1,0His1,0Phc1,1Orn2,9Arg2,0
Gly2,0Ly2,1Pro8,0Val3,9)
Microanalysis:
Calculated: C 51.0 H 7.5 N 14.9 0 26.6%
Found: C 51.0 H 7.6 N 14.7 0 26.4% m.p. 2240 with dec., [AJ 2D0 = -870 in 1 n acetic acid.