Procédé de préparation d'un vaccin contre la rubéole La présente invention est relative à un procédé de préparation d'un vaccin à base de virus vivant atténué de la rubéole, capable d'induire une immunité active contre la rubéole.
Les termes virus vivant atténué employés dans la présente demande indiquent une souche de virus de la rubéole (RV) dont la virulence a été atténuée à la suite d'au moins 15 passages successifs sur des cultures pri maires de tissu rénal de lapin.
Suivant le procédé décrit ci-après, on obtient un virus modifié et, par là, un vaccin qui présente une anti- génicité élevée sans provoquer de réaction indésirable lorsqu'il est inoculé à des enfants.
L'existence de réactions indésirables et. parmi elles. plus particulièrement la possibilité de dissémination du virus par l'individu vacciné est un des problèmes ma jeurs rencontrés dans le développement d'un vaccin vivant contre la rubéole.
Il est connu qu'à côté de complications telles que l'encéphalite et la purpura thrombocytopénique qui sont graves mais assez rares et également l'arthrite qui n'est pas exceptionnelle mais généralement d'effet peu étendu et de courte durée. la complication la plus grave de cette maladie est sa nature tératogène. En effet, la rubéole constitue un grave problème pour les femmes au cours du premier trimestre de la grossesse du fait que cette maladie peut entraîner des malformations congénitales du fotus, des mortinatalités et des avortements.
Dans ce contexte, il est essentiel qu'un enfant qui reçoit un vaccin du type vivant contre la rubéole ne constitue pas un danger potentiel pour les femmes en ceintes avec lesquelles il pourrait être en contact.
Jusqu'à présent. les seuls moyens de prévention contre les complications faetales de la rubéole consis taient soit en l'administration de gamma globulines en grandes quantités aux personnes enceintes exposées à la maladie soit à l'exposition des petites filles à la nibénle. Alors que l'administration de gamma globulines est loin d'être considérée par tous les spécialistes comme un traitement efficace, il est évident que l'exposition à la maladie à un plus jeune âge ne constitue pas une solution acceptable du problème.
Il a maintenant été trouvé - et ceci constitue un fait surprenant - que des passages successifs du virus de la rubéole dans des cultures primaires de tissu rénal de lapin (RK) avaient non seulement comme effet de provo quer une atténuation de la virulence mais aussi de pro curer le moyen de préparer un vaccin à base de virus vivant atténué de la rubéole, lequel vaccin ne présentant pas de réactions indésirables.
Par les termes pas de réactions indésirables indi qués ci-avant, il est non seulement entendu que l'inocu lation du vaccin stimule une immunité sans provoquer les symptômes pathologiques usuels de la rubéole ordi naire, mais également qu'au cours des essais cliniques effectués avec un vaccin aucune manifestation sérologi que ou virale d'infection n'a pu être détectée chez les individus réceptifs qui avaient été mis en contact avec les vaccinés.
La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'un vaccin contre la rubéole. caractérisé en ce qu'on soumet une souche du virus de la rubéole à au moins 15 passages successifs sur des cultures pri maires de tissu rénal de lapin. on isole du dernier pas sage un substrat cellulaire contenant le virus atténué en virulence mais ayant conservé son antigénicité, et on effectue, pour l'obtention du vaccin. une incubation avec an milieu de conservation.
Suivant la présente invention, le virus de la rubéole :st donc soumis à un nombre suffisant de passages dans les cultures primaires de tissu rénal de lapin jusqu'à jbtention de l'atténuation. II a été trouvé que l'atténua- ion demande au moins 15 passages et, de préférence. d'environ 20 à environ 60 passages, lesdits passages étant généralement effectués à une température qui n'excède pas 36,, C environ.
Suivant une réalisation particulière de l'invention. la durée de chaque passage<B>est</B> comprise entre 3 et 6 jour. Un vaccin est alors préparé au départ d'un passage approprié sur cellules primaires RK en suivant lu mé thode définie ci-dessus.
Le virus de la rubéole employé pour la réalisation de l'invention peut être isolé d'un cas clinique typique. par exemple. par prélèvement dans la ,orge ou au départ d'échantillons d'urine ou de gargarismes. Les échantillons sont soit congelés immédiatement et maintenus à -60,, C jusqu'au moment de leur emploi ou inoculés immédiate ment dans un système de culture tissulaire adéquat, par exemple des couches monocellulaires de tissu rénal de singe vert africain ou n'importe quel autre système de culture tissulaire connu dans la technique pour un tel isolement.
La présence du virus de la rubéole peut être mise en évidence par exposition des cultures à un virus surinfec- tant, par exemple un entérovirus tel que l'Echovirus 11 ou le Coxsackievirus A 9. le 9e ou le 10e jour après ino culation.
En utilisant du sérum spécifique préparé sur des lapins vis-à-vis d'une souche RV connue. il est possible d'identifier le virus de la rubéole par un test de neutrali sation spécifique dans des cellules réceptives telles que des cellules GMK. L'absence des virus simiens adventices est contrôlée sur cellules GMK après neutralisation à l'aide d'antisérum spécifique RV préparé dans un autre système cellulaire.
Les cultures primaires de cellules rénales de lapin destinées aux passages successifs sont préparées de préfé rence au départ de reins d'animaux dont l'âge n'excède pas 3 semaines. Comme milieu pour les cultures pri maires RK, on utilise de préférence une solution de Hanks équilibrée au point de vue salin et additionnée de sérum de veau inactivé. d'hydrolysat de lactalbumine et de milieu tryptose phosphate mais il est entendu que d'autres milieux d'ailleurs bien connus des spécialistes peuvent également être employés. La température d'in cubation n'excède généralement pas 360 C.
Les passages successifs sont en pratique effectués par inoculation de couches monocellulaires RK à l'aide de quantités ali quotes du supernageant provenant du passage précédent et en récoltant le virus de préférence entre le 3e et le 6-' jour après l'inoculation. La titration du virus récolté peut être effectuée par la méthode d'interférence dans des tubes de culture GMK. en utilisant par exemple l'Echovirus 11 ou le Coxsackievirus A 9 comme il est indiqué ci-avant pour le stade d'isolement.
Après un certain nombre de passages. mais pas avant le 15e et de préférence entre le 20e et le 60e passage, le surnageant des cultures inoculées est éliminé le 6e jour après inoculation et les tapis monocellulaires conte nant le virus atténué sont lavés à l'aide d'une solution saline tamponnée qui peut être par exemple une solution de Eagle ou une solution de Hanks et ils sont ensuite incubés avec un milieu de conservation. constitué par exemple de solution de Hanks additionnée d'hydrolysat de caséine. Après une nouvelle incubation de 3 jours. le supernageant est récolté. clarifié par filtration ou centri fugation.
En variante, lu récolte du vaccin est effectuée après congélation. décongélation et agitation de la culture dans le milieu de conservation avec centrifugation ou filtration subséquente.
Le vaccin de la rubéole récolté additionné ou non d'un additif stabilisant peut être conservé soit à l'étai congelé. par exemple à environ - 60^ ('. ou sous forme lyophylisée. Le vaccin obtenu peut être administré par ,foie sous-cutanée ou intramusculaire. le cas échéant < < près reconstitution.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple <I>I</I> Un lapin de 3 semaines provenant d'une lignée d'éle vage est examiné au point de vue absence de lésion pathologiques et sacrifié. Les deux reins sont prélevés aseptiquement et découpés en petits fragments qui sont mis en contact avec une solution tamponnée de trypsine (2.5 g/1) et le mélange est agité pendant 10 minutes à la température de 37- C. Le liquide est ensuite décanté et remplacé par un égal volume de solution fraîche de trypsine. La trypsinisation est alors continuée sous agi tation jusqu'à digestion du tissu, les cellules mises en suspension dans le liquide étant éliminées de temps en temps et centrifugées.
Le sédiment cellulaire obtenu est remis en suspension dans une solution de Hanks et à nouveau centrifugé. Ce dernier stade est répété deux fois et le sédiment cellulaire final est mis en suspension dans un milieu de culture formé de solution de Hanks équilibrée au point de vue salin et contenant 10 0/o de sérum inactivé de veau. 0,5 0/o d'hydrolysat de lactalbumine et 0.1 % de milieu tryptose phosphate de façon à obtenir une concentration d'envi ron 10;, cellules par ml.
Des quantités aliquotes (un ml) de la suspension cellulaire obtenue contenant chacune environ 10; cellules sont introduites dans 10 tubes de culture (diamètre 12 mm) qui sont incubés en position inclinée à 370 C pendant 4 jours. Après cette période d'incubation, un tapis monocellulaire continu s'est formé. Le milieu nutri tif est alors remplacé par un égal volume de milieu frais. immédiatement avant l'inoculation du virus.
Le même milieu nutritif est employé avant et après inoculation du virus et toutes les cultures primaires de cellules RK indiquées dans cet exemple sont préparées suivant la technique décrite ci-avant.
Des quantités aliquotes de 0.1 ml de la souche du virus de la rubéole préalablement isolé dans des cultures primaires GMK et soumis à trois passages successifs dans ce système pour plus ample caractérisation. sont inoculées dans des tubes de culture primaire RK qui sont incubés à 340 C en position inclinée.
Le sixième jour après inoculation. le supernageant est recueilli et le virus récolté est identifié et titré en utilisant la méthode d'interférence décrite ci-avant.
Le titre sur cellules GMK après ce premier passage sur cellules RK est 102e InD,;" par ml.
Des quantités aliquotes des supernageants rassemblés à la fin du premier passage sont inoculées dans d'autres tubes de culture primaire RK qui sont incubés à 34 C.
Le sixième jour après inoculation. le supernageant est récolté. Le virus est titré comme il est indiqué à la fin du premier passage. Ce procédé est répété jusqu'au 20- passage, la période d'incubation de chaque passage oscil lant entre 3 et 5 jours.
A partir du 91- passage et au-delà. on observe un effet cytopathogène dans les cellules primaires RK.
Pour le 21" passage sur cellules RK, on prépare des cultures primaires de cellules RK dans des boîtes de Roux présentant une surface de 500 centimètres carré. en utilisant la technique décrite ci-dessus.
Après une période d'incubation de 3 jours à 36 C. on obtient un tapis monocellulaire continu. Le super- n;l@;eant est alors éliminé et remplacé par un égal volume de même milieu de culture et inoculé à l'aide de quantités aliquotes de matériel viral provenant du 20e passage.
Après incubation subséquente pendant 6 jours à 34,) C, le supernageant est éliminé et remplacé par un égal volume de milieu de conservation consistant en solution de Hanks additionnée de 0.3 % d'hydrolysat de caséine. Après incubation subséquente pendant 3 jours à 34', C. le supernageant est récolté et clarifié par centri fugation.
Des échantillons sont prélevés par titration. identifi cation et tests de sécurité et le vaccin est stocké à - 60 C.
Le titre en virus est 105 InD50 par ml (résultat d'un test sur cultures primaires de cellules GMK par le sys tème d'interférence).
Ce matériel viral est alors soumis à des tests de sécurité comprenant stérilité bactérienne et absence d'agents adventices par inoculation à des lapins. à des hamsters. à des cobayes. à des souris et à des singes.
Des tests supplémentaires de sécurité sont effectués dans différents systèmes de culture tissulaire.
Une détermination préliminaire du pouvoir antigéni que est réalisée par inoculation à des lapins et à des singes à l'aide de 103e InD50. Les tests de neutralisation sérique (SN) sont effectués sur des cellules GMK.
Les résultats sont donnés dans les tableaux T et<B>Il</B> suivants.
EMI0003.0010
<I>Tableau <SEP> l</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> singes <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> l03.5 <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Singe <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 30 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 14* <SEP> 25* <SEP> 32* <SEP> 45*
<tb> 225 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/8 <SEP> l/16 <SEP> 1/16
<tb> <B>509 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/4 <SEP> 1/18 <SEP> 1/32</B>
<tb> <B>611 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/32</B>
<tb> <B>831 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1I4 <SEP> 1I32 <SEP> ND <SEP> 1/32</B>
<tb> 619 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/16
<tb> 857 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/16
<tb> 1064 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/32 <SEP> ND <SEP> 1/64
<tb> 9S3 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> <B>ND</B> <SEP> 1/16 <SEP> <B>ND</B> <SEP> 1!a2
<tb> 1053 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/8
<tb> ND <SEP> indique <SEP> a <SEP> non <SEP> déterminé <SEP>
<tb> \x <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
EMI0003.0011
<I>Tableau <SEP> I <SEP> /</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> lapins <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> sous cutanée <SEP> avec <SEP> l03.5 <SEP> InD30)
.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Lapin <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 30 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus.
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 24 <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
<tb> 1 <SEP> < <SEP> 1/s <SEP> > <SEP> 1/6
<tb> 2 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> > <SEP> 1/6
<tb> 3 <SEP> < <SEP> <B>1/4 <SEP> 1/16</B>
<tb> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/6
<tb> 5 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> > <SEP> 1/6
<tb> <B>6 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/111</B>
<tb> <B> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/1H</B>
<tb> 8 <SEP> < <SEP> 1/s <SEP> 1I6 La préparation virale est répartie dans des flacons de verre contenant chacun un ml de liquide.
Les flacons sont ensuite lyophylisés et hermétique ment bouchés.
Après reconstitution par addition d'un m! d'eau dis tillée, le vaccin est inoculé par voie sous-cutanée à des sujets réceptifs. les doses individuelles contenant environ 125 InD50.
Les résultats d'un test de réponse sérologique effec tués dans un groupe de 25 enfants séronégatifs (15 rece vant le vaccin et 10 témoins vivant en contact étroit avec eux) sont donnés dans le tableau 111.
Parmi les 15 enfants vaccinés, 13 présentaient une formation d'anticorps jusqu'à 1/a2 ou plus (2 échantillons - indiqués ND -n'étaient pas accessibles au moment de l'examen). Aucun n'a montré de signes cliniques d'in fection. Tous les 10 témoins sont restés sérologiquement négatifs.
EMI0003.0023
<I>Tableau <SEP> <B>111</B></I>
<tb> Réponse <SEP> sérologique <SEP> exprimée <SEP> en <SEP> titre <SEP> d'anticorps
<tb> séroneutralisants.
<tb> Echantillon
<tb> âge <SEP> avant <SEP> 56 <SEP> jours <SEP> après
<tb> Sujets <SEP> (années) <SEP> vaccination <SEP> Situation <SEP> vaccination
<tb> S.M. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> V.S. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> M.1. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> N.R. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> H.A. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> DB.G. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> VN.L. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> R. <SEP> F. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> B. <SEP> D.
<SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> J.A. <SEP> 1 <SEP> lie <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> V.M. <SEP> I <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> E. <SEP> P. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> L.T. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> -4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
EMI0004.0000
Echantillon
<tb> âge <SEP> avant <SEP> 56 <SEP> jours <SEP> après
<tb> Sujets <SEP> (années) <SEP> vaccination <SEP> Situation <SEP> vaccination
<tb> C.C. <SEP> I <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> A.M. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> R.O. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> L.A. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> ND
<tb> D.A. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> G.O. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> M.A.
<SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> ND
<tb> 1.A. <SEP> l <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> P.A. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> D.B. <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> GB.K. <SEP> 5 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 8
<tb> GB.F. <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> V <SEP> = <SEP> vacciné
<tb> T <SEP> = <SEP> témoin <I>Exemple 2</I> La technique est celle décrite dans l'exemple 1 mais les passages sont continués jusqu'au 30e passage dans des cultures primaires de cellules RK.
Un vaccin est préparé au départ du matériel viral de ce 30e passage et les tests de sécurité sont effectués tel qu'il est décrit dans l'exemple 1.
Le pouvoir immunogénique de la préparation est testé sur des animaux (singes).
Les résultats sont donnés dans le tableau IV.
EMI0004.0011
<I>Tableau <SEP> IV</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> singes <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> 109.s <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Singe <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 10 <SEP> InD30 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 25* <SEP> 39*
<tb> <B>1098 <SEP> < <SEP> 1/4</B> <SEP> 1/e <SEP> <B>ND</B>
<tb> <B>1091</B> <SEP> < <SEP> 1/.4 <SEP> 1/e <SEP> ND
<tb> 919 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/<B>8</B>
<tb> 943 <SEP> < <SEP> <B>1/4 <SEP> 1/18 <SEP> 1/18</B>
<tb> * <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
Exemple j En partant du matériel viral provenant du 21e pas sage à 341) C tel qu'il est obtenu dans l'exemple 1, on effectue 9 passages successifs supplémentaires sur des cultures primaires de cellules RK mais à 281) C. y com pris le dernier stade pour la préparation du vaccin.
Le vaccin obtenu est testé au point de vue sécurité et inoculé à des singes et des lapins pour la détermination du pouvoir antigénique.
Les résultats sont donnés dans les tableaux V et VI suivants.
EMI0004.0026
<I>Tableau <SEP> V</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> singes <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> 10'2," <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Singe <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 10 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 25* <SEP> 39*
<tb> <B>1</B>003 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 11/8 <SEP> 1/,
R
<tb> 977 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/8
<tb> ' <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
<tb> <I>Tableau <SEP> VI</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> lapins <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> 109e <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Lapin <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 10 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 26*
<tb> 29 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/8
<tb> 30 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<tb> 31 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> <B>1/1N</B>
<tb> 32 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/e
<tb> 33 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<tb> * <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation <I>Exemple 4</I> La technique est celle décrite dans l'exemple 1 mais les passages sont continués jusqu'au 51e
passage sur cultures primaires de cellules RK, le milieu final de conservation étant constitué de solution de Hanks addi tionnée de 0,3 0/o d'hydrolyse de caséine et contenant 50 mg de chloramphénicol par ml de solution de Hanks.
Après incubation pendant 9 jours à 34o C, le super- nageant est récolté, clarifié par centrifugation et mélangé à un égal volume de solution stabilisante constituée de 30 g de glutamate de potassium, 200 g de sucrose et 50 mg de chloramphénicol par litre d'eau distillée et le mélange est réparti dans des flacons de verre contenant chacun un ml de préparation.
Les flacons sont ensuite lyophylisés et hermétique ment bouchés.
Après reconstitution par addition d'un ml d'eau distillée, le vaccin est inoculé par voie sous-cutanée à 65 sujets séronégatifs, le titre des doses individuelle s'élevant à environ 102.6 InD50 sur cellules GMK ou 103-; PFU (Unités formant plaque) sur cellules RK 13. Un groupe de 30 enfants séronégatifs a été maintenu en contact étroit avec les vaccinés pendant une période de 6 semaines.
Un test de réponse sérologique effectué sur le groupe des 65 sujets vaccinés a montré que tous sauf un répon daient au vaccin avec un titre moyen en anticorps de 1/128, comme il résulte du test HAI (Inhibition de l'Hé- magglutination). Aucun ne présentait de signes clinique d'infection.
Les 30 témoins sont restés sérologiquement néeatifs. Example 5 La technique est celle décrite dans l'exemple 1 nais les passages sont poursuivis jusqu'au 61,' passage sur cultures primaires de cellules RK. le milieu final de conservation étant constitué d'une solution de Hanks additionnée de 0.3 0,'u d'hydrolyse de caséine et conte nant 50 me de chloramphénicol par ml de solution de Hanks.
Après incubation pendant 9 jours à 34-,C. le super- nazeant est récolté. clarifié par centrifugation et mélangé à un égal volume de solution stabilisante constituée<B>de</B> .;O g de glutamate de potassium. 200g de sucrose et 50m; de chloramphénicol par litre d'eau distillée. et le mélange est réparti dans des flacons de verre contenant un ml de préparation.
Les flacons sont ensuite lyophylisés et hermétique ment bouchés.
Après reconstitution par addition d'un ml d'eau dis tillée, le vaccin est inoculé par voie sous-cutanée à des sujets séronégatifs. le titre des doses individuelles s'éle vant à environ 10=-43 InD50 sur cellules GMK ou PFU sur cellules RK 13.
Un test de réponse sérologique effectué sur un groupe de 7 sujets séronégatifs a montré que tous répondaient < < u vaccin avec un titre moyen de 3/s4 tel que l'a révélé le test HAI. Aucun n'a montré de signes cliniques d'infection