Procédé de préparation d'un vaccin contre la rubéole La présente invention est relative à un procédé de préparation d'un vaccin à base de virus vivant atténué de la rubéole, capable d'induire une immunité active contre la rubéole.
Les termes virus vivant atténué employés dans la présente demande indiquent une souche de virus de la rubéole (RV) dont la virulence a été atténuée à la suite d'au moins 15 passages successifs sur des cultures pri maires de tissu rénal de lapin.
Suivant le procédé décrit ci-après, on obtient un virus modifié et, par là, un vaccin qui présente une anti- génicité élevée sans provoquer de réaction indésirable lorsqu'il est inoculé à des enfants.
L'existence de réactions indésirables et. parmi elles. plus particulièrement la possibilité de dissémination du virus par l'individu vacciné est un des problèmes ma jeurs rencontrés dans le développement d'un vaccin vivant contre la rubéole.
Il est connu qu'à côté de complications telles que l'encéphalite et la purpura thrombocytopénique qui sont graves mais assez rares et également l'arthrite qui n'est pas exceptionnelle mais généralement d'effet peu étendu et de courte durée. la complication la plus grave de cette maladie est sa nature tératogène. En effet, la rubéole constitue un grave problème pour les femmes au cours du premier trimestre de la grossesse du fait que cette maladie peut entraîner des malformations congénitales du fotus, des mortinatalités et des avortements.
Dans ce contexte, il est essentiel qu'un enfant qui reçoit un vaccin du type vivant contre la rubéole ne constitue pas un danger potentiel pour les femmes en ceintes avec lesquelles il pourrait être en contact.
Jusqu'à présent. les seuls moyens de prévention contre les complications faetales de la rubéole consis taient soit en l'administration de gamma globulines en grandes quantités aux personnes enceintes exposées à la maladie soit à l'exposition des petites filles à la nibénle. Alors que l'administration de gamma globulines est loin d'être considérée par tous les spécialistes comme un traitement efficace, il est évident que l'exposition à la maladie à un plus jeune âge ne constitue pas une solution acceptable du problème.
Il a maintenant été trouvé - et ceci constitue un fait surprenant - que des passages successifs du virus de la rubéole dans des cultures primaires de tissu rénal de lapin (RK) avaient non seulement comme effet de provo quer une atténuation de la virulence mais aussi de pro curer le moyen de préparer un vaccin à base de virus vivant atténué de la rubéole, lequel vaccin ne présentant pas de réactions indésirables.
Par les termes pas de réactions indésirables indi qués ci-avant, il est non seulement entendu que l'inocu lation du vaccin stimule une immunité sans provoquer les symptômes pathologiques usuels de la rubéole ordi naire, mais également qu'au cours des essais cliniques effectués avec un vaccin aucune manifestation sérologi que ou virale d'infection n'a pu être détectée chez les individus réceptifs qui avaient été mis en contact avec les vaccinés.
La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'un vaccin contre la rubéole. caractérisé en ce qu'on soumet une souche du virus de la rubéole à au moins 15 passages successifs sur des cultures pri maires de tissu rénal de lapin. on isole du dernier pas sage un substrat cellulaire contenant le virus atténué en virulence mais ayant conservé son antigénicité, et on effectue, pour l'obtention du vaccin. une incubation avec an milieu de conservation.
Suivant la présente invention, le virus de la rubéole :st donc soumis à un nombre suffisant de passages dans les cultures primaires de tissu rénal de lapin jusqu'à jbtention de l'atténuation. II a été trouvé que l'atténua- ion demande au moins 15 passages et, de préférence. d'environ 20 à environ 60 passages, lesdits passages étant généralement effectués à une température qui n'excède pas 36,, C environ.
Suivant une réalisation particulière de l'invention. la durée de chaque passage<B>est</B> comprise entre 3 et 6 jour. Un vaccin est alors préparé au départ d'un passage approprié sur cellules primaires RK en suivant lu mé thode définie ci-dessus.
Le virus de la rubéole employé pour la réalisation de l'invention peut être isolé d'un cas clinique typique. par exemple. par prélèvement dans la ,orge ou au départ d'échantillons d'urine ou de gargarismes. Les échantillons sont soit congelés immédiatement et maintenus à -60,, C jusqu'au moment de leur emploi ou inoculés immédiate ment dans un système de culture tissulaire adéquat, par exemple des couches monocellulaires de tissu rénal de singe vert africain ou n'importe quel autre système de culture tissulaire connu dans la technique pour un tel isolement.
La présence du virus de la rubéole peut être mise en évidence par exposition des cultures à un virus surinfec- tant, par exemple un entérovirus tel que l'Echovirus 11 ou le Coxsackievirus A 9. le 9e ou le 10e jour après ino culation.
En utilisant du sérum spécifique préparé sur des lapins vis-à-vis d'une souche RV connue. il est possible d'identifier le virus de la rubéole par un test de neutrali sation spécifique dans des cellules réceptives telles que des cellules GMK. L'absence des virus simiens adventices est contrôlée sur cellules GMK après neutralisation à l'aide d'antisérum spécifique RV préparé dans un autre système cellulaire.
Les cultures primaires de cellules rénales de lapin destinées aux passages successifs sont préparées de préfé rence au départ de reins d'animaux dont l'âge n'excède pas 3 semaines. Comme milieu pour les cultures pri maires RK, on utilise de préférence une solution de Hanks équilibrée au point de vue salin et additionnée de sérum de veau inactivé. d'hydrolysat de lactalbumine et de milieu tryptose phosphate mais il est entendu que d'autres milieux d'ailleurs bien connus des spécialistes peuvent également être employés. La température d'in cubation n'excède généralement pas 360 C.
Les passages successifs sont en pratique effectués par inoculation de couches monocellulaires RK à l'aide de quantités ali quotes du supernageant provenant du passage précédent et en récoltant le virus de préférence entre le 3e et le 6-' jour après l'inoculation. La titration du virus récolté peut être effectuée par la méthode d'interférence dans des tubes de culture GMK. en utilisant par exemple l'Echovirus 11 ou le Coxsackievirus A 9 comme il est indiqué ci-avant pour le stade d'isolement.
Après un certain nombre de passages. mais pas avant le 15e et de préférence entre le 20e et le 60e passage, le surnageant des cultures inoculées est éliminé le 6e jour après inoculation et les tapis monocellulaires conte nant le virus atténué sont lavés à l'aide d'une solution saline tamponnée qui peut être par exemple une solution de Eagle ou une solution de Hanks et ils sont ensuite incubés avec un milieu de conservation. constitué par exemple de solution de Hanks additionnée d'hydrolysat de caséine. Après une nouvelle incubation de 3 jours. le supernageant est récolté. clarifié par filtration ou centri fugation.
En variante, lu récolte du vaccin est effectuée après congélation. décongélation et agitation de la culture dans le milieu de conservation avec centrifugation ou filtration subséquente.
Le vaccin de la rubéole récolté additionné ou non d'un additif stabilisant peut être conservé soit à l'étai congelé. par exemple à environ - 60^ ('. ou sous forme lyophylisée. Le vaccin obtenu peut être administré par ,foie sous-cutanée ou intramusculaire. le cas échéant < < près reconstitution.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple <I>I</I> Un lapin de 3 semaines provenant d'une lignée d'éle vage est examiné au point de vue absence de lésion pathologiques et sacrifié. Les deux reins sont prélevés aseptiquement et découpés en petits fragments qui sont mis en contact avec une solution tamponnée de trypsine (2.5 g/1) et le mélange est agité pendant 10 minutes à la température de 37- C. Le liquide est ensuite décanté et remplacé par un égal volume de solution fraîche de trypsine. La trypsinisation est alors continuée sous agi tation jusqu'à digestion du tissu, les cellules mises en suspension dans le liquide étant éliminées de temps en temps et centrifugées.
Le sédiment cellulaire obtenu est remis en suspension dans une solution de Hanks et à nouveau centrifugé. Ce dernier stade est répété deux fois et le sédiment cellulaire final est mis en suspension dans un milieu de culture formé de solution de Hanks équilibrée au point de vue salin et contenant 10 0/o de sérum inactivé de veau. 0,5 0/o d'hydrolysat de lactalbumine et 0.1 % de milieu tryptose phosphate de façon à obtenir une concentration d'envi ron 10;, cellules par ml.
Des quantités aliquotes (un ml) de la suspension cellulaire obtenue contenant chacune environ 10; cellules sont introduites dans 10 tubes de culture (diamètre 12 mm) qui sont incubés en position inclinée à 370 C pendant 4 jours. Après cette période d'incubation, un tapis monocellulaire continu s'est formé. Le milieu nutri tif est alors remplacé par un égal volume de milieu frais. immédiatement avant l'inoculation du virus.
Le même milieu nutritif est employé avant et après inoculation du virus et toutes les cultures primaires de cellules RK indiquées dans cet exemple sont préparées suivant la technique décrite ci-avant.
Des quantités aliquotes de 0.1 ml de la souche du virus de la rubéole préalablement isolé dans des cultures primaires GMK et soumis à trois passages successifs dans ce système pour plus ample caractérisation. sont inoculées dans des tubes de culture primaire RK qui sont incubés à 340 C en position inclinée.
Le sixième jour après inoculation. le supernageant est recueilli et le virus récolté est identifié et titré en utilisant la méthode d'interférence décrite ci-avant.
Le titre sur cellules GMK après ce premier passage sur cellules RK est 102e InD,;" par ml.
Des quantités aliquotes des supernageants rassemblés à la fin du premier passage sont inoculées dans d'autres tubes de culture primaire RK qui sont incubés à 34 C.
Le sixième jour après inoculation. le supernageant est récolté. Le virus est titré comme il est indiqué à la fin du premier passage. Ce procédé est répété jusqu'au 20- passage, la période d'incubation de chaque passage oscil lant entre 3 et 5 jours.
A partir du 91- passage et au-delà. on observe un effet cytopathogène dans les cellules primaires RK.
Pour le 21" passage sur cellules RK, on prépare des cultures primaires de cellules RK dans des boîtes de Roux présentant une surface de 500 centimètres carré. en utilisant la technique décrite ci-dessus.
Après une période d'incubation de 3 jours à 36 C. on obtient un tapis monocellulaire continu. Le super- n;l@;eant est alors éliminé et remplacé par un égal volume de même milieu de culture et inoculé à l'aide de quantités aliquotes de matériel viral provenant du 20e passage.
Après incubation subséquente pendant 6 jours à 34,) C, le supernageant est éliminé et remplacé par un égal volume de milieu de conservation consistant en solution de Hanks additionnée de 0.3 % d'hydrolysat de caséine. Après incubation subséquente pendant 3 jours à 34', C. le supernageant est récolté et clarifié par centri fugation.
Des échantillons sont prélevés par titration. identifi cation et tests de sécurité et le vaccin est stocké à - 60 C.
Le titre en virus est 105 InD50 par ml (résultat d'un test sur cultures primaires de cellules GMK par le sys tème d'interférence).
Ce matériel viral est alors soumis à des tests de sécurité comprenant stérilité bactérienne et absence d'agents adventices par inoculation à des lapins. à des hamsters. à des cobayes. à des souris et à des singes.
Des tests supplémentaires de sécurité sont effectués dans différents systèmes de culture tissulaire.
Une détermination préliminaire du pouvoir antigéni que est réalisée par inoculation à des lapins et à des singes à l'aide de 103e InD50. Les tests de neutralisation sérique (SN) sont effectués sur des cellules GMK.
Les résultats sont donnés dans les tableaux T et<B>Il</B> suivants.
EMI0003.0010
<I>Tableau <SEP> l</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> singes <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> l03.5 <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Singe <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 30 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 14* <SEP> 25* <SEP> 32* <SEP> 45*
<tb> 225 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/8 <SEP> l/16 <SEP> 1/16
<tb> <B>509 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/4 <SEP> 1/18 <SEP> 1/32</B>
<tb> <B>611 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/32</B>
<tb> <B>831 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1I4 <SEP> 1I32 <SEP> ND <SEP> 1/32</B>
<tb> 619 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/16
<tb> 857 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/16
<tb> 1064 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/32 <SEP> ND <SEP> 1/64
<tb> 9S3 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> <B>ND</B> <SEP> 1/16 <SEP> <B>ND</B> <SEP> 1!a2
<tb> 1053 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/8
<tb> ND <SEP> indique <SEP> a <SEP> non <SEP> déterminé <SEP>
<tb> \x <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
EMI0003.0011
<I>Tableau <SEP> I <SEP> /</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> lapins <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> sous cutanée <SEP> avec <SEP> l03.5 <SEP> InD30)
.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Lapin <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 30 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus.
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 24 <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
<tb> 1 <SEP> < <SEP> 1/s <SEP> > <SEP> 1/6
<tb> 2 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> > <SEP> 1/6
<tb> 3 <SEP> < <SEP> <B>1/4 <SEP> 1/16</B>
<tb> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/6
<tb> 5 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> > <SEP> 1/6
<tb> <B>6 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/111</B>
<tb> <B> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/1H</B>
<tb> 8 <SEP> < <SEP> 1/s <SEP> 1I6 La préparation virale est répartie dans des flacons de verre contenant chacun un ml de liquide.
Les flacons sont ensuite lyophylisés et hermétique ment bouchés.
Après reconstitution par addition d'un m! d'eau dis tillée, le vaccin est inoculé par voie sous-cutanée à des sujets réceptifs. les doses individuelles contenant environ 125 InD50.
Les résultats d'un test de réponse sérologique effec tués dans un groupe de 25 enfants séronégatifs (15 rece vant le vaccin et 10 témoins vivant en contact étroit avec eux) sont donnés dans le tableau 111.
Parmi les 15 enfants vaccinés, 13 présentaient une formation d'anticorps jusqu'à 1/a2 ou plus (2 échantillons - indiqués ND -n'étaient pas accessibles au moment de l'examen). Aucun n'a montré de signes cliniques d'in fection. Tous les 10 témoins sont restés sérologiquement négatifs.
EMI0003.0023
<I>Tableau <SEP> <B>111</B></I>
<tb> Réponse <SEP> sérologique <SEP> exprimée <SEP> en <SEP> titre <SEP> d'anticorps
<tb> séroneutralisants.
<tb> Echantillon
<tb> âge <SEP> avant <SEP> 56 <SEP> jours <SEP> après
<tb> Sujets <SEP> (années) <SEP> vaccination <SEP> Situation <SEP> vaccination
<tb> S.M. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> V.S. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> M.1. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> N.R. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> H.A. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> DB.G. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> VN.L. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> R. <SEP> F. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> B. <SEP> D.
<SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> J.A. <SEP> 1 <SEP> lie <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> V.M. <SEP> I <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> E. <SEP> P. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> L.T. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> -4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
EMI0004.0000
Echantillon
<tb> âge <SEP> avant <SEP> 56 <SEP> jours <SEP> après
<tb> Sujets <SEP> (années) <SEP> vaccination <SEP> Situation <SEP> vaccination
<tb> C.C. <SEP> I <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> A.M. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> R.O. <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> L.A. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> ND
<tb> D.A. <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> G.O. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> M.A.
<SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> ND
<tb> 1.A. <SEP> l <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> P.A. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> > <SEP> 32
<tb> D.B. <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> GB.K. <SEP> 5 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> V <SEP> 8
<tb> GB.F. <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> T <SEP> < <SEP> 4
<tb> V <SEP> = <SEP> vacciné
<tb> T <SEP> = <SEP> témoin <I>Exemple 2</I> La technique est celle décrite dans l'exemple 1 mais les passages sont continués jusqu'au 30e passage dans des cultures primaires de cellules RK.
Un vaccin est préparé au départ du matériel viral de ce 30e passage et les tests de sécurité sont effectués tel qu'il est décrit dans l'exemple 1.
Le pouvoir immunogénique de la préparation est testé sur des animaux (singes).
Les résultats sont donnés dans le tableau IV.
EMI0004.0011
<I>Tableau <SEP> IV</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> singes <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> 109.s <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Singe <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 10 <SEP> InD30 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 25* <SEP> 39*
<tb> <B>1098 <SEP> < <SEP> 1/4</B> <SEP> 1/e <SEP> <B>ND</B>
<tb> <B>1091</B> <SEP> < <SEP> 1/.4 <SEP> 1/e <SEP> ND
<tb> 919 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/<B>8</B>
<tb> 943 <SEP> < <SEP> <B>1/4 <SEP> 1/18 <SEP> 1/18</B>
<tb> * <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
Exemple j En partant du matériel viral provenant du 21e pas sage à 341) C tel qu'il est obtenu dans l'exemple 1, on effectue 9 passages successifs supplémentaires sur des cultures primaires de cellules RK mais à 281) C. y com pris le dernier stade pour la préparation du vaccin.
Le vaccin obtenu est testé au point de vue sécurité et inoculé à des singes et des lapins pour la détermination du pouvoir antigénique.
Les résultats sont donnés dans les tableaux V et VI suivants.
EMI0004.0026
<I>Tableau <SEP> V</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> singes <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> 10'2," <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Singe <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 10 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 25* <SEP> 39*
<tb> <B>1</B>003 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 11/8 <SEP> 1/,
R
<tb> 977 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/8
<tb> ' <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation
<tb> <I>Tableau <SEP> VI</I>
<tb> Réponse <SEP> anticorps <SEP> de <SEP> lapins <SEP> inoculés <SEP> par <SEP> voie <SEP> intra musculaire <SEP> avec <SEP> 109e <SEP> InD50.
<tb> Echantillon
<tb> de <SEP> sérum <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> test <SEP> SN <SEP> sur <SEP> cellules
<tb> Lapin <SEP> avant <SEP> GMK <SEP> envers <SEP> 10 <SEP> InD50 <SEP> de <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 26*
<tb> 29 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/8
<tb> 30 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<tb> 31 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> <B>1/1N</B>
<tb> 32 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/e
<tb> 33 <SEP> < <SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<tb> * <SEP> jours <SEP> après <SEP> inoculation <I>Exemple 4</I> La technique est celle décrite dans l'exemple 1 mais les passages sont continués jusqu'au 51e
passage sur cultures primaires de cellules RK, le milieu final de conservation étant constitué de solution de Hanks addi tionnée de 0,3 0/o d'hydrolyse de caséine et contenant 50 mg de chloramphénicol par ml de solution de Hanks.
Après incubation pendant 9 jours à 34o C, le super- nageant est récolté, clarifié par centrifugation et mélangé à un égal volume de solution stabilisante constituée de 30 g de glutamate de potassium, 200 g de sucrose et 50 mg de chloramphénicol par litre d'eau distillée et le mélange est réparti dans des flacons de verre contenant chacun un ml de préparation.
Les flacons sont ensuite lyophylisés et hermétique ment bouchés.
Après reconstitution par addition d'un ml d'eau distillée, le vaccin est inoculé par voie sous-cutanée à 65 sujets séronégatifs, le titre des doses individuelle s'élevant à environ 102.6 InD50 sur cellules GMK ou 103-; PFU (Unités formant plaque) sur cellules RK 13. Un groupe de 30 enfants séronégatifs a été maintenu en contact étroit avec les vaccinés pendant une période de 6 semaines.
Un test de réponse sérologique effectué sur le groupe des 65 sujets vaccinés a montré que tous sauf un répon daient au vaccin avec un titre moyen en anticorps de 1/128, comme il résulte du test HAI (Inhibition de l'Hé- magglutination). Aucun ne présentait de signes clinique d'infection.
Les 30 témoins sont restés sérologiquement néeatifs. Example 5 La technique est celle décrite dans l'exemple 1 nais les passages sont poursuivis jusqu'au 61,' passage sur cultures primaires de cellules RK. le milieu final de conservation étant constitué d'une solution de Hanks additionnée de 0.3 0,'u d'hydrolyse de caséine et conte nant 50 me de chloramphénicol par ml de solution de Hanks.
Après incubation pendant 9 jours à 34-,C. le super- nazeant est récolté. clarifié par centrifugation et mélangé à un égal volume de solution stabilisante constituée<B>de</B> .;O g de glutamate de potassium. 200g de sucrose et 50m; de chloramphénicol par litre d'eau distillée. et le mélange est réparti dans des flacons de verre contenant un ml de préparation.
Les flacons sont ensuite lyophylisés et hermétique ment bouchés.
Après reconstitution par addition d'un ml d'eau dis tillée, le vaccin est inoculé par voie sous-cutanée à des sujets séronégatifs. le titre des doses individuelles s'éle vant à environ 10=-43 InD50 sur cellules GMK ou PFU sur cellules RK 13.
Un test de réponse sérologique effectué sur un groupe de 7 sujets séronégatifs a montré que tous répondaient < < u vaccin avec un titre moyen de 3/s4 tel que l'a révélé le test HAI. Aucun n'a montré de signes cliniques d'infection
Process for preparing a vaccine against rubella The present invention relates to a process for preparing a vaccine based on live attenuated rubella virus, capable of inducing active immunity against rubella.
The terms live attenuated virus used in the present application indicate a strain of rubella virus (RV) whose virulence has been attenuated following at least 15 successive passages on primary cultures of rabbit renal tissue.
By the method described below, a modified virus is obtained and thereby a vaccine which exhibits high antigenicity without causing an adverse reaction when inoculated into children.
The existence of adverse reactions and. among them. more particularly the possibility of dissemination of the virus by the vaccinated individual is one of the major problems encountered in the development of a live vaccine against rubella.
It is known that alongside complications such as encephalitis and thrombocytopenic purpura which are serious but quite rare and also arthritis which is not exceptional but generally of small extent and of short duration. the most serious complication of this disease is its teratogenic nature. Indeed, rubella is a serious problem for women during the first trimester of pregnancy because the disease can lead to birth defects in the fetus, stillbirths and abortions.
In this context, it is essential that a child who receives a live-type rubella vaccine does not pose a potential danger to pregnant women with whom he may come in contact.
Until now. the only means of prevention against the fetal complications of rubella consisted either of the administration of gamma globulins in large quantities to pregnant persons exposed to the disease or of the exposure of young girls to nibénle. While the administration of gamma globulins is far from being regarded by all specialists as an effective treatment, it is obvious that exposure to the disease at a younger age is not an acceptable solution to the problem.
It has now been found - and this is a surprising fact - that successive passages of rubella virus in primary cultures of rabbit kidney tissue (RK) have the effect of not only attenuating virulence but also of reducing virulence. to provide the means of preparing a vaccine based on live attenuated rubella virus, which vaccine does not show adverse reactions.
By the terms no adverse reactions indicated above, it is not only understood that inoculation of the vaccine stimulates immunity without causing the usual pathological symptoms of ordinary rubella, but also that during the clinical trials carried out with a vaccine no serological or viral manifestation of infection could be detected in susceptible individuals who had been in contact with the vaccinated.
A subject of the present invention is therefore a process for preparing a vaccine against rubella. characterized in that a strain of the rubella virus is subjected to at least 15 successive passages on primary cultures of rabbit renal tissue. a cellular substrate containing the virus attenuated in virulence but having retained its antigenicity is isolated from the last step wise, and one carries out, to obtain the vaccine. incubation with a storage medium.
According to the present invention, the rubella virus is therefore subjected to a sufficient number of passages in the primary cultures of rabbit renal tissue until attenuation is attained. It has been found that attenuation requires at least 15 passes, and preferably. from about 20 to about 60 passages, said passages being generally carried out at a temperature not exceeding about 36 ° C.
According to a particular embodiment of the invention. the duration of each <B> passage is </B> between 3 and 6 days. A vaccine is then prepared starting from an appropriate passage over primary RK cells by following the method defined above.
The rubella virus employed for carrying out the invention can be isolated from a typical clinical case. for example. by taking it from the barley or from urine samples or gargles. Samples are either frozen immediately and kept at -60 ° C until ready to use or inoculated immediately into a suitable tissue culture system, eg single-cell layers of African green monkey kidney tissue or any another tissue culture system known in the art for such isolation.
The presence of the rubella virus can be demonstrated by exposure of the cultures to a superinfecting virus, for example an enterovirus such as Echovirus 11 or Coxsackievirus A 9 on the 9th or 10th day after inoculation.
Using specific serum prepared on rabbits against a known RV strain. rubella virus can be identified by a specific neutralization test in receptive cells such as GMK cells. The absence of adventitious simian viruses is checked on GMK cells after neutralization using specific RV antiserum prepared in another cell system.
The primary cultures of rabbit renal cells intended for successive passages are preferably prepared from the kidneys of animals whose age does not exceed 3 weeks. As the medium for the primary RK cultures, a saline-balanced Hanks solution supplemented with inactivated calf serum is preferably used. lactalbumin hydrolyzate and tryptose phosphate medium, but it is understood that other media moreover well known to specialists can also be used. The incubation temperature generally does not exceed 360 C.
The successive passages are in practice carried out by inoculation of single-cell RK layers with the aid of aliquots of the supernatant from the preceding passage and by harvesting the virus preferably between the 3rd and the 6th day after inoculation. Titration of the harvested virus can be performed by the interference method in GMK culture tubes. using for example Echovirus 11 or Coxsackievirus A 9 as indicated above for the isolation stage.
After a certain number of passages. but not before the 15th and preferably between the 20th and 60th passage, the supernatant of the inoculated cultures is removed on the 6th day after inoculation and the single cell mats containing the attenuated virus are washed with a buffered saline solution which can be for example an Eagle's solution or a Hanks solution and they are then incubated with a storage medium. consisting, for example, of Hanks solution supplemented with casein hydrolyzate. After a further 3 day incubation. the supernatant is harvested. clarified by filtration or centrifugation.
Alternatively, harvesting of the vaccine is performed after freezing. thawing and agitation of the culture in the storage medium with subsequent centrifugation or filtration.
The collected rubella vaccine with or without a stabilizing additive can be stored either in the frozen case. for example at about -60% or in lyophilized form. The resulting vaccine can be administered by subcutaneous or intramuscular liver, if appropriate <<<<<<<<<<constitution>> after reconstitution).
The following examples illustrate the invention. Example <I> I </I> A 3 week old rabbit from a breeding line is examined for the absence of pathological lesions and sacrificed. The two kidneys are removed aseptically and cut into small fragments which are brought into contact with a buffered solution of trypsin (2.5 g / l) and the mixture is stirred for 10 minutes at a temperature of 37- C. The liquid is then decanted and replaced with an equal volume of fresh trypsin solution. The trypsinization is then continued with stirring until the tissue is digested, the cells suspended in the liquid being removed from time to time and centrifuged.
The cellular sediment obtained is resuspended in Hanks' solution and again centrifuged. This last stage is repeated twice and the final cellular sediment is suspended in a culture medium formed from Hanks' solution balanced from the saline point of view and containing 10% of inactivated calf serum. 0.5 0 / o of lactalbumin hydrolyzate and 0.1% of tryptose phosphate medium so as to obtain a concentration of approximately 10; cells per ml.
Aliquots (one ml) of the obtained cell suspension each containing about 10; cells are introduced into 10 culture tubes (diameter 12 mm) which are incubated in an inclined position at 370 ° C. for 4 days. After this incubation period, a continuous single cell mat formed. The nutrient medium is then replaced with an equal volume of fresh medium. immediately before virus inoculation.
The same nutrient medium is used before and after inoculation with the virus and all the primary cultures of RK cells indicated in this example are prepared according to the technique described above.
Aliquots of 0.1 ml of the rubella virus strain previously isolated in GMK primary cultures and subjected to three successive passages in this system for further characterization. are inoculated into RK primary culture tubes which are incubated at 340 ° C. in a tilted position.
The sixth day after inoculation. the supernatant is collected and the harvested virus is identified and titrated using the interference method described above.
The titer on GMK cells after this first passage on RK cells is 102nd InD,; "per ml.
Aliquots of the supernatants pooled at the end of the first pass are inoculated into other RK primary culture tubes which are incubated at 34 C.
The sixth day after inoculation. the supernatant is harvested. The virus is titrated as indicated at the end of the first pass. This process is repeated until passage, the incubation period of each passage oscillating between 3 and 5 days.
From 91- passage and beyond. a cytopathic effect is observed in the primary RK cells.
For passage through RK cells, primary cultures of RK cells were prepared in Roux dishes having a surface area of 500 square centimeters using the technique described above.
After an incubation period of 3 days at 36 ° C., a continuous single-cell mat is obtained. The supernatant is then removed and replaced with an equal volume of the same culture medium and inoculated with aliquots of viral material from the 20th passage.
After subsequent incubation for 6 days at 34 ° C., the supernatant is removed and replaced with an equal volume of storage medium consisting of Hanks' solution supplemented with 0.3% casein hydrolyzate. After subsequent incubation for 3 days at 34 ', C. the supernatant is harvested and clarified by centrifugation.
Samples are taken by titration. identification and safety testing and the vaccine is stored at - 60 C.
The virus titre is 105 InD50 per ml (result of a test on primary cultures of GMK cells by the interference system).
This viral material is then subjected to safety tests comprising bacterial sterility and absence of adventitious agents by inoculation into rabbits. to hamsters. to guinea pigs. to mice and monkeys.
Additional safety tests are performed in different tissue culture systems.
A preliminary determination of antigenicity is carried out by inoculation into rabbits and monkeys using 103rd InD50. Serum neutralization (SN) tests are performed on GMK cells.
The results are given in the following Tables T and <B> II </B>.
EMI0003.0010
<I> Table <SEP> l </I>
<tb> Response <SEP> antibody <SEP> of <SEP> monkeys <SEP> inoculated <SEP> by <SEP> intramuscular <SEP> route <SEP> with <SEP> l03.5 <SEP> InD50.
<tb> Sample
<tb> of <SEP> serum <SEP> Results <SEP> of the <SEP> test <SEP> SN <SEP> on <SEP> cells
<tb> Monkey <SEP> before <SEP> GMK <SEP> towards <SEP> 30 <SEP> InD50 <SEP> of <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 14 * <SEP> 25 * <SEP> 32 * <SEP> 45 *
<tb> 225 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/8 <SEP> l / 16 <SEP> 1/16
<tb> <B> 509 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/4 <SEP> 1/18 <SEP> 1/32 </B>
<tb> <B> 611 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/32 </B>
<tb> <B> 831 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1I4 <SEP> 1I32 <SEP> ND <SEP> 1/32 </B>
<tb> 619 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/16
<tb> 857 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> ND <SEP> 1/16
<tb> 1064 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/32 <SEP> ND <SEP> 1/64
<tb> 9S3 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> <B> ND </B> <SEP> 1/16 <SEP> <B> ND </B> <SEP> 1! a2
<tb> 1053 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/4 <SEP> ND <SEP> 1/8
<tb> ND <SEP> indicates <SEP> a <SEP> not <SEP> determined <SEP>
<tb> \ x <SEP> days <SEP> after <SEP> inoculation
EMI0003.0011
<I> Table <SEP> I <SEP> / </I>
<tb> Response <SEP> antibody <SEP> of <SEP> rabbits <SEP> inoculated <SEP> by <SEP> route <SEP> subcutaneously <SEP> with <SEP> l03.5 <SEP> InD30)
.
<tb> Sample
<tb> of <SEP> serum <SEP> Results <SEP> of the <SEP> test <SEP> SN <SEP> on <SEP> cells
<tb> Rabbit <SEP> before <SEP> GMK <SEP> towards <SEP> 30 <SEP> InD50 <SEP> of <SEP> virus.
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 24 <SEP> days <SEP> after <SEP> inoculation
<tb> 1 <SEP> <<SEP> 1 / s <SEP>> <SEP> 1/6
<tb> 2 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP>> <SEP> 1/6
<tb> 3 <SEP> <<SEP> <B> 1/4 <SEP> 1/16 </B>
<tb> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/6
<tb> 5 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP>> <SEP> 1/6
<tb> <B> 6 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/111 </B>
<tb> <B> <<SEP> 1/4 <SEP> 1 / 1H </B>
<tb> 8 <SEP> <<SEP> 1 / s <SEP> 1I6 The viral preparation is distributed into glass vials each containing one ml of liquid.
The vials are then freeze-dried and hermetically sealed.
After reconstitution by adding an m! with distilled water, the vaccine is inoculated subcutaneously into susceptible individuals. individual doses containing approximately 125 InD50.
The results of a serologic response test performed in a group of 25 HIV negative children (15 receiving the vaccine and 10 controls living in close contact with them) are given in Table 111.
Of the 15 vaccinated children, 13 had antibody formation up to 1 / a2 or more (2 samples - marked ND - were not accessible at the time of testing). None showed clinical signs of infection. All 10 controls remained serologically negative.
EMI0003.0023
<I> Table <SEP> <B>111</B> </I>
<tb> Serological <SEP> response <SEP> expressed <SEP> as <SEP> antibody <SEP> titer
<tb> seroneutralisants.
<tb> Sample
<tb> age <SEP> before <SEP> 56 <SEP> days <SEP> after
<tb> Subjects <SEP> (years) <SEP> vaccination <SEP> Situation <SEP> vaccination
<tb> S.M. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> V.S. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> M.1. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> N.R. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> H.A. <SEP> 1 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> DB.G. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> VN.L. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> R. <SEP> F. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> B. <SEP> D.
<SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> J.A. <SEP> 1 <SEP> binds <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> V.M. <SEP> I <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> E. <SEP> P. <SEP> 1 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> L.T. <SEP> 1 <SEP> <<SEP> -4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
EMI0004.0000
Sample
<tb> age <SEP> before <SEP> 56 <SEP> days <SEP> after
<tb> Subjects <SEP> (years) <SEP> vaccination <SEP> Situation <SEP> vaccination
<tb> C.C. <SEP> I <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> A.M. <SEP> 1 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> R.O. <SEP> 1 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> L.A. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP> ND
<tb> D.A. <SEP> 2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> G.O. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> M.A.
<SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP> ND
<tb> 1.A. <SEP> l <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> P.A. <SEP> 2 <SEP> 1/2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP>> <SEP> 32
<tb> D.B. <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP> 32
<tb> GB.K. <SEP> 5 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> V <SEP> 8
<tb> GB.F. <SEP> 4 <SEP> <<SEP> 4 <SEP> T <SEP> <<SEP> 4
<tb> V <SEP> = <SEP> vaccinated
<tb> T <SEP> = <SEP> control <I> Example 2 </I> The technique is that described in example 1 but the passages are continued until the 30th passage in primary cultures of RK cells.
A vaccine is prepared from the viral material of this 30th passage and the safety tests are carried out as described in Example 1.
The immunogenic power of the preparation is tested on animals (monkeys).
The results are given in Table IV.
EMI0004.0011
<I> Table <SEP> IV </I>
<tb> Response <SEP> antibody <SEP> of <SEP> monkeys <SEP> inoculated <SEP> by <SEP> intramuscular <SEP> route <SEP> with <SEP> 109.s <SEP> InD50.
<tb> Sample
<tb> of <SEP> serum <SEP> Results <SEP> of the <SEP> test <SEP> SN <SEP> on <SEP> cells
<tb> Monkey <SEP> before <SEP> GMK <SEP> towards <SEP> 10 <SEP> InD30 <SEP> from <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 25 * <SEP> 39 *
<tb> <B> 1098 <SEP> <<SEP> 1/4 </B> <SEP> 1 / e <SEP> <B> ND </B>
<tb> <B> 1091 </B> <SEP> <<SEP> 1 / .4 <SEP> 1 / e <SEP> ND
<tb> 919 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1 / <B> 8 </B>
<tb> 943 <SEP> <<SEP> <B> 1/4 <SEP> 1/18 <SEP> 1/18 </B>
<tb> * <SEP> days <SEP> after <SEP> inoculation
Example j Starting with the viral material originating from the 21st step at 341) C as obtained in example 1, 9 additional successive passages are carried out on primary cultures of RK cells but at 281) C. including the last stage for vaccine preparation.
The resulting vaccine is tested for safety and inoculated into monkeys and rabbits for determination of antigenicity.
The results are given in the following Tables V and VI.
EMI0004.0026
<I> Table <SEP> V </I>
<tb> Response <SEP> antibody <SEP> of <SEP> monkeys <SEP> inoculated <SEP> by <SEP> intramuscular <SEP> route <SEP> with <SEP> 10'2, "<SEP> InD50.
<tb> Sample
<tb> of <SEP> serum <SEP> Results <SEP> of the <SEP> test <SEP> SN <SEP> on <SEP> cells
<tb> Monkey <SEP> before <SEP> GMK <SEP> towards <SEP> 10 <SEP> InD50 <SEP> of <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 25 * <SEP> 39 *
<tb> <B> 1 </B> 003 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 11/8 <SEP> 1 /,
R
<tb> 977 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/8
<tb> '<SEP> days <SEP> after <SEP> inoculation
<tb> <I> Table <SEP> VI </I>
<tb> Response <SEP> antibody <SEP> of <SEP> rabbits <SEP> inoculated <SEP> by <SEP> intramuscular <SEP> route <SEP> with <SEP> 109th <SEP> InD50.
<tb> Sample
<tb> of <SEP> serum <SEP> Results <SEP> of the <SEP> test <SEP> SN <SEP> on <SEP> cells
<tb> Rabbit <SEP> before <SEP> GMK <SEP> towards <SEP> 10 <SEP> InD50 <SEP> of <SEP> virus
<tb> n <SEP> inoculation <SEP> 26 *
<tb> 29 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/8
<tb> 30 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<tb> 31 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> <B> 1 / 1N </B>
<tb> 32 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1 / e
<tb> 33 <SEP> <<SEP> 1/4 <SEP> 1/4
<tb> * <SEP> days <SEP> after <SEP> inoculation <I> Example 4 </I> The technique is that described in example 1 but the passages are continued until the 51st
passage through primary cultures of RK cells, the final storage medium consisting of Hanks 'solution supplemented with 0.3% of casein hydrolysis and containing 50 mg of chloramphenicol per ml of Hanks' solution.
After incubation for 9 days at 34o C, the supernatant is harvested, clarified by centrifugation and mixed with an equal volume of stabilizing solution consisting of 30 g of potassium glutamate, 200 g of sucrose and 50 mg of chloramphenicol per liter of. distilled water and the mixture is distributed in glass vials each containing one ml of preparation.
The vials are then freeze-dried and hermetically sealed.
After reconstitution by adding one ml of distilled water, the vaccine is inoculated subcutaneously into 65 seronegative subjects, the individual dose titer amounting to approximately 102.6 InD50 on GMK or 103- cells; PFU (Plaque Forming Units) on RK 13 cells. A group of 30 seronegative children was kept in close contact with the vaccinees for a period of 6 weeks.
A serological response test carried out on the group of 65 vaccinated subjects showed that all but one responded to the vaccine with an average antibody titer of 1/128, as shown by the HAI (Inhibition of Hepagglutination) test. None showed clinical signs of infection.
The 30 controls remained serologically neeative. Example 5 The technique is that described in Example 1 but the passages are continued until 61, passage on primary cultures of RK cells. the final storage medium consisting of a Hanks solution supplemented with 0.3 0, u of casein hydrolysis and containing 50 ml of chloramphenicol per ml of Hanks solution.
After incubation for 9 days at 34-, C. the supernazeant is harvested. clarified by centrifugation and mixed with an equal volume of stabilizing solution consisting of <B> </B>.; 0 g of potassium glutamate. 200g of sucrose and 50m; of chloramphenicol per liter of distilled water. and the mixture is distributed in glass vials containing one ml of preparation.
The vials are then freeze-dried and hermetically sealed.
After reconstitution by adding one ml of distilled water, the vaccine is inoculated subcutaneously into seronegative subjects. the titer of the individual doses amounts to approximately 10 = -43 InD50 on GMK cells or PFU on RK 13 cells.
A serological response test carried out on a group of 7 seronegative subjects showed that all responded <<a vaccine with an average titer of 3 / s4 as revealed by the HAI test. None showed clinical signs of infection