Procédé pour obtenir des fractions spermatiques La présente invention se rapporte à un procédé pour la séparation des spermatozoïdes contenant des chromo somes X des spermatozoïdes contenant des chromo somes Y.
Il a été déterminé que le sexe de la descendance est commandé par les chromosomes des cellules des sper matozoïdes particuliers qui ont fertilisé l'oeuf. C'est-à- dire que certains des spermatozoïdes (appelés ci-après sperme<B> )</B> sont connus du point de vue génotype comme contenant des chromosomes X ou chromosomes femelles, tandis que les autres contiennent des chromoso mes Y ou chromosomes mâles. A l'examen au micros cope, les spermatozoïdes contenant le chromosome X apparaissent comme étant de plus grandes dimensions que les spermatozoïdes contenant le chromosome Y.
Quand un spermatozoïde contenant le chromosome X (appelé ci-après sperme X ) se combine avec l'oeuf (qui contient des chromosomes X) il en résulte une descendance femelle. Lorsqu'un spermatozoïde conte nant le chromosome Y (appelé ci-après sperme Y ) se combine avec l'oeuf, il en résulte une descendance mâle. La population des spermatozoïdes dans l'éjaculation d'un mâle mammifère contient à la fois des spermato zoïdes à chromosome X et des spermatozoïdes à chro mosome Y. Jusqu'à présent, on n'a pas pu séparer d'une façon satisfaisante ces spermatozoïdes en composant X et en composant Y.
Il est évident, cependant, que la séparation de deux types de spermatozoïdes permettrait un choix ou une sélection du sexe final de la descen- dance. En conséquence, la présente invention concerne un procédé pour obtenir, à partir du sperme total, des fractions spermatiques enrichies de manière prépondé rante, en spermatozoïdes comportant soit le chromosome Y lié au sexe masculin, soit le chromosome X lié au sexe féminin, caractérisé en ce que l'on mélange du sperme total frais avec un milieu nutritif visqueux,
per méable aux spermatozoïdes et sépare le mélange en au moins une fraction dans laquelle la majorité des sperma tozoïdes présents comportent le même chromosome, soit le chromosome Y, soit le chromosome X.
D'autres avantages de la présente invention ressorti ront de la description détaillée qui va suivre faite en regard des dessins annexés qui donnent à titre indicatif plusieurs formes de réalisation du procédé selon l'in vention.
Sur ces dessins la fig 1 est un schéma représentant un mode d'exé cution du procédé selon la présente invention; la fig. 2 représente schématiquement le processus de séparation à divers moments dans le temps, la fig. 3 est un graphique illustrant la séparation d'une population type de spermatozoïdes en composan tes possédant un chromosome afférent à un sexe diffé rent ; la fig. 4 est une vue en coupe et en élévation d'un appareil destiné à la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, la fig. 5 est une vue en coupe suivant la ligne 5-5 de la fig. 4 ;
la fig. 6 est une vue en coupe suivant les lignes 6-6 de la fig. 4 ; la fig. 7 est une vue de détail à plus grande échelle d'une partie de l'appareil représenté sur la fig. 4 ; les fig. 8 à 10 sont des graphiques représentant des exemples particuliers de séparation du sperme.
La présente invention est basée sur la découverte que deux génotypes du sperme de mammifère (X et Y) peuvent être séparés suivant des caractéristiques phéno- typiques en appliquant une force de flottation faisant atteindre dans un milieu par les spermatozoïdes qui flottent le mieux un niveau différent de celui atteint par les spermatozoïdes qui flottent le moins bien. La force de flottation peut être positive, ce qui fait élever le corps, ou négative ce qui fait tomber le corps dans le milieu.
Comme exemple particulier de force de flottation, la pesanteur peut être considérée comme une force de flottation négative servant à séparer le sperme par sédi mentation. On a trouvé que la sédimentation aux basses températures dans un milieu de caractéristiques réglées d'une façon critique se traduit par la séparation du sperme X du sperme Y .
Lorsqu'une particule inerte tombe à travers un milieu, elle suit la loi de Stokes en ce qui concerne sa vitesse de sédimentation sous l'influence des forces phy siques de flottation du liquide, de la viscosité du liquide, de la force de la pesanteur et de la différence de densité entre le milieu et les particules.
A partir de la loi de Stokes, on a trouvé que
EMI0002.0009
où v = vitesse des particules (cm<B>;</B> sec-') o = densité des particules (g/cm-3) o'= densité du milieu (g/cm-3) m = masse des particules (g) g = accélération de la pesanteur (981 cm sec-2) o@ = tension de surface (g/cm ) K = constante des particules, dépendant de leur for me géométrique.
Suivant la loi de Stokes, la vitesse des particules qui tombent varie suivant les dimensions et la forme de la particule ainsi que de la différence de densité entre le milieu et la particule. Lorsque la vitesse de chute d'une catégorie de particule suit la loi de Stokes, on obtient une répartition normale de Gauss de la floculation, de sorte que les diverses fractions de sédimentation contien nent des particules de densité et de volumes égaux.
On a trouvé que dans les, conditions réglées, avec soin, les sédiments de sperme à travers une colonne d'un milieu peuvent aboutir à des fractions supérieure et inférieure, dans lesquelles les proportions de sperme X -> et Y >> sont très différentes. Les différences phéno typiques observées dans le sperme se rapportent à leurs génotypes de sexe.
¯ La fi-. 1 est un schéma représentant un mode d'exé cution du procédé selon la présente invention. Le sperme frais est en général d'abord collecté à partir du mâle, lequel sperme contient des quantités égales de sperme X et de sperme Y . Ce sperme est mélangé avec un milieu nutritif au cours du stade 12. Le milieu nutritif est absorbé dans le sperme au cours du stade 13, après quoi le mélange est progressivement refroidi au cours du stade 14. Lorsqu'il est refroidi, le mélange est soumis à une sédimentation au cours du stade 16. Les fractions de sédiments sont alors séparées au cours du stade 17 afin d'isoler le sperme X ou le sperme Y , à volonté.
Le sperme qui contient les chromosomes voulus en com binaison avec le mélange nutritif peut alors être inséminé artificiellement dans la femelle du type à partir duquel le sperme a été obtenu. Bien entendu, on peut également croiser un cheval avec un âne et avec un zèbre, comme on peut croiser un loup avec un chien.
La présente invention convient pour être utilisée avec des spermes provenant de tous les mammifères. Particuliè rement intéressants parmi ceux-ci sont les êtres humains et les autres primates, le bétail, les porcs, les moutons, les lapins, les chats, les chèvres, les chevaux, les ânes et les bovins. On a déterminé qu'il existe une différence de densité entre le sperme X et le sperme Y , le sperme X étant plus dense que le sperme Y . Chez un sanglier, la différence de densité entre le sperme X et le sperme Y est environ de 18 /o.
Chez les tau reaux et les étalons, la différence de densité est d'environ 10 %, chez les mâles humains,
le sperme X est envi- ron 5 % plus dense que le sperme Y . Chez le lapin, la différence est approximativement de 3 0/0.
Le milieu choisi pour être utilisé au cours du stade 12 doit avantageusement avoir une densité suffisamment proche de celle du sperme pour que la légère différence de densité qui existe entre le sperme X et le sperme Y se traduise par une sédimentation en fractions dif férentes. Par rapport à la densité, la viscosité doit en général être également appropriée afin de régler la sédimentation. De plus, il est évident que le milieu ne doit pas altérer le taux de fertilité du sperme. C'est-à- dire que le milieu ne doit pas être dangereux pour le sperme et qu'il ne doit pas le détruire.
Au contraire, le milieu doit de préférence fournir des éléments nutritifs servant à maintenir vivant le sperme. Le sperme X , qui est relativement plus gros que le sperme Y , sem ble absorber sélectivement une plus grande quantité du milieu. Il est également évident que le milieu doit pré senter un pH approprié (c'est-à-dire un pH compris dans une gamme allant de 6,0 à 6,8) afin de lui permettre de servir de tampon, car un pH qui tomberait en dehors de la gamme physiologique de 6,0 à 6,8 tend à nuire à la fertilité du sperme ou à être toxique.
Une considération finale à propos du milieu est qu'il doit présenter de pré férence les propriétés d'un fluide de corps normal. C'est- à-dire que sa pression osmotique, ou osmolarité, doit être en général d'environ 300 mm de mercure de telle sorte que le sperme n'éclate pas et ne se trouve pas comprimé. Dans toute la description qui va suivre, les mesures du pH, de la densité et de la viscosité sont effectuées à 200 C.
Un milieu nutritif extrêmement satisfaisant peut être constitué par une combinaison de jaune d'#uf et de gly cine. Le jaune d'#uf présente des éléments nutritifs per méables au sperme qui sont absorbés et qui comprennent du glucose, du fructose et des acides aminés. Le jaune d'#uf présente également un pH (environ de 6,2 à 6,8), une viscosité et une densité appropriées, et c'est un corps normalement fluide, de sorte qu'il est approprié à être utilisé d'une façon générale comme milieu. Les valeurs particulières de densité, de viscosité, d'osmolarité et de pH voulues peuvent être obtenues en effectuant un réglage du jaune d'#uf et de glycine avant de l'utiliser.
La densité du jaune d'#uf en lui-même doit être aussi élevée que possible pour obtenir une sédimentation opti male. On a proposé d'ajouter de l'huile de. graine de coton à l'alimentation des poules et de choisir une race appropriée (par exemple des Leghorn) pour améliorer la densité du jaune d'aeuf.
Le lait frais de mammifère (en particulier le lait homogénéisé) et ses dérivés (par exemple la poudre de lait) peuvent remplacer le jaune d'#uf pour fournir des éléments nutritifs et augmenter la fertilité, mais la densité doit être réglée pour pouvoir l'utiliser d'une façon appropriée. D'autres éléments de remplacement pour le jaune d'#uf comprennent le jus de tomate, la crème de noix de coco provenant de noix de coco vertes, des flui- des du corps vivant et des extraits de ceux-ci ou des extraits de tissus (par exemple extraits de foie).
En variante, on peut utiliser de la dextrine en combinaison avec de la lécithine pour remplacer le jaune d'oeuf. La dextrine assure la densité, la viscosité et le pH et la lécithine sert d'élément nutritif. De plus, on peut utiliser du fructose, du glucose et d'autres monosaccharides pour former un milieu nutritif approprié.
De préférence, on utilise la glycine en solution aqueuse de 2 à 5 /o de glycine. Elle sert à régler le pH de la semence et à abaisser le point de congélation du milieu afin d'éviter un choc de température. Le rapport de la glycine au jaune d'oeuf dépend de la température, de la densité, de la viscosité et de l'osmolarité du mé lange de jaune d'oeuf. La solution de glycine présente une viscosité plus faible que celle du jaune d'aeuf, de sorte qu'une plus grande quantité de glycine est néces saire lorsque la viscosité doit être diminuée.
D'une façon générale, une seule partie de glycine à 4 % est nécessaire pour une à quatre parties de jaune d'oeuf.
Il est probable que la glycine est absorbée dans le sperme à partir du milieu et qu'elle tend à augmenter la vitesse de chute du sperme l'ayant absorbée. Du fait que les spermes X sont plus gros que les spermes Y , ils absorbent une plus grande quantité de glycine que ne le font les spermes Y . Par suite, la différence de den sité entre les spermes X et les spermes Y est accentuée par l'absorption de la glycine à un état légè rement hypotonique. C'est-à-dire qu'il y a une plus grande différence de densité entre les deux types de sperme lorsque leurs densités sont modifiées artificielle ment par l'absorption de glycine.
Comme autre variante, on peut remplacer la glycine par du glycérol dans le milieu nutritif. D'autres acides aminés, tels que le tryptophane, peuvent être utilisés avec des résultats satisfaisants.
Pour obtenir les meilleurs résultats, la densité du milieu nutritif varie suivant le type de mammifères ayant fourni le sperme. Pour les humains, ainsi que pour les lapins, la densité est en général comprise entre environ 1,01 à 1,19 g par cm3. Pour une gamme inférieure de densité, la plus grande partie du sperme tombe à travers le mélange de sorte que les fractions inférieures sont constituées par des mélanges de sperme X et de sper me Y . Cependant, les fractions supérieures ne contien nent qu'une faible quantité de sperme Y séparé. Aux limites supérieures de la gamme de densité, peu de sperme tombe à travers le milieu, de telle sorte que les fractions supérieures contiennent un mélange de sperme X et de sperme Y<B> .</B> Au-dessus de 1,19, seul le sperme X peut être séparé.
A une densité de 1,34, il ne se produit pas du tout de sédimentation et tout le sperme flotte sur le milieu. Afin de réaliser une séparation com plète entre le sperme X et le sperme Y<B> ,</B> une densité de milieu supérieure à environ 1,026 est en général nécessaire à la fois pour les taureaux et pour les humains. Cependant, ce chiffre varie avec la viscosité, la température et les autres conditions. Plus la densité du milieu se rapproche de la densité moyenne du sperme et meilleurs sont les résultats. D'autre part, il est évident que le milieu ne devrait pas présenter une densité telle qu'elle empêche la sédimentation.
Lorsque la densité du milieu se rapproche de celle du sperme le plus léger, la viscosité a relativement peu d'importance et elle peut être aussi faible que cela est réalisable en pratique, par exemple inférieure à 1,0 poise. Le tableau ci-dessous indique la gamme des densités et des viscosités pour divers types de mammifères, en indiquant la limite inférieure de densité et de viscosité pour obtenir une séparation satisfaisante, et la limite supérieure pour obtenir une sédimentation satisfaisante.
Toutes les mesures effectuées sur le tableau le sont à 20 C, la densité étant donnée en g/cml et la viscosité en poises.
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<I>Tableau</I>
<tb> Densité <SEP> Viscosité
<tb> Basse <SEP> Haute <SEP> Basse <SEP> Haute
<tb> Homme. <SEP> . <SEP> 1,022 <SEP> 1,09 <SEP> 0,02 <SEP> 1,2
<tb> Lapin <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,022 <SEP> 1,09 <SEP> 0,02 <SEP> 1,2
<tb> Taureau <SEP> . <SEP> 1,023 <SEP> 1,10 <SEP> 0,07 <SEP> 3,0
<tb> Porc <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,03 <SEP> 1,15 <SEP> 0,07 <SEP> 3,0 La viscosité du milieu est en rapport avec la densité. Pour les humains et les lapins, une densité de 1,02 g par cm" correspond à une viscosité d'environ<B>1,00</B> poise.
La densité supérieure de 1,09 correspond à environ 0,075 poise. La limite supérieure de la densité utilisable en pratique pour les humains et les lapins, 1,19 g par cm@j, correspond à environ 0,05 poise.
La pression osmotique du milieu doit habituellement varier entre une limite inférieure d'environ 270 et une limite supérieure d'environ 330 mm de mercure.
L'absorption du milieu dans le sperme, stade 13, s'effectue de préférence pendant une période d'une durée d'environ 15 minutes. Bien qu'il soit possible de com mencer à refroidir le mélange sans une période d'absorp tion de durée appréciable, il est en général avantageux de laisser l'absorption s'effectuer pendant une période de courte durée à la température ambiante. Le mélange de sperme et de milieu peut être maintenu à la tempé rature ambiante pendant une durée pouvant s'élever jusqu'à 3 heures pour permettre l'absorption. Il est pro bable qu'il se produit une absorption sélective de subs tances perméables, telles que la glycine, la glycérine, et le fructose à la température ambiante.
En augmentant la durée de la période d'absorption au-delà de 15 minutes, on modifie le taux de sédimentation. C'est-à-dire que le sperme X qui est plus gros absorbe une plus grande quantité de milieu et tombe à une plus grande vitesse que le sperme Y ou le sperme X qui n'ont pas absorbé autant du milieu dense.
Après que le milieu a été absorbé dans le sperme, on refroidit progressivement le mélange afin d'immobi liser le sperme. Avec un équipement de refroidissement classique, il est commode de permettre au refroidisse ment de s'effectuer pendant quatre heures pour obtenir une température inférieure à 1,0 C. Cependant, avec un équipement de refroidissement rapide, on peut réduire la durée de cette période à quelques minutes seulement. Par suite, une période d'une durée comprise entre 1 et 300 minutes peut être prévue pour permettre au mélange de se refroidir à une température inférieure à 1,0o C.
Après avoir atteint cette température, on peut maintenir le mélange jusqu'à une durée de 15 heures à la basse température.
Le temps nécessaire pour effectuer l'opération de sédimentation 16 veut varier considérablement.. Avec des milieux de densité relativement faible, les particules tombent d'une façon relativement rapide, de sorte qu'une durée de sédimentation plus courte suffit. Au contraire, des milieux denses et visqueux tendent à ralentir la chute des particules inertes, de sorte qu'une période de durée relativement longue est nécessaire pour la sédi- mentation. En général, il faut de 1 à 24 heures pour obtenir une sédimentation convenable.
En se reportant à la fig. 2, la durée de la sédimen tation doit être telle que les deux fractions soient à peu près complètement séparées comme on le voit au temps 12. Au temps 0, le sperme X (représenté par le signe T i ) et le sperme Y (représenté par le signe 0) sont tous les deux mélangés ensemble lorsque le mélange refroidi pénètre dans la colonne de sédimentation. Après quelques heures, par exemple 4 heures pour le mode de réalisation particulier représenté, le sperme X qui est plus dense a tendance à se séparer du sperme Y moins dense pendant la chute à travers la colonne de sédimentation.
Le sperme X et le sperme Y tom bent tous les deux, mais le sperme X tombe plus rapidement. Au temps 12, dans l'exemple représenté, il se produit une séparation à peu près complète du < < sperme X et du sperme Y<B> .</B> A ce point la sédi mentation doit être arrêtée et les fractions doivent être séparées. Si les fractions ne sont pas séparées au moment voulu, ils se mélangent en se rapprochant du fond de la colonne de sédimentation, comme on le voit au temps 30.
Si l'on utilise une période de durée insuffisante pour la sédimentation, la chute est lente au point qu'il ne se produit qu'une faible séparation entre les fractions de < .= sperme X et de sperme Y . Si l'opération de sédi mentation prend plus de 24 heures environ, le milieu lui-même tend à se séparer. C'est-à-dire que les ions minéraux et d'autres particules lourdes du milieu colloï dal se séparent après des périodes de longue durée. De plus, les particules du milieu précipitent du fluide si une përiode d'une durée supérieure à 24 heures est utilisée.
Pour obtenir une séparation plus complète des frac tions, sans séparation nuisible du milieu, il est préfé rable que l'opération de sédimentation dure de 9 à 18 heures environ, suivant les types d'animaux et le type de milieu. Pour les humains, une période d'environ 12 heures est optimale pour obtenir une sédimentation appropriée, lorsqu'on utilise comme milieu du jaune d'#uf.
Suivant le milieu utilisé, il faut une température com prise entre -5,0 C et environ 1,0 C. En dessous de cette gamme de températures, les caractéristiques physi ques du milieu sont modifiées dans une mesure telle qu'on n'obtient pas de sédimentation convenable. Pour des températures plus élevées, le sperme tend à nager ou à se déplacer de son propre mouvement à travers le milieu et ne se sépare pas comme des particules inertes tombant librement au cours de l'opération de sédimen tation. Par suite, la température préférée pour un milieu constitué par du jaune d'oeuf et de la glycine est de 0,0', C.
Pendant le processus, il faut avoir soin d'éviter toute vibration excessive. Des secousses violentes tendent à déchirer les queues des spermatozoïdes. De plus, pendant l'opération de sédimentation, même des vibrations légè res nuisent à la chute du sperme de sorte qu'il ne se comporte pas comme des particules inertes. Par ailleurs, une légère vibration tend à faciliter la sédimentation. Il faut prendre un soin particulier lorsqu'on extrait les frac tions d'éviter toute vibration et toute contamination des fractions voisines. Dans ce but, il est avantageux d'effec tuer la vidange goutte à goutte, avec environ une à deux secondes par goutte.
Après avoir évacué une fraction, le mélange restant doit pouvoir se décanter pendant une durée au moins aussi longue que la durée ayant été utilisée pour évacuer une fraction. Ainsi, si 45 secondes sont nécessaires pour extraire une fraction, une seconde période de 45 secondes doit avantageusement s'écouler avant d'extraire les fractions suivantes.
Un autre facteur dont il faut tenir compte est qu'il faut de préférence éviter la lumière visible. La lumière nuit à la fertilité du sperme et lui fait perdre son effi cacité pour percer l'enveloppe protectrice d'un neuf. La fertilité peut également être altérée par un pH extrême ment élevé ou extrêmement faible du milieu (tombant en dehors de la gamme de 6,0 à 6,8 pour la plupart des espèces) par l'âge du sperme et par le nombre de sper matozoïdes motiles.
Les fractions qui peuvent être séparées au cours de l'opération 17 contiennent des quantités variables de sperme X et de sperme Y . Comme représenté sur la fig. 3 qui indique d'une façon type les conditions qu'on obtient en réalité avec chacune des espèces de mammifères mentionnées ici, une séparation à peu près complète du sperme X et du sperme Y est possi ble et a été obtenue à l'aide d'une mise en #uvre du procédé de la présente invention (voir les exemples par ticuliers). Ainsi, sur la fig. 3 qui se rapporte au sperme humain, la fraction comprise entre 1 et 3 contient à peu près tout le sperme X .
La fraction comprise entre 14 et 23 contient à peu près tout le sperme Y . Une frac tion efficace pour mettre en #uvre la présente invention doit comprendre au moins 60 % soit du sperme X soit du sperme Y (suivant la sélection) afin de sur monter le rapport 50-50 qui existe dans la nature.
Pour des applications industrielles, au moins 75 0/0 du sperme doit avantageusement être du sexe voulu, si la dépense nécessaire pour mettre en #uvre le procédé ne doit pas être prohibitive.
De préférence, au moins 90 % du sperme doit être d'un seul type de façon à réduire le risque d'obtenir une descendance du sexe opposé à un taux statistique admis sible. Bien entendu, une séparation de 100 % est la plus avantageuse du fait qu'il n'y a aucun risque d'erreur.
Une séparation complète assure qu'en cas de conception la descendance sera du sexe voulu. Lorsqu'une sépara tion à peu près complète est réalisée, comme sur la fig. 3, chaque fraction est constituée essentiellement par des spermatozoïdes n'ayant que le chromosome voulu, dans un véhicule.
Un nouvel apareil, apte à mettre en #uvre le procédé décrit ci-dessus est représenté sur les fig. 4 à 6.
Comme on le voit sur la fig. 4, une colonne 21 est utilisée pour effectuer la sédimentation du mélange de sperme et de milieu. Un mécanisme d'alimentation approprié, indiqué en 22, sert à introduire le mélange de milieu et de sperme dans la colonne. La colonne 21 peut être constituée par un cylindre extérieur en verre 23 pourvu d'une fermeture ou bouchon 24 à son extrémité supérieure. L'extrémité inférieure du cylindre 23 peut être supportée par un double bouchon 26 qui sert égale ment de fermeture à une chambre collectrice 27 disposée à l'extrémité inférieure de la colonne.
A l'intérieur du cylindre 23 est disposée une cham bre de sédimentation ou burette 28 dans laquelle le mélange est introduit par le mécanisme d'alimentation 22. On a trouvé qu'une burette en verre d'une diamètre de 1,5 cm et d'une longueur de 15 cm est extrêmement satisfaisante. La burette est pourvue à son extrémité inférieure d'un robinet d'arrêt 29 permettant d'évacuer les fractions. Dans le mode de réalisation représenté, les fractions. sont vidées dans un bêcher 31. La chambre collectrice 27 sert d'enceinte protégeant l'appareil pen dant la vidange des fractions de la burette 28 dans le bêcher 31.
Afin d'éviter toute turbulence aux fractions après la sédimentation, la burette 28 est pourvue de parois 35 s'inclinant progressivement. Les burettes classiques pré sentent une courbure relativement brusque immédiate ment au-dessus du robinet d'arrêt. Une telle structure produit une turbulence et des contre-courants des frac tions de sédimentation, ce qui se traduit par une conta mination des fractions voisines et le mélange du ( < sperme X avec le K sperme Y .
La structure perfectionnée qui est représentée sur la fig. 4 comporte une burette 28 munie de parois 35 s'inclinant progressivement de façon à éviter tout mélange et toute contamination par tur bulence.
De préférence, comme on le voit sur la fig. 7, l'ou verture du robinet d'arrêt 29 et la base des. parois incli nées 35 ont d'une façon précise le même diamètre, de sorte qu'aucun obstacle ne se présente à l'écoulement dans le robinet d'arrêt. La pente des parois de base 35 de la burette, dans le mode de réalisation préféré, se poursuit à travers le robinet d'arrêt 29, de sorte que la diminution de diamètre est progressive. De cette façon, l'ouverture formée dans le robinet d'arrêt apparaît sous la forme d'un tronc de cône. L'ouverture supérieure du robinet d'arrêt 29 présente de préférence un diamètre qui est le double de celui de l'ouverture inférieure.
Le robinet d'arrêt 29 est pourvu d'une poignée allon gée 32 traversant une ouverture 33 formée dans l'en ceinte protectrice 27. On peut ainsi manoeuvrer le robinet d'arrêt pendant que le bêcher 31 se trouve à l'intérieur de la chambre 27. Après avoir collecté une fraction séparée dans le bêcher 31, on peut enlever celui-ci de l'enceinte par une ouverture appropriée 34 (fig. 4 et 6).
Pour maintenir le mélange en cours de sédimentation à la basse température nécessaire, une certaine quantité de glace 40 est disposée à l'intérieur du cylindre exté rieur 23 autour de la burette 28. Comme on le voit sur les fig. 4 et 5, cet agencement assure que le mélange de sperme et de milieu disposé à l'intérieur de la burette 28 est maintenu à la température voulue.
Pour faire fonctionner l'appareil, un mélange pré- refroidi de sperme frais et de milieu est placé dans le mécanisme 22, représente sous la forme d'une petite pipette, et il est transféré à la burette 28, qui est égale ment remplie de milieu. Le sperme, dont la densité est supérieure à celle du milieu qui l'entoure, tend à tomber ou à se sédimenter vers le bas en traversant le milieu.
Suivant la loi de Stokes, le sperme X qui est plus dense tombe à une vitesse plus élevée que le sperme Y qui est moins dense, ce qui se traduit par le fait qu'il se produit une séparation entre le K sperme X et le ( < sperme Y . De faibles fractions du milieu sont vidées de la burette 28 à travers le robinet 29 dans le bêcher 31. Chaque fraction est essayée pour déterminer le nombre de spermatozoïdes afin de trouver des frac tions qui contiennent le sperme X et celles qui con tiennent le ((sperme Y .
Comme variante de mode de réalisation, on peut placer sur la burette des moyens servant à mesurer la densité, tels qu'un certain nombre de petits hydromètres, afin de déterminer l'emplacement des différentes frac tions qui contiennent le<B> </B>sperme X et le (@ sperme Y à mesure qu'elles se déplacent à travers la colonne. Ce mode de réalisation évite la nécessité de prélever de petites fractions et d'essayer chacune d'elles.
En utilisant du lait ou un corps fluide comme milieu, on peut déterminer l'emplacement des couches sédimen- tées sans les vidanger en utilisant une lumière monochro matique ou une énergie rayonnante de diverses fréquen ces afin de mesurer l'opacité du mélange.
De cette façon, avec un milieu transparent ou translucide, tel que du lait, on peut placer sur un côté de la colonne une source de lumière et une cellule photoélectrique sur l'autre côté de la colonne (connectée à un amplificateur et à un enregistreur) afin de mesurer l'opacité du mélange et déterminer les points où sont disposées les couches séparées de sperme.
Les emplacements des couches séparées peuvent éga lement être déterminés en mesurant la conductivité en divers points dans la colonne. Dans ce but, des électrodes multiples sont disposées sur la colonne afin de détermi ner la variation de conductivité du contenu de la colonne en divers points sur sa longueur.
La conductivité des couches de sperme séparées est différente de celle du milieu de support, D'autres moyens pour déterminer l'emplacement des couches de sperme sédimentées comprennent des techni ques de microdensitométrie qui servent à mesurer la den sité en utilisant une lumière polarisée et des techniques d'examen au microscope qui mesurent la diffusion de la lumière polarisée.
Dans un autre mode de réalisation, on peut rempla cer la burette par un tube en gélatine. Lorsque la sépa ration du sperme X et du ( < sperme Y se produit, la température du tube et de son contenu est abaissée par paliers jusqu'à des températures bien inférieures à la congélation, par exemple une température de -20" C et le mélange séparé est congelé sur place. Le tube con gelé peut alors être découpé en fractions appropriées, à volonté. L'emmagasinage du sperme séparé est ainsi possible pendant des périodes de durée relativement longues.
Comme exemple général, servant à illustrer le fonc tionnement de l'appareil, on peut préparer un milieu avec quatre parties de jaune d'oeuf et une partie d'une solution de glycine à 4 % dans de l'eau. De la semence fraîchement collectée est mélangée avec ce milieu de telle sorte qu'on obtient une population de deux à trois cent millions de spermatozoïdes par millimètre et qu'on la laisse reposer à la température
ambiante pendant 15 minutes. La température du mélange est ensuite ame née à 00 C. Ce mélange est placé au sommet d'une colonne de milieu se trouvant dans une burette. Le milieu dans la colonne est également à une température de 00 C. Les spermatozoïdes peuvent alors se sédimenter pendant 12 heures, après quoi les fractions sont vidan gées. Le nombre de spermatozoïdes contenus par chaque fraction est compté et on trace une courbe du nombre en fonction des fractions.
<I>Exemple 1</I> On a collecté de la semence humaine fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu formé de quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de gly- cine à 4 %. La densité du milieu était de 1,0273, la viscosité était de 0,4326 poise et le pH de 6,09, toutes les mesures étant effectuées à 200 C.
Le mélange a été absorbé dans la semence pendant une durée de 15 mi nutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 30 C. Après 8 heures, la température du mélange a été réduite à 0 C. 12 heures plus tard, on a placé le mélange dans une colonne remplie du même milieu que celui décrit plus haut, maintenu à 0n C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0n C pendant 18 heures. Ensuite, on a fait écouler des fractions de 15 gouttes, chaque fraction demandant 45 secondes pour s'écouler avec une période d'attente de 45 secondes entre chaque période d'écoulement.
Un échantillon de chaque fraction a été prélevé dans une pipette et il a été dilué 200 fois avec une solution saline à 5 % dé formol. Les spermatozoïdes ont été comptés dans un hémacytomètre sous micros cope. Lorsqu'on a déterminé que les fractions de sperme étaient critiques par représentation graphique, on a essayé un second échantillon de la même fraction, et on a fait la moyenne des nombres de spermatozoïdes comptés les deux fois.
Les nombres de spermatozoïdes. obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la fig. 3. On notera sur la fig. 3 qu'on a obtenu deux pointes aux fractions 1 et 19. <I>Exemple 2</I> On a collecté de la semence humaine fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu cons titué par quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 % dans de l'eau. La densité du milieu
était de<B>1,0239</B> et le pH de 6,10, tous les deux mesurés à 20 C. Le mélange a été absorbé dans la semence pen dant une période d'une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 30 C. Après 10 heures, la température était réduite à 00 C, 13 heures plus tard, on a placé le mélange dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut, et on l'a maintenu à 0u C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0 C. Après sédimentation pendant 9 heures 1/2, on a fait écouler des fractions de 15 gouttes. Chaque fraction demandait 45 secondes pour s'écouler, avec une période d'attente de 45 secondes entre chaque période d'écoule ment.
Un échantillon de chaque fraction a été prélevé dans une pipette et on l'a dilué 200 fois avec une solu- tion saline à 5 % de formai. On a compté les sperma- tozoïdes dans un hémacytomètre sous microscope. Les nombres critiques de spermatozoïdes ont été mesurés deux fois et on en a fait la moyenne. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la fi-. 8.
On notera sur la fig. 8 qu'on a obtenu deux pointes pour les fractions 15 et 20. <I>Exemple 3</I> On a collecté de la semence de taureau de Hereford fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu constitué de quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 0/0. La densité à 200 C était de 1.0263. Le mélange a été absorbé dans la semence pen dant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 0 C pendant 7 heures et demie. Ensuite, le mélange a été placé dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut et il a été main tenu à 09 C.
Toute la colonne a été placée dans un réfri gérateur à -0,5,1 C pendant 11 heures et demie. On a suivi le même mode opératoire d'écoulement et de comptage des spermatozoïdes que ceux qui ont été décrits dans les exemples 1 et 2. Les nombres de sperma tozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la fig. 9. On notera sur la fig. 9 qu'on a obtenu deux pointes aux fractions 1 et 20.
<I>Exemple 4</I> On a collecté de la semence de taureau de Jersey fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec le même milieu que celui utilisé dans les exemples précé dents. La densité était de 1,0283, la viscosité de 0,430, et le pH de 6,1, toutes les mesures étant effectuées à 20 C. Le mélange a été absorbé dans la semence pen dant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur pendant 5 heures à une température de 0 C. Ensuite, on a placé le mélange dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut et on l'a maintenu à 00 C.
Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 01, C pendant 121/2 heures. Après sédimentation, on a suivi le même mode opératoire d'écoulement et de mesure que ceux décrits dans les exemples précédents. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de frac tion sur la fig. 10. On notera sur la fig. 10 qu'on a obtenu deux pointes pour les fractions 1 et 18.
Les exemples précédents concernant les taureaux illustrent la technique de séparation et on a déterminé qu'elle donnait plus de 60 % de descendance d'un seul sexe lorsqu'elle est inséminée artificiellement en utilisant des techniques classiques.
Bien que la sédimentation soit décrite ici comme un mode de réalisation particulier de la présente invention, on voit que la séparation du sperme Y plus petit et moins dense du sperme X plus gros et plus dense peut être effectuée par n'importe quel moyen approprié. Ainsi, en appliquant une force plus importante que la pesanteur (ou s'exerçant dans une direction différente), dans des conditions appropriées, on obtient une sépara tion suivant les dimensions et la forme des particules. On peut utiliser par exemple une centrifugeuse travaillant sans, vibrations pour appliquer une force supérieure à la pesanteur.
De plus, dans certains milieux, le sperme X et le sperme Y présentent des taux de flottation différents, à la différence des taux de sédimentation et peuvent être séparés de cette façon. En fait, en choisis sant un milieu d'une densité inférieure à la densité moyenne du sperme X et supérieure à la densité moyenne du sperme Y . on peut faire élever le sper me Y et on peut faire tomber le sperme X . En absorbant sélectivement des substances appropriées, on peut accroître la flottation positive, de la même façon que l'absorption sélective de glycine, par exemple, fait augmenter la flottation négative.
L'appareil permet la sédimentation de mélanges de spermes de sorte que le sperme X qui est plus dense tombe à une vitesse plus élevée que le sperme Y qui est moins dense et par suite s'en sépare. Le procédé permet d'obtenir une séparation à peu près complète des types de sperme en deux fractions.