Procédé pour obtenir des fractions spermatiques La présente invention se rapporte à un procédé pour la séparation des spermatozoïdes contenant des chromo somes X des spermatozoïdes contenant des chromo somes Y.
Il a été déterminé que le sexe de la descendance est commandé par les chromosomes des cellules des sper matozoïdes particuliers qui ont fertilisé l'oeuf. C'est-à- dire que certains des spermatozoïdes (appelés ci-après sperme<B> )</B> sont connus du point de vue génotype comme contenant des chromosomes X ou chromosomes femelles, tandis que les autres contiennent des chromoso mes Y ou chromosomes mâles. A l'examen au micros cope, les spermatozoïdes contenant le chromosome X apparaissent comme étant de plus grandes dimensions que les spermatozoïdes contenant le chromosome Y.
Quand un spermatozoïde contenant le chromosome X (appelé ci-après sperme X ) se combine avec l'oeuf (qui contient des chromosomes X) il en résulte une descendance femelle. Lorsqu'un spermatozoïde conte nant le chromosome Y (appelé ci-après sperme Y ) se combine avec l'oeuf, il en résulte une descendance mâle. La population des spermatozoïdes dans l'éjaculation d'un mâle mammifère contient à la fois des spermato zoïdes à chromosome X et des spermatozoïdes à chro mosome Y. Jusqu'à présent, on n'a pas pu séparer d'une façon satisfaisante ces spermatozoïdes en composant X et en composant Y.
Il est évident, cependant, que la séparation de deux types de spermatozoïdes permettrait un choix ou une sélection du sexe final de la descen- dance. En conséquence, la présente invention concerne un procédé pour obtenir, à partir du sperme total, des fractions spermatiques enrichies de manière prépondé rante, en spermatozoïdes comportant soit le chromosome Y lié au sexe masculin, soit le chromosome X lié au sexe féminin, caractérisé en ce que l'on mélange du sperme total frais avec un milieu nutritif visqueux,
per méable aux spermatozoïdes et sépare le mélange en au moins une fraction dans laquelle la majorité des sperma tozoïdes présents comportent le même chromosome, soit le chromosome Y, soit le chromosome X.
D'autres avantages de la présente invention ressorti ront de la description détaillée qui va suivre faite en regard des dessins annexés qui donnent à titre indicatif plusieurs formes de réalisation du procédé selon l'in vention.
Sur ces dessins la fig 1 est un schéma représentant un mode d'exé cution du procédé selon la présente invention; la fig. 2 représente schématiquement le processus de séparation à divers moments dans le temps, la fig. 3 est un graphique illustrant la séparation d'une population type de spermatozoïdes en composan tes possédant un chromosome afférent à un sexe diffé rent ; la fig. 4 est une vue en coupe et en élévation d'un appareil destiné à la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, la fig. 5 est une vue en coupe suivant la ligne 5-5 de la fig. 4 ;
la fig. 6 est une vue en coupe suivant les lignes 6-6 de la fig. 4 ; la fig. 7 est une vue de détail à plus grande échelle d'une partie de l'appareil représenté sur la fig. 4 ; les fig. 8 à 10 sont des graphiques représentant des exemples particuliers de séparation du sperme.
La présente invention est basée sur la découverte que deux génotypes du sperme de mammifère (X et Y) peuvent être séparés suivant des caractéristiques phéno- typiques en appliquant une force de flottation faisant atteindre dans un milieu par les spermatozoïdes qui flottent le mieux un niveau différent de celui atteint par les spermatozoïdes qui flottent le moins bien. La force de flottation peut être positive, ce qui fait élever le corps, ou négative ce qui fait tomber le corps dans le milieu.
Comme exemple particulier de force de flottation, la pesanteur peut être considérée comme une force de flottation négative servant à séparer le sperme par sédi mentation. On a trouvé que la sédimentation aux basses températures dans un milieu de caractéristiques réglées d'une façon critique se traduit par la séparation du sperme X du sperme Y .
Lorsqu'une particule inerte tombe à travers un milieu, elle suit la loi de Stokes en ce qui concerne sa vitesse de sédimentation sous l'influence des forces phy siques de flottation du liquide, de la viscosité du liquide, de la force de la pesanteur et de la différence de densité entre le milieu et les particules.
A partir de la loi de Stokes, on a trouvé que
EMI0002.0009
où v = vitesse des particules (cm<B>;</B> sec-') o = densité des particules (g/cm-3) o'= densité du milieu (g/cm-3) m = masse des particules (g) g = accélération de la pesanteur (981 cm sec-2) o@ = tension de surface (g/cm ) K = constante des particules, dépendant de leur for me géométrique.
Suivant la loi de Stokes, la vitesse des particules qui tombent varie suivant les dimensions et la forme de la particule ainsi que de la différence de densité entre le milieu et la particule. Lorsque la vitesse de chute d'une catégorie de particule suit la loi de Stokes, on obtient une répartition normale de Gauss de la floculation, de sorte que les diverses fractions de sédimentation contien nent des particules de densité et de volumes égaux.
On a trouvé que dans les, conditions réglées, avec soin, les sédiments de sperme à travers une colonne d'un milieu peuvent aboutir à des fractions supérieure et inférieure, dans lesquelles les proportions de sperme X -> et Y >> sont très différentes. Les différences phéno typiques observées dans le sperme se rapportent à leurs génotypes de sexe.
¯ La fi-. 1 est un schéma représentant un mode d'exé cution du procédé selon la présente invention. Le sperme frais est en général d'abord collecté à partir du mâle, lequel sperme contient des quantités égales de sperme X et de sperme Y . Ce sperme est mélangé avec un milieu nutritif au cours du stade 12. Le milieu nutritif est absorbé dans le sperme au cours du stade 13, après quoi le mélange est progressivement refroidi au cours du stade 14. Lorsqu'il est refroidi, le mélange est soumis à une sédimentation au cours du stade 16. Les fractions de sédiments sont alors séparées au cours du stade 17 afin d'isoler le sperme X ou le sperme Y , à volonté.
Le sperme qui contient les chromosomes voulus en com binaison avec le mélange nutritif peut alors être inséminé artificiellement dans la femelle du type à partir duquel le sperme a été obtenu. Bien entendu, on peut également croiser un cheval avec un âne et avec un zèbre, comme on peut croiser un loup avec un chien.
La présente invention convient pour être utilisée avec des spermes provenant de tous les mammifères. Particuliè rement intéressants parmi ceux-ci sont les êtres humains et les autres primates, le bétail, les porcs, les moutons, les lapins, les chats, les chèvres, les chevaux, les ânes et les bovins. On a déterminé qu'il existe une différence de densité entre le sperme X et le sperme Y , le sperme X étant plus dense que le sperme Y . Chez un sanglier, la différence de densité entre le sperme X et le sperme Y est environ de 18 /o.
Chez les tau reaux et les étalons, la différence de densité est d'environ 10 %, chez les mâles humains,
le sperme X est envi- ron 5 % plus dense que le sperme Y . Chez le lapin, la différence est approximativement de 3 0/0.
Le milieu choisi pour être utilisé au cours du stade 12 doit avantageusement avoir une densité suffisamment proche de celle du sperme pour que la légère différence de densité qui existe entre le sperme X et le sperme Y se traduise par une sédimentation en fractions dif férentes. Par rapport à la densité, la viscosité doit en général être également appropriée afin de régler la sédimentation. De plus, il est évident que le milieu ne doit pas altérer le taux de fertilité du sperme. C'est-à- dire que le milieu ne doit pas être dangereux pour le sperme et qu'il ne doit pas le détruire.
Au contraire, le milieu doit de préférence fournir des éléments nutritifs servant à maintenir vivant le sperme. Le sperme X , qui est relativement plus gros que le sperme Y , sem ble absorber sélectivement une plus grande quantité du milieu. Il est également évident que le milieu doit pré senter un pH approprié (c'est-à-dire un pH compris dans une gamme allant de 6,0 à 6,8) afin de lui permettre de servir de tampon, car un pH qui tomberait en dehors de la gamme physiologique de 6,0 à 6,8 tend à nuire à la fertilité du sperme ou à être toxique.
Une considération finale à propos du milieu est qu'il doit présenter de pré férence les propriétés d'un fluide de corps normal. C'est- à-dire que sa pression osmotique, ou osmolarité, doit être en général d'environ 300 mm de mercure de telle sorte que le sperme n'éclate pas et ne se trouve pas comprimé. Dans toute la description qui va suivre, les mesures du pH, de la densité et de la viscosité sont effectuées à 200 C.
Un milieu nutritif extrêmement satisfaisant peut être constitué par une combinaison de jaune d'#uf et de gly cine. Le jaune d'#uf présente des éléments nutritifs per méables au sperme qui sont absorbés et qui comprennent du glucose, du fructose et des acides aminés. Le jaune d'#uf présente également un pH (environ de 6,2 à 6,8), une viscosité et une densité appropriées, et c'est un corps normalement fluide, de sorte qu'il est approprié à être utilisé d'une façon générale comme milieu. Les valeurs particulières de densité, de viscosité, d'osmolarité et de pH voulues peuvent être obtenues en effectuant un réglage du jaune d'#uf et de glycine avant de l'utiliser.
La densité du jaune d'#uf en lui-même doit être aussi élevée que possible pour obtenir une sédimentation opti male. On a proposé d'ajouter de l'huile de. graine de coton à l'alimentation des poules et de choisir une race appropriée (par exemple des Leghorn) pour améliorer la densité du jaune d'aeuf.
Le lait frais de mammifère (en particulier le lait homogénéisé) et ses dérivés (par exemple la poudre de lait) peuvent remplacer le jaune d'#uf pour fournir des éléments nutritifs et augmenter la fertilité, mais la densité doit être réglée pour pouvoir l'utiliser d'une façon appropriée. D'autres éléments de remplacement pour le jaune d'#uf comprennent le jus de tomate, la crème de noix de coco provenant de noix de coco vertes, des flui- des du corps vivant et des extraits de ceux-ci ou des extraits de tissus (par exemple extraits de foie).
En variante, on peut utiliser de la dextrine en combinaison avec de la lécithine pour remplacer le jaune d'oeuf. La dextrine assure la densité, la viscosité et le pH et la lécithine sert d'élément nutritif. De plus, on peut utiliser du fructose, du glucose et d'autres monosaccharides pour former un milieu nutritif approprié.
De préférence, on utilise la glycine en solution aqueuse de 2 à 5 /o de glycine. Elle sert à régler le pH de la semence et à abaisser le point de congélation du milieu afin d'éviter un choc de température. Le rapport de la glycine au jaune d'oeuf dépend de la température, de la densité, de la viscosité et de l'osmolarité du mé lange de jaune d'oeuf. La solution de glycine présente une viscosité plus faible que celle du jaune d'aeuf, de sorte qu'une plus grande quantité de glycine est néces saire lorsque la viscosité doit être diminuée.
D'une façon générale, une seule partie de glycine à 4 % est nécessaire pour une à quatre parties de jaune d'oeuf.
Il est probable que la glycine est absorbée dans le sperme à partir du milieu et qu'elle tend à augmenter la vitesse de chute du sperme l'ayant absorbée. Du fait que les spermes X sont plus gros que les spermes Y , ils absorbent une plus grande quantité de glycine que ne le font les spermes Y . Par suite, la différence de den sité entre les spermes X et les spermes Y est accentuée par l'absorption de la glycine à un état légè rement hypotonique. C'est-à-dire qu'il y a une plus grande différence de densité entre les deux types de sperme lorsque leurs densités sont modifiées artificielle ment par l'absorption de glycine.
Comme autre variante, on peut remplacer la glycine par du glycérol dans le milieu nutritif. D'autres acides aminés, tels que le tryptophane, peuvent être utilisés avec des résultats satisfaisants.
Pour obtenir les meilleurs résultats, la densité du milieu nutritif varie suivant le type de mammifères ayant fourni le sperme. Pour les humains, ainsi que pour les lapins, la densité est en général comprise entre environ 1,01 à 1,19 g par cm3. Pour une gamme inférieure de densité, la plus grande partie du sperme tombe à travers le mélange de sorte que les fractions inférieures sont constituées par des mélanges de sperme X et de sper me Y . Cependant, les fractions supérieures ne contien nent qu'une faible quantité de sperme Y séparé. Aux limites supérieures de la gamme de densité, peu de sperme tombe à travers le milieu, de telle sorte que les fractions supérieures contiennent un mélange de sperme X et de sperme Y<B> .</B> Au-dessus de 1,19, seul le sperme X peut être séparé.
A une densité de 1,34, il ne se produit pas du tout de sédimentation et tout le sperme flotte sur le milieu. Afin de réaliser une séparation com plète entre le sperme X et le sperme Y<B> ,</B> une densité de milieu supérieure à environ 1,026 est en général nécessaire à la fois pour les taureaux et pour les humains. Cependant, ce chiffre varie avec la viscosité, la température et les autres conditions. Plus la densité du milieu se rapproche de la densité moyenne du sperme et meilleurs sont les résultats. D'autre part, il est évident que le milieu ne devrait pas présenter une densité telle qu'elle empêche la sédimentation.
Lorsque la densité du milieu se rapproche de celle du sperme le plus léger, la viscosité a relativement peu d'importance et elle peut être aussi faible que cela est réalisable en pratique, par exemple inférieure à 1,0 poise. Le tableau ci-dessous indique la gamme des densités et des viscosités pour divers types de mammifères, en indiquant la limite inférieure de densité et de viscosité pour obtenir une séparation satisfaisante, et la limite supérieure pour obtenir une sédimentation satisfaisante.
Toutes les mesures effectuées sur le tableau le sont à 20 C, la densité étant donnée en g/cml et la viscosité en poises.
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<I>Tableau</I>
<tb> Densité <SEP> Viscosité
<tb> Basse <SEP> Haute <SEP> Basse <SEP> Haute
<tb> Homme. <SEP> . <SEP> 1,022 <SEP> 1,09 <SEP> 0,02 <SEP> 1,2
<tb> Lapin <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,022 <SEP> 1,09 <SEP> 0,02 <SEP> 1,2
<tb> Taureau <SEP> . <SEP> 1,023 <SEP> 1,10 <SEP> 0,07 <SEP> 3,0
<tb> Porc <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,03 <SEP> 1,15 <SEP> 0,07 <SEP> 3,0 La viscosité du milieu est en rapport avec la densité. Pour les humains et les lapins, une densité de 1,02 g par cm" correspond à une viscosité d'environ<B>1,00</B> poise.
La densité supérieure de 1,09 correspond à environ 0,075 poise. La limite supérieure de la densité utilisable en pratique pour les humains et les lapins, 1,19 g par cm@j, correspond à environ 0,05 poise.
La pression osmotique du milieu doit habituellement varier entre une limite inférieure d'environ 270 et une limite supérieure d'environ 330 mm de mercure.
L'absorption du milieu dans le sperme, stade 13, s'effectue de préférence pendant une période d'une durée d'environ 15 minutes. Bien qu'il soit possible de com mencer à refroidir le mélange sans une période d'absorp tion de durée appréciable, il est en général avantageux de laisser l'absorption s'effectuer pendant une période de courte durée à la température ambiante. Le mélange de sperme et de milieu peut être maintenu à la tempé rature ambiante pendant une durée pouvant s'élever jusqu'à 3 heures pour permettre l'absorption. Il est pro bable qu'il se produit une absorption sélective de subs tances perméables, telles que la glycine, la glycérine, et le fructose à la température ambiante.
En augmentant la durée de la période d'absorption au-delà de 15 minutes, on modifie le taux de sédimentation. C'est-à-dire que le sperme X qui est plus gros absorbe une plus grande quantité de milieu et tombe à une plus grande vitesse que le sperme Y ou le sperme X qui n'ont pas absorbé autant du milieu dense.
Après que le milieu a été absorbé dans le sperme, on refroidit progressivement le mélange afin d'immobi liser le sperme. Avec un équipement de refroidissement classique, il est commode de permettre au refroidisse ment de s'effectuer pendant quatre heures pour obtenir une température inférieure à 1,0 C. Cependant, avec un équipement de refroidissement rapide, on peut réduire la durée de cette période à quelques minutes seulement. Par suite, une période d'une durée comprise entre 1 et 300 minutes peut être prévue pour permettre au mélange de se refroidir à une température inférieure à 1,0o C.
Après avoir atteint cette température, on peut maintenir le mélange jusqu'à une durée de 15 heures à la basse température.
Le temps nécessaire pour effectuer l'opération de sédimentation 16 veut varier considérablement.. Avec des milieux de densité relativement faible, les particules tombent d'une façon relativement rapide, de sorte qu'une durée de sédimentation plus courte suffit. Au contraire, des milieux denses et visqueux tendent à ralentir la chute des particules inertes, de sorte qu'une période de durée relativement longue est nécessaire pour la sédi- mentation. En général, il faut de 1 à 24 heures pour obtenir une sédimentation convenable.
En se reportant à la fig. 2, la durée de la sédimen tation doit être telle que les deux fractions soient à peu près complètement séparées comme on le voit au temps 12. Au temps 0, le sperme X (représenté par le signe T i ) et le sperme Y (représenté par le signe 0) sont tous les deux mélangés ensemble lorsque le mélange refroidi pénètre dans la colonne de sédimentation. Après quelques heures, par exemple 4 heures pour le mode de réalisation particulier représenté, le sperme X qui est plus dense a tendance à se séparer du sperme Y moins dense pendant la chute à travers la colonne de sédimentation.
Le sperme X et le sperme Y tom bent tous les deux, mais le sperme X tombe plus rapidement. Au temps 12, dans l'exemple représenté, il se produit une séparation à peu près complète du < < sperme X et du sperme Y<B> .</B> A ce point la sédi mentation doit être arrêtée et les fractions doivent être séparées. Si les fractions ne sont pas séparées au moment voulu, ils se mélangent en se rapprochant du fond de la colonne de sédimentation, comme on le voit au temps 30.
Si l'on utilise une période de durée insuffisante pour la sédimentation, la chute est lente au point qu'il ne se produit qu'une faible séparation entre les fractions de < .= sperme X et de sperme Y . Si l'opération de sédi mentation prend plus de 24 heures environ, le milieu lui-même tend à se séparer. C'est-à-dire que les ions minéraux et d'autres particules lourdes du milieu colloï dal se séparent après des périodes de longue durée. De plus, les particules du milieu précipitent du fluide si une përiode d'une durée supérieure à 24 heures est utilisée.
Pour obtenir une séparation plus complète des frac tions, sans séparation nuisible du milieu, il est préfé rable que l'opération de sédimentation dure de 9 à 18 heures environ, suivant les types d'animaux et le type de milieu. Pour les humains, une période d'environ 12 heures est optimale pour obtenir une sédimentation appropriée, lorsqu'on utilise comme milieu du jaune d'#uf.
Suivant le milieu utilisé, il faut une température com prise entre -5,0 C et environ 1,0 C. En dessous de cette gamme de températures, les caractéristiques physi ques du milieu sont modifiées dans une mesure telle qu'on n'obtient pas de sédimentation convenable. Pour des températures plus élevées, le sperme tend à nager ou à se déplacer de son propre mouvement à travers le milieu et ne se sépare pas comme des particules inertes tombant librement au cours de l'opération de sédimen tation. Par suite, la température préférée pour un milieu constitué par du jaune d'oeuf et de la glycine est de 0,0', C.
Pendant le processus, il faut avoir soin d'éviter toute vibration excessive. Des secousses violentes tendent à déchirer les queues des spermatozoïdes. De plus, pendant l'opération de sédimentation, même des vibrations légè res nuisent à la chute du sperme de sorte qu'il ne se comporte pas comme des particules inertes. Par ailleurs, une légère vibration tend à faciliter la sédimentation. Il faut prendre un soin particulier lorsqu'on extrait les frac tions d'éviter toute vibration et toute contamination des fractions voisines. Dans ce but, il est avantageux d'effec tuer la vidange goutte à goutte, avec environ une à deux secondes par goutte.
Après avoir évacué une fraction, le mélange restant doit pouvoir se décanter pendant une durée au moins aussi longue que la durée ayant été utilisée pour évacuer une fraction. Ainsi, si 45 secondes sont nécessaires pour extraire une fraction, une seconde période de 45 secondes doit avantageusement s'écouler avant d'extraire les fractions suivantes.
Un autre facteur dont il faut tenir compte est qu'il faut de préférence éviter la lumière visible. La lumière nuit à la fertilité du sperme et lui fait perdre son effi cacité pour percer l'enveloppe protectrice d'un neuf. La fertilité peut également être altérée par un pH extrême ment élevé ou extrêmement faible du milieu (tombant en dehors de la gamme de 6,0 à 6,8 pour la plupart des espèces) par l'âge du sperme et par le nombre de sper matozoïdes motiles.
Les fractions qui peuvent être séparées au cours de l'opération 17 contiennent des quantités variables de sperme X et de sperme Y . Comme représenté sur la fig. 3 qui indique d'une façon type les conditions qu'on obtient en réalité avec chacune des espèces de mammifères mentionnées ici, une séparation à peu près complète du sperme X et du sperme Y est possi ble et a été obtenue à l'aide d'une mise en #uvre du procédé de la présente invention (voir les exemples par ticuliers). Ainsi, sur la fig. 3 qui se rapporte au sperme humain, la fraction comprise entre 1 et 3 contient à peu près tout le sperme X .
La fraction comprise entre 14 et 23 contient à peu près tout le sperme Y . Une frac tion efficace pour mettre en #uvre la présente invention doit comprendre au moins 60 % soit du sperme X soit du sperme Y (suivant la sélection) afin de sur monter le rapport 50-50 qui existe dans la nature.
Pour des applications industrielles, au moins 75 0/0 du sperme doit avantageusement être du sexe voulu, si la dépense nécessaire pour mettre en #uvre le procédé ne doit pas être prohibitive.
De préférence, au moins 90 % du sperme doit être d'un seul type de façon à réduire le risque d'obtenir une descendance du sexe opposé à un taux statistique admis sible. Bien entendu, une séparation de 100 % est la plus avantageuse du fait qu'il n'y a aucun risque d'erreur.
Une séparation complète assure qu'en cas de conception la descendance sera du sexe voulu. Lorsqu'une sépara tion à peu près complète est réalisée, comme sur la fig. 3, chaque fraction est constituée essentiellement par des spermatozoïdes n'ayant que le chromosome voulu, dans un véhicule.
Un nouvel apareil, apte à mettre en #uvre le procédé décrit ci-dessus est représenté sur les fig. 4 à 6.
Comme on le voit sur la fig. 4, une colonne 21 est utilisée pour effectuer la sédimentation du mélange de sperme et de milieu. Un mécanisme d'alimentation approprié, indiqué en 22, sert à introduire le mélange de milieu et de sperme dans la colonne. La colonne 21 peut être constituée par un cylindre extérieur en verre 23 pourvu d'une fermeture ou bouchon 24 à son extrémité supérieure. L'extrémité inférieure du cylindre 23 peut être supportée par un double bouchon 26 qui sert égale ment de fermeture à une chambre collectrice 27 disposée à l'extrémité inférieure de la colonne.
A l'intérieur du cylindre 23 est disposée une cham bre de sédimentation ou burette 28 dans laquelle le mélange est introduit par le mécanisme d'alimentation 22. On a trouvé qu'une burette en verre d'une diamètre de 1,5 cm et d'une longueur de 15 cm est extrêmement satisfaisante. La burette est pourvue à son extrémité inférieure d'un robinet d'arrêt 29 permettant d'évacuer les fractions. Dans le mode de réalisation représenté, les fractions. sont vidées dans un bêcher 31. La chambre collectrice 27 sert d'enceinte protégeant l'appareil pen dant la vidange des fractions de la burette 28 dans le bêcher 31.
Afin d'éviter toute turbulence aux fractions après la sédimentation, la burette 28 est pourvue de parois 35 s'inclinant progressivement. Les burettes classiques pré sentent une courbure relativement brusque immédiate ment au-dessus du robinet d'arrêt. Une telle structure produit une turbulence et des contre-courants des frac tions de sédimentation, ce qui se traduit par une conta mination des fractions voisines et le mélange du ( < sperme X avec le K sperme Y .
La structure perfectionnée qui est représentée sur la fig. 4 comporte une burette 28 munie de parois 35 s'inclinant progressivement de façon à éviter tout mélange et toute contamination par tur bulence.
De préférence, comme on le voit sur la fig. 7, l'ou verture du robinet d'arrêt 29 et la base des. parois incli nées 35 ont d'une façon précise le même diamètre, de sorte qu'aucun obstacle ne se présente à l'écoulement dans le robinet d'arrêt. La pente des parois de base 35 de la burette, dans le mode de réalisation préféré, se poursuit à travers le robinet d'arrêt 29, de sorte que la diminution de diamètre est progressive. De cette façon, l'ouverture formée dans le robinet d'arrêt apparaît sous la forme d'un tronc de cône. L'ouverture supérieure du robinet d'arrêt 29 présente de préférence un diamètre qui est le double de celui de l'ouverture inférieure.
Le robinet d'arrêt 29 est pourvu d'une poignée allon gée 32 traversant une ouverture 33 formée dans l'en ceinte protectrice 27. On peut ainsi manoeuvrer le robinet d'arrêt pendant que le bêcher 31 se trouve à l'intérieur de la chambre 27. Après avoir collecté une fraction séparée dans le bêcher 31, on peut enlever celui-ci de l'enceinte par une ouverture appropriée 34 (fig. 4 et 6).
Pour maintenir le mélange en cours de sédimentation à la basse température nécessaire, une certaine quantité de glace 40 est disposée à l'intérieur du cylindre exté rieur 23 autour de la burette 28. Comme on le voit sur les fig. 4 et 5, cet agencement assure que le mélange de sperme et de milieu disposé à l'intérieur de la burette 28 est maintenu à la température voulue.
Pour faire fonctionner l'appareil, un mélange pré- refroidi de sperme frais et de milieu est placé dans le mécanisme 22, représente sous la forme d'une petite pipette, et il est transféré à la burette 28, qui est égale ment remplie de milieu. Le sperme, dont la densité est supérieure à celle du milieu qui l'entoure, tend à tomber ou à se sédimenter vers le bas en traversant le milieu.
Suivant la loi de Stokes, le sperme X qui est plus dense tombe à une vitesse plus élevée que le sperme Y qui est moins dense, ce qui se traduit par le fait qu'il se produit une séparation entre le K sperme X et le ( < sperme Y . De faibles fractions du milieu sont vidées de la burette 28 à travers le robinet 29 dans le bêcher 31. Chaque fraction est essayée pour déterminer le nombre de spermatozoïdes afin de trouver des frac tions qui contiennent le sperme X et celles qui con tiennent le ((sperme Y .
Comme variante de mode de réalisation, on peut placer sur la burette des moyens servant à mesurer la densité, tels qu'un certain nombre de petits hydromètres, afin de déterminer l'emplacement des différentes frac tions qui contiennent le<B> </B>sperme X et le (@ sperme Y à mesure qu'elles se déplacent à travers la colonne. Ce mode de réalisation évite la nécessité de prélever de petites fractions et d'essayer chacune d'elles.
En utilisant du lait ou un corps fluide comme milieu, on peut déterminer l'emplacement des couches sédimen- tées sans les vidanger en utilisant une lumière monochro matique ou une énergie rayonnante de diverses fréquen ces afin de mesurer l'opacité du mélange.
De cette façon, avec un milieu transparent ou translucide, tel que du lait, on peut placer sur un côté de la colonne une source de lumière et une cellule photoélectrique sur l'autre côté de la colonne (connectée à un amplificateur et à un enregistreur) afin de mesurer l'opacité du mélange et déterminer les points où sont disposées les couches séparées de sperme.
Les emplacements des couches séparées peuvent éga lement être déterminés en mesurant la conductivité en divers points dans la colonne. Dans ce but, des électrodes multiples sont disposées sur la colonne afin de détermi ner la variation de conductivité du contenu de la colonne en divers points sur sa longueur.
La conductivité des couches de sperme séparées est différente de celle du milieu de support, D'autres moyens pour déterminer l'emplacement des couches de sperme sédimentées comprennent des techni ques de microdensitométrie qui servent à mesurer la den sité en utilisant une lumière polarisée et des techniques d'examen au microscope qui mesurent la diffusion de la lumière polarisée.
Dans un autre mode de réalisation, on peut rempla cer la burette par un tube en gélatine. Lorsque la sépa ration du sperme X et du ( < sperme Y se produit, la température du tube et de son contenu est abaissée par paliers jusqu'à des températures bien inférieures à la congélation, par exemple une température de -20" C et le mélange séparé est congelé sur place. Le tube con gelé peut alors être découpé en fractions appropriées, à volonté. L'emmagasinage du sperme séparé est ainsi possible pendant des périodes de durée relativement longues.
Comme exemple général, servant à illustrer le fonc tionnement de l'appareil, on peut préparer un milieu avec quatre parties de jaune d'oeuf et une partie d'une solution de glycine à 4 % dans de l'eau. De la semence fraîchement collectée est mélangée avec ce milieu de telle sorte qu'on obtient une population de deux à trois cent millions de spermatozoïdes par millimètre et qu'on la laisse reposer à la température
ambiante pendant 15 minutes. La température du mélange est ensuite ame née à 00 C. Ce mélange est placé au sommet d'une colonne de milieu se trouvant dans une burette. Le milieu dans la colonne est également à une température de 00 C. Les spermatozoïdes peuvent alors se sédimenter pendant 12 heures, après quoi les fractions sont vidan gées. Le nombre de spermatozoïdes contenus par chaque fraction est compté et on trace une courbe du nombre en fonction des fractions.
<I>Exemple 1</I> On a collecté de la semence humaine fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu formé de quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de gly- cine à 4 %. La densité du milieu était de 1,0273, la viscosité était de 0,4326 poise et le pH de 6,09, toutes les mesures étant effectuées à 200 C.
Le mélange a été absorbé dans la semence pendant une durée de 15 mi nutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 30 C. Après 8 heures, la température du mélange a été réduite à 0 C. 12 heures plus tard, on a placé le mélange dans une colonne remplie du même milieu que celui décrit plus haut, maintenu à 0n C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0n C pendant 18 heures. Ensuite, on a fait écouler des fractions de 15 gouttes, chaque fraction demandant 45 secondes pour s'écouler avec une période d'attente de 45 secondes entre chaque période d'écoulement.
Un échantillon de chaque fraction a été prélevé dans une pipette et il a été dilué 200 fois avec une solution saline à 5 % dé formol. Les spermatozoïdes ont été comptés dans un hémacytomètre sous micros cope. Lorsqu'on a déterminé que les fractions de sperme étaient critiques par représentation graphique, on a essayé un second échantillon de la même fraction, et on a fait la moyenne des nombres de spermatozoïdes comptés les deux fois.
Les nombres de spermatozoïdes. obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la fig. 3. On notera sur la fig. 3 qu'on a obtenu deux pointes aux fractions 1 et 19. <I>Exemple 2</I> On a collecté de la semence humaine fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu cons titué par quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 % dans de l'eau. La densité du milieu
était de<B>1,0239</B> et le pH de 6,10, tous les deux mesurés à 20 C. Le mélange a été absorbé dans la semence pen dant une période d'une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 30 C. Après 10 heures, la température était réduite à 00 C, 13 heures plus tard, on a placé le mélange dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut, et on l'a maintenu à 0u C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0 C. Après sédimentation pendant 9 heures 1/2, on a fait écouler des fractions de 15 gouttes. Chaque fraction demandait 45 secondes pour s'écouler, avec une période d'attente de 45 secondes entre chaque période d'écoule ment.
Un échantillon de chaque fraction a été prélevé dans une pipette et on l'a dilué 200 fois avec une solu- tion saline à 5 % de formai. On a compté les sperma- tozoïdes dans un hémacytomètre sous microscope. Les nombres critiques de spermatozoïdes ont été mesurés deux fois et on en a fait la moyenne. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la fi-. 8.
On notera sur la fig. 8 qu'on a obtenu deux pointes pour les fractions 15 et 20. <I>Exemple 3</I> On a collecté de la semence de taureau de Hereford fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu constitué de quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 0/0. La densité à 200 C était de 1.0263. Le mélange a été absorbé dans la semence pen dant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 0 C pendant 7 heures et demie. Ensuite, le mélange a été placé dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut et il a été main tenu à 09 C.
Toute la colonne a été placée dans un réfri gérateur à -0,5,1 C pendant 11 heures et demie. On a suivi le même mode opératoire d'écoulement et de comptage des spermatozoïdes que ceux qui ont été décrits dans les exemples 1 et 2. Les nombres de sperma tozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la fig. 9. On notera sur la fig. 9 qu'on a obtenu deux pointes aux fractions 1 et 20.
<I>Exemple 4</I> On a collecté de la semence de taureau de Jersey fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec le même milieu que celui utilisé dans les exemples précé dents. La densité était de 1,0283, la viscosité de 0,430, et le pH de 6,1, toutes les mesures étant effectuées à 20 C. Le mélange a été absorbé dans la semence pen dant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur pendant 5 heures à une température de 0 C. Ensuite, on a placé le mélange dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut et on l'a maintenu à 00 C.
Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 01, C pendant 121/2 heures. Après sédimentation, on a suivi le même mode opératoire d'écoulement et de mesure que ceux décrits dans les exemples précédents. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de frac tion sur la fig. 10. On notera sur la fig. 10 qu'on a obtenu deux pointes pour les fractions 1 et 18.
Les exemples précédents concernant les taureaux illustrent la technique de séparation et on a déterminé qu'elle donnait plus de 60 % de descendance d'un seul sexe lorsqu'elle est inséminée artificiellement en utilisant des techniques classiques.
Bien que la sédimentation soit décrite ici comme un mode de réalisation particulier de la présente invention, on voit que la séparation du sperme Y plus petit et moins dense du sperme X plus gros et plus dense peut être effectuée par n'importe quel moyen approprié. Ainsi, en appliquant une force plus importante que la pesanteur (ou s'exerçant dans une direction différente), dans des conditions appropriées, on obtient une sépara tion suivant les dimensions et la forme des particules. On peut utiliser par exemple une centrifugeuse travaillant sans, vibrations pour appliquer une force supérieure à la pesanteur.
De plus, dans certains milieux, le sperme X et le sperme Y présentent des taux de flottation différents, à la différence des taux de sédimentation et peuvent être séparés de cette façon. En fait, en choisis sant un milieu d'une densité inférieure à la densité moyenne du sperme X et supérieure à la densité moyenne du sperme Y . on peut faire élever le sper me Y et on peut faire tomber le sperme X . En absorbant sélectivement des substances appropriées, on peut accroître la flottation positive, de la même façon que l'absorption sélective de glycine, par exemple, fait augmenter la flottation négative.
L'appareil permet la sédimentation de mélanges de spermes de sorte que le sperme X qui est plus dense tombe à une vitesse plus élevée que le sperme Y qui est moins dense et par suite s'en sépare. Le procédé permet d'obtenir une séparation à peu près complète des types de sperme en deux fractions.
Method for Obtaining Sperm Fractions The present invention relates to a method for separating sperm containing X chromosomes from spermatozoa containing Y chromosomes.
It has been determined that the sex of the offspring is controlled by the chromosomes of the cells of the particular matozoid spheres that fertilized the egg. That is, some of the sperm (hereinafter referred to as <B> sperm) </B> are genotypically known to contain X chromosomes or female chromosomes, while the rest contain Y chromosomes or male chromosomes. On microscopic examination, the sperm containing the X chromosome appear to be larger in size than the sperm containing the Y chromosome.
When a sperm containing the X chromosome (hereafter referred to as X sperm) combines with the egg (which contains X chromosomes) the result is female offspring. When a sperm containing the Y chromosome (hereinafter referred to as Y sperm) combines with the egg, male offspring results. The sperm population in ejaculation of a male mammal contains both X chromosome spermatoids and Y chromosome sperm. Until now, these sperm have not been satisfactorily separated. by component X and component Y.
It is evident, however, that the separation of two types of sperm would allow a choice or selection of the final sex of the progeny. Consequently, the present invention relates to a method for obtaining, from total sperm, sperm fractions predominantly enriched in spermatozoa comprising either the Y chromosome linked to the male sex or the X chromosome linked to the female sex, characterized by mixing fresh total semen with a viscous nutrient medium,
permeable to sperm and separates the mixture into at least one fraction in which the majority of sperma tozoids present have the same chromosome, either the Y chromosome or the X chromosome.
Other advantages of the present invention will emerge from the detailed description which follows, given with reference to the appended drawings which give, by way of indication, several embodiments of the method according to the invention.
In these drawings, Fig. 1 is a diagram showing an embodiment of the method according to the present invention; fig. 2 schematically shows the separation process at various points in time, FIG. 3 is a graph illustrating the separation of a typical sperm population into components having a chromosome of a different sex; fig. 4 is a view in section and in elevation of an apparatus intended for carrying out the method according to the present invention, FIG. 5 is a sectional view taken along line 5-5 of FIG. 4;
fig. 6 is a sectional view taken along lines 6-6 of FIG. 4; fig. 7 is a detail view on a larger scale of part of the apparatus shown in FIG. 4; figs. 8 through 10 are graphs showing specific examples of semen separation.
The present invention is based on the discovery that two mammalian sperm genotypes (X and Y) can be separated according to phenotypic characteristics by applying a force of flotation causing the best floating sperm in a medium to reach a different level. of that reached by the sperm which float less well. The force of flotation can be positive, which makes the body rise, or negative, which causes the body to fall in the middle.
As a particular example of a flotation force, gravity can be viewed as a negative flotation force used to separate sperm by sedimentation. It has been found that sedimentation at low temperatures in a medium of critically controlled characteristics results in the separation of sperm X from sperm Y.
When an inert particle falls through a medium, it follows Stokes' law with regard to its rate of sedimentation under the influence of the physical forces of liquid flotation, the viscosity of the liquid, the force of gravity. and the difference in density between the medium and the particles.
From Stokes' law, we found that
EMI0002.0009
where v = particle velocity (cm <B>; </B> sec- ') o = particle density (g / cm-3) o' = density of medium (g / cm-3) m = mass of particles (g) g = acceleration of gravity (981 cm sec-2) o @ = surface tension (g / cm) K = constant of the particles, depending on their geometric shape.
According to Stokes' law, the speed of falling particles varies depending on the size and shape of the particle as well as the difference in density between the medium and the particle. When the rate of fall of a class of particle follows Stokes' law, a Gaussian normal distribution of the flocculation is obtained, so that the various sedimentation fractions contain particles of equal density and volume.
It has been found that under carefully controlled conditions, semen sediment through a column of a medium can result in upper and lower fractions, in which the proportions of sperm X -> and Y >> are very different. . The typical pheno differences seen in semen relate to their gender genotypes.
¯ The fi-. 1 is a diagram showing an embodiment of the method according to the present invention. Fresh semen is usually first collected from the male, which semen contains equal amounts of X sperm and Y sperm. This semen is mixed with a nutrient medium during stage 12. The nutrient medium is absorbed into the semen during stage 13, after which the mixture is gradually cooled during stage 14. When cooled, the mixture is subjected to sedimentation during stage 16. The sediment fractions are then separated during stage 17 in order to isolate the sperm X or the sperm Y, at will.
The sperm which contains the desired chromosomes in combination with the nutrient mixture can then be artificially inseminated into the female of the type from which the sperm was obtained. Of course, you can also cross a horse with a donkey and with a zebra, just as you can cross a wolf with a dog.
The present invention is suitable for use with sperms from all mammals. Of particular interest among these are humans and other primates, cattle, pigs, sheep, rabbits, cats, goats, horses, donkeys and cattle. It was determined that there is a difference in density between X sperm and Y sperm, with X sperm being denser than Y sperm. In a wild boar, the difference in density between sperm X and sperm Y is approximately 18%.
In bulls and stallions the difference in density is about 10%, in human males,
sperm X is about 5% denser than sperm Y. In rabbits, the difference is approximately 3%.
The medium chosen to be used during stage 12 should advantageously have a density sufficiently close to that of the sperm so that the slight difference in density which exists between the sperm X and the sperm Y results in sedimentation in different fractions. In relation to the density, the viscosity should in general also be suitable in order to control the sedimentation. In addition, it is obvious that the environment must not alter the fertility rate of the sperm. That is to say, the medium must not be dangerous for the sperm and must not destroy it.
Rather, the medium should preferably provide nutrients to keep the sperm alive. The X sperm, which is relatively larger than the Y sperm, appears to selectively absorb more of the medium. It is also evident that the medium must have an appropriate pH (i.e. a pH within a range of 6.0 to 6.8) in order to allow it to act as a buffer, since a pH which falling outside the physiological range of 6.0 to 6.8 tends to impair sperm fertility or be toxic.
A final consideration about the medium is that it should preferably exhibit the properties of a normal body fluid. That is, its osmotic pressure, or osmolarity, should generally be about 300 mm of mercury so that the sperm does not burst and is not compressed. Throughout the description which follows, the measurements of pH, density and viscosity are carried out at 200 ° C.
An extremely satisfactory nutrient medium can consist of a combination of egg yolk and glycine. Egg yolk has nutrients permeable to semen which are absorbed and which include glucose, fructose and amino acids. Egg yolk also has a suitable pH (about 6.2-6.8), viscosity and density, and it is a normally fluid body, so it is suitable for use in generally as a medium. The particular density, viscosity, osmolarity and pH values desired can be obtained by adjusting the egg yolk and glycine before use.
The density of the egg yolk itself should be as high as possible to achieve optimum sedimentation. It has been proposed to add oil. cottonseed to the feed of the hens and choose an appropriate breed (eg Leghorn) to improve the density of the egg yolk.
Fresh mammalian milk (especially homogenized milk) and its derivatives (eg powdered milk) can replace egg yolk to provide nutrients and increase fertility, but the density must be adjusted to be able to 'use in an appropriate manner. Other substitutes for egg yolk include tomato juice, coconut cream from green coconuts, living body fluids and extracts thereof or extracts thereof. tissues (eg extracted from liver).
Alternatively, dextrin can be used in combination with lecithin to replace egg yolk. Dextrin provides density, viscosity and pH, and lecithin serves as a nutrient. In addition, fructose, glucose and other monosaccharides can be used to form a suitable nutrient medium.
Preferably, glycine is used in an aqueous solution of 2 to 5% of glycine. It is used to regulate the pH of the semen and to lower the freezing point of the medium in order to avoid a temperature shock. The ratio of glycine to egg yolk depends on the temperature, density, viscosity and osmolarity of the egg yolk mixture. Glycine solution has a lower viscosity than that of egg yolk, so more glycine is needed when the viscosity is to be lowered.
Generally, only one part of 4% glycine is needed for one to four parts of egg yolk.
It is likely that glycine is absorbed into the semen from the middle and tends to increase the rate of fall of the semen that has absorbed it. Because X sperms are larger than Y sperms, they absorb more glycine than do Y sperms. Consequently, the difference in density between X sperms and Y sperms is accentuated by the absorption of glycine in a slightly hypotonic state. That is, there is a greater difference in density between the two types of sperm when their densities are artificially altered by the absorption of glycine.
As another variant, the glycine can be replaced by glycerol in the nutrient medium. Other amino acids, such as tryptophan, can be used with satisfactory results.
For best results, the density of the nutrient medium will vary depending on the type of mammal that provided the sperm. For humans, as well as for rabbits, the density is generally between about 1.01 to 1.19 g per cm3. For a lower density range, most of the sperm falls through the mixture so that the lower fractions are made up of mixtures of X sperm and Y sperm. However, the upper fractions contain only a small amount of separated Y sperm. At the upper limits of the density range, little sperm falls through the middle, so the upper fractions contain a mixture of X sperm and Y sperm <B>. </B> Above 1.19 , only X sperm can be separated.
At a density of 1.34, no sedimentation occurs at all and all the sperm floats on the medium. In order to achieve complete separation between X sperm and Y sperm <B>, </B> a medium density greater than about 1.026 is generally required for both bulls and humans. However, this figure varies with viscosity, temperature and other conditions. The closer the density of the medium is to the average density of sperm, the better the results. On the other hand, it is obvious that the medium should not have a density such as to prevent sedimentation.
When the density of the medium approaches that of the lightest sperm, the viscosity is relatively unimportant and it can be as low as is practicable, for example less than 1.0 poise. The table below indicates the range of densities and viscosities for various types of mammals, indicating the lower limit of density and viscosity to obtain satisfactory separation, and the upper limit to obtain satisfactory sedimentation.
All the measurements carried out in the table are at 20 ° C., the density being given in g / cml and the viscosity in poises.
EMI0003.0033
<I> Table </I>
<tb> Density <SEP> Viscosity
<tb> Low <SEP> High <SEP> Low <SEP> High
<tb> Male. <SEP>. <SEP> 1.022 <SEP> 1.09 <SEP> 0.02 <SEP> 1.2
<tb> Rabbit <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.022 <SEP> 1.09 <SEP> 0.02 <SEP> 1.2
<tb> Taurus <SEP>. <SEP> 1.023 <SEP> 1.10 <SEP> 0.07 <SEP> 3.0
<tb> Pork <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.03 <SEP> 1.15 <SEP> 0.07 <SEP> 3.0 The viscosity of the medium is related to the density. For humans and rabbits, a density of 1.02 g per cm "corresponds to a viscosity of about <B> 1.00 </B> poise.
The higher density of 1.09 corresponds to approximately 0.075 poise. The upper limit of the practical density for humans and rabbits, 1.19 g per cm @ d, corresponds to about 0.05 poise.
The osmotic pressure of the medium should usually vary between a lower limit of about 270 and an upper limit of about 330 mm of mercury.
The absorption of the medium into the semen, stage 13, is preferably carried out over a period of about 15 minutes. Although it is possible to begin cooling the mixture without an appreciable period of absorption, it is generally advantageous to allow absorption to proceed for a short period at room temperature. The mixture of semen and medium can be kept at room temperature for up to 3 hours to allow absorption. Selective absorption of permeable substances, such as glycine, glycerin, and fructose is likely to occur at room temperature.
By increasing the duration of the absorption period beyond 15 minutes, the rate of sedimentation is altered. That is, the X sperm which is bigger absorbs a greater amount of medium and falls at a faster rate than the Y sperm or X sperm which did not absorb as much of the dense medium.
After the medium has been absorbed into the semen, the mixture is gradually cooled to immobilize the semen. With conventional cooling equipment, it is convenient to allow the cooling to take place for four hours to achieve a temperature below 1.0 C. However, with rapid cooling equipment, the duration of this period can be reduced. just a few minutes away. As a result, a period of between 1 and 300 minutes can be provided to allow the mixture to cool down to a temperature below 1.0o C.
After reaching this temperature, the mixture can be maintained for up to 15 hours at the low temperature.
The time required to perform the settling operation 16 will vary considerably. With relatively low density media, the particles fall relatively quickly, so that a shorter settling time suffices. In contrast, dense and viscous media tend to slow down the fall of inert particles, so that a relatively long period of time is required for sedimentation. Usually, it takes 1 to 24 hours to achieve adequate sedimentation.
Referring to fig. 2, the duration of the sedimentation should be such that the two fractions are almost completely separated as seen at time 12. At time 0, sperm X (represented by the sign T i) and sperm Y (represented with the sign 0) are both mixed together when the cooled mixture enters the settling column. After a few hours, for example 4 hours for the particular embodiment shown, the sperm X which is more dense tends to separate from the less dense sperm Y during the fall through the sedimentation column.
Both X sperm and Y sperm fall, but X sperm fall faster. At time 12, in the example shown, there is approximately complete separation of <<sperm X and sperm Y <B>. </B> At this point sedimentation should be stopped and the fractions should be separated. If the fractions are not separated at the desired time, they mix together as they approach the bottom of the settling column, as seen at time 30.
If an insufficient period of time is used for sedimentation, the fall is so slow that only a small separation occurs between the <. = Sperm X and sperm Y fractions. If the sedimentation operation takes more than about 24 hours, the medium itself tends to separate. That is, the mineral ions and other heavy particles of the colloidal medium separate after long periods of time. In addition, the particles in the medium precipitate out of the fluid if a period longer than 24 hours is used.
In order to obtain a more complete separation of the fractions, without harmful separation of the medium, it is preferable that the sedimentation operation lasts from about 9 to 18 hours, depending on the types of animals and the type of medium. For humans, a period of about 12 hours is optimal for obtaining proper sedimentation, when egg yolk is used as the medium.
Depending on the medium used, a temperature should be between -5.0 C and about 1.0 C. Below this temperature range, the physical characteristics of the medium are modified to such an extent that one does not obtain no suitable sedimentation. At higher temperatures, the semen tends to swim or move on its own through the medium and does not separate as inert particles falling freely during the sedimentation process. Therefore, the preferred temperature for a medium consisting of egg yolk and glycine is 0.0 ° C.
During the process, care should be taken to avoid excessive vibration. Violent shaking tends to tear the tails of the sperm. In addition, during the sedimentation operation, even slight vibrations interfere with the fall of the sperm so that it does not behave like inert particles. Moreover, a slight vibration tends to facilitate sedimentation. Special care must be taken when extracting fractions to avoid vibration and contamination of neighboring fractions. For this purpose, it is advantageous to perform the drip draining, with approximately one to two seconds per drop.
After discharging a fraction, the remaining mixture should be able to settle for a time at least as long as the time that was used to discharge a fraction. Thus, if 45 seconds are necessary to extract a fraction, a second period of 45 seconds should advantageously elapse before extracting the following fractions.
Another factor to consider is that visible light should preferably be avoided. Light harms the fertility of the sperm and makes it lose its effectiveness in piercing the protective envelope of a new one. Fertility can also be impaired by extremely high or extremely low pH of the medium (falling outside the range of 6.0 to 6.8 for most species) by the age of the sperm and by the number of spers. motile matozoids.
The fractions which can be separated during operation 17 contain varying amounts of sperm X and sperm Y. As shown in fig. 3 which specifies in a typical way the conditions which are actually obtained with each of the species of mammals mentioned here, an almost complete separation of sperm X and sperm Y is possible and has been obtained with the aid of an implementation of the process of the present invention (see the specific examples). Thus, in FIG. 3 which relates to human sperm, the fraction between 1 and 3 contains almost all of the X sperm.
The fraction between 14 and 23 contains almost all of the Y sperm. An effective fraction for practicing the present invention should include at least 60% of either X sperm or Y sperm (depending on selection) in order to over-ride the 50-50 ratio that exists in nature.
For industrial applications, at least 75% of the sperm should advantageously be of the desired sex, if the expense necessary to carry out the process should not be prohibitive.
Preferably at least 90% of the sperm should be of a single type so as to reduce the risk of obtaining offspring of the opposite sex at a statistically acceptable level. Of course, a 100% separation is the most advantageous because there is no risk of error.
Complete separation ensures that in the event of conception the offspring will be of the intended sex. When an almost complete separation is achieved, as in fig. 3, each fraction consists essentially of sperm having only the desired chromosome, in a vehicle.
A new apparatus, able to implement the method described above is shown in FIGS. 4 to 6.
As seen in fig. 4, a column 21 is used to effect the sedimentation of the mixture of sperm and medium. A suitable feed mechanism, indicated at 22, serves to introduce the mixture of medium and sperm into the column. Column 21 may be constituted by an outer glass cylinder 23 provided with a closure or stopper 24 at its upper end. The lower end of the cylinder 23 can be supported by a double plug 26 which also serves as a closure for a collecting chamber 27 arranged at the lower end of the column.
Inside the cylinder 23 is arranged a sedimentation chamber or burette 28 into which the mixture is introduced by the feed mechanism 22. It has been found that a glass burette with a diameter of 1.5 cm and with a length of 15 cm is extremely satisfactory. The burette is provided at its lower end with a stopcock 29 for discharging the fractions. In the embodiment shown, the fractions. are emptied into a beaker 31. The collecting chamber 27 serves as an enclosure protecting the apparatus during the emptying of the fractions from the burette 28 into the beaker 31.
In order to avoid any turbulence to the fractions after sedimentation, the burette 28 is provided with walls 35 which gradually incline. Conventional burettes exhibit a relatively sharp curvature immediately above the stopcock. Such a structure produces turbulence and counter-currents of the sedimentation fractions, which results in contamination of neighboring fractions and the mixing of (<sperm X with the K sperm Y.
The improved structure which is shown in FIG. 4 comprises a burette 28 provided with walls 35 inclining progressively so as to avoid any mixing and any contamination by turbulence.
Preferably, as can be seen in FIG. 7, the opening of the stopcock 29 and the base of. inclined walls 35 have precisely the same diameter, so that no obstacle is present to the flow in the stopcock. The slope of the base walls 35 of the burette, in the preferred embodiment, continues through the stopcock 29, so that the decrease in diameter is gradual. In this way, the opening formed in the stopcock appears in the form of a truncated cone. The upper opening of the stopcock 29 preferably has a diameter which is twice that of the lower opening.
The shut-off valve 29 is provided with an extended handle 32 passing through an opening 33 formed in the protective enclosure 27. The shut-off valve can thus be operated while the beaker 31 is inside the chamber. chamber 27. After collecting a separate fraction in beaker 31, the latter can be removed from the chamber through a suitable opening 34 (Figs. 4 and 6).
To maintain the mixture during sedimentation at the necessary low temperature, a certain quantity of ice 40 is placed inside the outer cylinder 23 around the burette 28. As seen in FIGS. 4 and 5, this arrangement ensures that the mixture of sperm and medium disposed inside the burette 28 is maintained at the desired temperature.
To operate the apparatus, a pre- cooled mixture of fresh semen and medium is placed in mechanism 22, represented in the form of a small pipette, and it is transferred to burette 28, which is also filled with middle. The sperm, which has a density greater than that of the surrounding medium, tends to fall or settle downwards as it passes through the medium.
According to Stokes' law, the sperm X which is more dense falls at a faster rate than the sperm Y which is less dense, which results in the fact that a separation occurs between the K sperm X and the ( <sperm Y. Small fractions of the medium are emptied from burette 28 through stopcock 29 into beaker 31. Each fraction is tested to determine the number of sperm in order to find fractions which contain sperm X and those which do. hold the ((sperm Y.
As an alternative embodiment, means for measuring density, such as a number of small hydrometers, can be placed on the burette to determine the location of the different fractions which contain the <B> </ B > sperm X and the (@ sperm Y as they move through the column. This embodiment avoids the need to take small fractions and try each of them.
Using milk or a fluid body as the medium, the location of the sedimented layers can be determined without emptying them by using monochromatic light or radiant energy of various frequencies to measure the opacity of the mixture.
In this way, with a transparent or translucent medium, such as milk, one can place on one side of the column a light source and a photocell on the other side of the column (connected to an amplifier and a recorder ) in order to measure the opacity of the mixture and to determine the points where the separated layers of semen are placed.
The locations of the separated layers can also be determined by measuring the conductivity at various points in the column. For this purpose, multiple electrodes are arranged on the column to determine the change in conductivity of the contents of the column at various points along its length.
The conductivity of the separated semen layers is different from that of the supporting medium. Other means of determining the location of the sedimented semen layers include microdensitometry techniques which are used to measure density using polarized light and microdensitometry. microscopic examination techniques that measure the scattering of polarized light.
In another embodiment, the burette can be replaced by a gelatin tube. When the separation of sperm X and (<sperm Y occurs, the temperature of the tube and its contents is lowered in stages to temperatures well below freezing, for example a temperature of -20 "C and The separate mixture is frozen in place. The frozen tube can then be cut into suitable fractions as desired. Storage of the separated semen is thus possible for relatively long periods of time.
As a general example, to illustrate the operation of the apparatus, a medium can be prepared with four parts of egg yolk and one part of a 4% solution of glycine in water. Freshly collected semen is mixed with this medium so that a population of two to three hundred million sperm per millimeter is obtained and left to stand at room temperature.
room temperature for 15 minutes. The temperature of the mixture is then brought to 00 ° C. This mixture is placed at the top of a column of medium located in a burette. The medium in the column is also at a temperature of 00 C. The sperm can then settle for 12 hours, after which the fractions are drained. The number of sperm contained by each fraction is counted and a plot of the number versus the fractions is plotted.
<I> Example 1 </I> Fresh human semen obtained by ratio was collected and mixed with a medium formed from four parts of egg yolk and one part of 4% glycine. The density of the medium was 1.0273, the viscosity was 0.4326 poise, and the pH was 6.09 with all measurements taken at 200 C.
The mixture was absorbed in the seed for 15 minutes and placed in a refrigerator at 30 C. After 8 hours, the temperature of the mixture was reduced to 0 C. 12 hours later, the mixture was cooled. placed the mixture in a column filled with the same medium as that described above, maintained at 0n C. The entire column was placed in a refrigerator at 0n C for 18 hours. Then 15 drop fractions were run off, each fraction taking 45 seconds to elapse with a 45 second waiting period between each flow period.
A sample of each fraction was taken in a pipette and it was diluted 200 times with 5% saline solution of formalin. The sperm were counted in a hemacytometer under a microscope. When it was determined that the sperm fractions were critical by graphing, a second sample of the same fraction was tried, and the sperm numbers counted both times were averaged.
The sperm counts. obtained were plotted against the fraction numbers in FIG. 3. It will be noted in fig. 3 that two points were obtained in fractions 1 and 19. <I> Example 2 </I> Fresh human semen obtained by ratios was collected and mixed with a medium consisting of four parts of egg yolk and a part of 4% wisteria in water. The density of the medium
was <B> 1.0239 </B> and the pH was 6.10, both measured at 20 C. The mixture was absorbed into the semen for a period of 15 minutes and removed. 'was placed in a refrigerator at 30 C. After 10 hours the temperature was reduced to 00 C, 13 hours later the mixture was placed in a column containing the same medium as described above, and was maintained at 0 ° C. The entire column was placed in a refrigerator at 0 ° C. After sedimentation for 9 1/2 hours, fractions of 15 drops were run off. Each fraction took 45 seconds to elapse, with a waiting period of 45 seconds between each period of elapse.
A sample of each fraction was taken in a pipette and diluted 200 times with 5% saline solution. Spermatozoa were counted in a hemacytometer under a microscope. Critical sperm counts were measured twice and averaged. The sperm numbers obtained were plotted against the fraction numbers on the fi. 8.
It will be noted in FIG. 8 that two points were obtained for fractions 15 and 20. <I> Example 3 </I> Fresh Hereford bull semen obtained by ratio was collected and mixed with a medium consisting of four parts of egg yolk and one part of 4% glycine. The specific gravity at 200 ° C was 1.0263. The mixture was absorbed into the seed over a period of 15 minutes and placed in a 0 C refrigerator for 7.5 hours. Then the mixture was placed in a column containing the same medium as that described above and it was hand held at 09 ° C.
The entire column was placed in a refrigerator at -0.5.1 C for 11½ hours. The same procedure for the flow and counting of the spermatozoa was followed as those which were described in Examples 1 and 2. The numbers of sperma tozoids obtained were plotted against the numbers of fractions in FIG. 9. It will be noted in FIG. 9 that we obtained two points in fractions 1 and 20.
<I> Example 4 </I> Fresh Jersey bull semen obtained by reporting was collected and mixed with the same medium as used in the previous examples. The specific gravity was 1.0283, the viscosity 0.430, and the pH 6.1, all measurements being made at 20 C. The mixture was absorbed into the seed for 15 minutes and was taken up. placed in a refrigerator for 5 hours at a temperature of 0 C. Then, the mixture was placed in a column containing the same medium as described above and kept at 00 C.
The whole column was placed in a refrigerator at 01 ° C for 121/2 hours. After sedimentation, the same flow and measurement procedure was followed as those described in the previous examples. The sperm numbers obtained were plotted against the fraction numbers in FIG. 10. It will be noted in FIG. 10 that two points were obtained for fractions 1 and 18.
The foregoing bull examples illustrate the separation technique and it has been determined to give more than 60% single sex offspring when artificially inseminated using conventional techniques.
Although sedimentation is described herein as a particular embodiment of the present invention, it is seen that the separation of the smaller and less dense Y sperm from the larger and more dense X sperm can be accomplished by any suitable means. Thus, by applying a force greater than gravity (or acting in a different direction), under suitable conditions, a separation according to the size and shape of the particles is obtained. For example, a centrifuge working without vibrations can be used to apply a force greater than gravity.
Also, in some media, X sperm and Y sperm have different flotation rates unlike sedimentation rates and can be separated in this way. In fact, by choosing a medium with a density lower than the average density of sperm X and higher than the average density of sperm Y. we can grow sperm Y and we can drop sperm X. By selectively absorbing appropriate substances, positive flotation can be increased, in the same way that selective uptake of glycine, for example, increases negative flotation.
The apparatus allows the sedimentation of mixed sperms so that the sperm X which is more dense falls at a higher speed than the sperm Y which is less dense and consequently separates therefrom. The process achieves an almost complete separation of the types of sperm into two fractions.