Verfahren zur Durchführung von mikrobiologischen oder mikrochemischen Testungen durch Beeinflussung eines Nährbodens mit verschiedenartigen Wirkstoffen und Wirkstoffträger zur Durchführung des Verfahrens Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durch- führung von mikrobiologischen
oder mikrochemischen Testungen und einen Wirkstoffträger zur Durchführung dieses Verfahrens.
Derartige Untersuchungen hat man bisher entweder mit dem Röhrchenverdünnungsverfahren oder mit dem Diffusionsverfahren, insbesondere dem sogenannten Blättchentest, durchgeführt. Bei dem letztgenannten Ver fahren wird ein beispielsweise in eine Petrischale ein gebrachter Nährboden mit den zu untersuchenden Bak terien beimpft. Auf den beimpften Nährboden wird dann eine Anzahl von mit verschiedenen Wirkstoffen verse- henen Blättchen aufgelegt. Solche Wirkstoffe können beispielsweise Antibiotika sein.
In diesem Fall können Blättchen vorgesehen werden, welche mit Penicylhn, Streptomycin, Tetracyclin, Erythromycin oder beispiels weise auch mit Sulfonamiden imprägniert worden sind. Diese imprägnierten Testblättchen werden auf die be impfte Kultur aufgelegt. Die Wirksamkeit des aufge brachten Wirkstoffes auf das Wachstum der Bakterien wird dann durch Beobachtung des sich bildenden so genannten Hemmhofes ermittelt.
Sowohl aus der Tat sache der Ausbildung eines solchen Hemmhofes als auch seiner Grösse kann man die Wirksamkeit der ver wendeten Wirkstoffe feststellen und danach beispiels weise die Behandlung eines Patienten einrichten.
Anhand der Fig. 1 der Zeichnung, in der der Blätt- chentest im Prinzip nochmals dargestellt ist, sollen die Nachteile dieses Verfahrens erläutert werden. Mit 1 ist in Fig. 1 eine Petrischale bezeichnet in welche eine Nährflüssigkeit 3 eingegossen worden ist.
Diese Nähr- flüssigkeit besitzt eine solche Zusammensetzung, dass sie nach ihrem Einbringen zu einer gallertartigen Mas se erstarrt. Diese Masse ist mit 3 bezeichnet. Die Ober fläche dieses Nährbodens 3 wird nun mit einer Kultur von Bakterien beimpft und anschliessend wird das Gan ze in den Brutschrank eingebracht, damit sich die Bak- terien vermehren können. Zuvor werden jedoch auf den so vorbereiteten Nährboden verschiedene Testblätter 4 aufgelegt, die mit Wirkstoffen, z.
B. Antibiotica, im- prägniert worden sind. Wenn man beispielsweise sechs verschiedene Antibiotica hinsichtlich ihrer Wirkung auf die zu untersuchenden Bakterien untersuchen möchte, so muss man sechs Testblättchen verwenden und jedes dieser Testblättchen mit einem anderen Antibioticum imprägnieren.
Diese so vorbereiteten Testblättchen werden nun gleichmässig verteilt auf die Oberfläche des beimpften Nährbodens 3 aufgelegt, bevor die Petrischa- le in den Brutschrank eingebracht wird.
Entsprechend der Wirksamkeit der Antibiotica bil den sich um die Testblättchen 4 sogenannte Hemmhöfe 5 aus, deren Durchmesser ein Mass für die Wirksam keit des betreffenden Antibioticums auf die zu untersu chenden Bakterien darstellt. Man erkennt jedoch be reits aus Fig. 1, dass man von dem Durchmesser des Hemmhofes 5 zunächst den Durchmesser 6 der Test blätter 4 abziehen muss, um zu vergleichbaren Ergeb nissen mit anderen Untersuchungen gelangen zu kön nen.
Die Anordnung nach Fig. 1 zeigt aber auch wei terhin, dass der Blättchentest zeitraubend und um- ständlich ist. Um die Äusbildung von sauberen Hemm höfen zu erzielen, ist es notwendig,
dass die Blättchen 4 möglichst gleichmässig auf die Nährbodenoberfläche aufgesetzt werden. Hat ein Blättchen z. B. nur mit 90 % seiner Fläche Kontakt mit dem Nährboden so erfolgt eine mangelhafte Diffusion des Wirkstoffes aus diesem Blättchen in
den Nährboden, was wiederum zu einem mangelhaft ausgebildeten Hemmhof und somit zu ei nem falschen Testergebnis führt. Ein weiterer Nachteil des Blättchentests besteht darin, dass die Imprägnierung der einzelnen Blättchen 4 nicht absolut exakt dosierbar ist, ein Nachteil für die angestrebte Standardisierung. Es dürfte einleuchtend sein, dass die Wirksamkeit eines auf ein solches Blättchen aufgebrachten Wirkstoffes nicht nur von der Art des Wirkstoffes, sondern auch von der verwendeten Menge abhängt.
Bei der Impräg nierung der Blättchen 4 ist es aber ausserordentlich schwierig, die aufgebrachte Menge des Wirkstoffes exakt zu dosieren. Aus diesem Grunde stösst man in dem Bestreben, die einerseits von diversen Stellen selbst hergestellten und andererseits industriell gefertigten Testblättchen zu standardisieren, auf ganz erhebliche Schwierigkeiten.
Zur Beseitigung der Nachteile des be kannten als Blättchentest bezeichneten Verfahrens wird ein Verfahren zur Durchführung von mikrobiologischen oder mikrochemischen Testungen durch Beeinflussung eines Nährbodens mit verschiedenartigen Wirkstoffen vorgeschlagen,
bei dem gemäss der Erfindung die Wirk stoffe auf die Spitzen von stabförmigen Trägern aufge bracht und diese Träger in den Nährboden eingesteckt werden. Bei dem erfindungsgemässen Testverfahren wird al so der Wirkstoff nicht auf die Oberfläche der geimpf ten Kultur aufgebracht, sondern er gelangt in das Inne re des Nährbodens genau an der Einstechstelle. Da der Wirkstoff vorzugsweise punktförmig begrenzt aufgetra gen wird,
erfolgt daher von einem punktförmigen Zen trum aus strahlenförmig in allen Richtungen eine Diffu sion in das Innere des Nährbodens.
Ein wesentlicher Vorteil dieses neuen im Vergleich zu allen bisher benutzten Diffusionsverfahren besteht darin, dass derselbe Testeffekt bereits mit 50- bis 100- fach kleineren Wirkstoffdosen erreichbar ist; mit Wirk stoffdosen also, die denen des quantitativen, bisher al lein wissenschaftlich exakten, oder erwähnten Röhr chenverdünnungsverfahrens, entsprechen.
Das erfin dungsgemässe Verfahren ist somit das erste Testverfah ren auf der Diffusionsbasis, das eine exakt halbquanti tative bzw. quantitative Aussage ermöglicht, die bisher nur mit dem Röhrchenverdünnungsprinzip zu erreichen war.
Bei dem vorgeschlagenen Verfahren ist auch die Beschickung der Wirkstoffträger mit den erforderlichen, d. h. optimalen Wirkstoffmengen mit grösster Präzision und Reproduzierbarkeit gewährleistet; darüber hinaus lassen sich Art des Nährbodens, Agarschichtdicke, Dif fusionszeit u. a. m. nominieren und die Testmethodik standardisieren.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Ver fahrens besteht darin, dass das anhand der Fig. 1 er läuterte Mass 6 wegfällt, weil von einem punktförmi- gen Zentrum ausgegangen wird, in das der Wirkstoff eingebracht wird.
Man kann daher mit kleineren Ab messungen der Impfkultur arbeiten; ausserdem ist das erfindungsgemässe Verfahren einfacher zu handhaben, weil der stabförmige Wirkstoffträger leichter und mit grösserer Genauigkeit an die gewünschte Stelle des Nährbodens, nämlich durch Eiristecken@ gebracht wer den kann.
Die Spitze des stabförmigen Wirkstoffträgers wird nun erfindungsgemäss mit dem Wirkstoff versehen. Es empfiehlt sich in diesem Fall, den Wirkstoff im Punkt-Druckverfahren auf den Träger aufzubringen. Insbesondere bei Anwendung dieses Verfahrens kann der Wirkstoff in einer genau dosierbaren Menge auf den Wirkstoffträger aufgebracht werden.
Der Wirkstoff kann auch mit Hilfe eines Stempels auf einen begrenzt saugfähigen oder nicht saugfähi- gen Träger aufgebracht werden. Wesentlich erscheint es, dass der Wirkstoffpunkt so auf das freie Ende des Wirkstoffträgers gedruckt wird, dass er nach dem er- folgten Einstecken des Wirkstoffträgers in den Nährbo den mitten in diesem (in der Mitte zwischen oberer und unterer Agarschichtbegrenzung) verbleibt,
so dass der Wirkstoff optimal in den ihn allseits umschliessenden Nährboden diffundieren kann.
Der Wirkstoffträger soll zweckmässig eine solche hänge besitzen, dass er mit einer Pinzette, gegebenen- falls sogar mit den Fingern, gefasst werden kann und dass nach dem Einstecken das freie Ende ausserhalb des Nährbodens verbleibt. Dieses freie Ende des Wirk stoffträgers wird zweckmässig mit einer Markierung ver sehen, welche die Art des aufgedruckten Wirkstoffes anzeigt. Diese Markierung ist dann bei der fertig ent wickelten Kultur zu erkennen und man übersieht sofort, welcher Wirkstoff den gewünschten Hemmhof erge ben hat.
Der Wirkstoffträger selbst kann eine beliebige Form haben, die es ermöglicht, ihn an seine genau vorbezeich- nete Stelle möglichst punktförmig in den Nährboden hineinzustecken.
Am zweckmässigsten wird ein Wirk- stoffträger zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet, der die Form eines flachen Spiesses einer Nadel oder einer Kapillare besitzt: In den beiden erstgenannten Fällen wird der Wirkstoff zweckmässig in der oben bereits beschriebenen Weise durch Aufdrucken oder Aufstempeln auf die untere Spitze aufgebracht.
Im Falle der Verwendung einer Ka pillare kann der Wirkstoff in die Kapillaröffnung einge bracht werden.
Die Wirkstoffträger können zweckmässig in einem Verband hergestellt werden, so dass der Benutzer aus diesem Verband sich einzelne solcher Wirkstoffträger je nach Bedarf abtrennen kann. Dieser Verband besitzt zweckmässig eine kammartige Ausbildung derart, dass die freien Enden der Wirkstoffträger mit einander ver bunden sind.
Die mit dem Wirkstoff zu imprägnieren den Enden der Wirkstoffträger sind zweckmässigerwei- se leicht zugespitzt, um ein Einstecken in den Nährbo den leichter zu gestalten.
Man kann nun diese Wirkstoffträger auch bereits vorbereitet in den Handel bringen, beispielsweise der art, dass eine solche kammartige Gruppe von Wirkstoff trägern mit demselben Wirkstoff imprägniert sind. Man kann aber auch die einzelnen Träger eines solchen Ver bandes mit verschiedenen Wirkstoffen imprägnieren, so dass für die Durchführung eines Tests eine derart kom binierte Gruppe verwendet wird. Die Zähne des kamm- artigen Verbandes können also in der jeweils gewünsch ten Form vorbereitet werden.
Eine weitere Ausführungsmöglichkeit für einen sol chen kammartigen Verband besteht ferner in einer zwei seitigen Ausbildung, derart, dass der Kamm zweiseitige Zähne besitzt, welche die einzelnen Wirkstoffträger dar stellen.
Ein solcher Verband, dessen Zähne mit ver schiedenen Wirkstoffen beschickt sind, wird vor Ge brauch in der Mittellinie 13 (Fig. 5) derart abgeknickt, dass alle Zähne mit gleichem Abstand zueinander ge meinsam in den Nährboden eingesteckt werden können; das Testen wird somit weiter vereinfacht.
Es sei ab- schliessend erwähnt, dass ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens darin gesehen wird dass (z.
B. im Falle Bakterientestung) von industrieller Sei te her ausser den fertig punktbedruckten Wirkstoffträ- gern spezialnährboden-gefüllte Plastikampullen sowie kleine Schalen zur Aufnahme des Nährbodens für die Bebrütung zur Verfügung gestellt werden könnten.
Statt der bisher (bei Petrischalen) erforderlichen Nährbodenmenge von 15 bis 20 m1 in einer Schicht dicke von etwa 5 mm würden in diesem Fall nur 2 bis 3 m1 in einer Schichtdicke von 1 bis 1,5 mm benötigt; das Testresultat läge dann bereits nach vier- bis sechs stündiger Bebrütung vor.
Ausführungsmöglichkeiten für das erfindungsgemäs- se Verfahren sind in der Zeichnung erläutert.
In Fig. 2 ist zunächst das Prinzip des erfindungs- gemässen Verfahrens im Gegensatz zu dem anhand der Fig. 1 erläuterten Blättchentest dargestellt. Die glei chen Bezugszeichen stellen die gleichen Anordnungen dar wie bei der Anordnung nach Fig. 1. Der Unter schied gegenüber dem Blättchentest besteht in der Ver wendung der stabförmigen, unten zugespitzten Wirk stoffträger 7, die in den Nährboden 3 eingesteckt wer den.
In Fig. 3 ist ein stabförmiger Wirkstoffträger in stark vergrössertem Masstab dargestellt, während in den Fig. 4 und 5 Ausführungsformen für die kammartige Ausbildung von Trägergruppen wiedergegeben sind.
In Fig. 3 ist die in den Nährboden einzusteckende Spitze des Wirkstoffträgers mit 9, das breitere hintere Ende mit 10 bezeichnet. Auf die vordere Spitze 9 ist der Wirkstoff punktförmig aufgebracht, z. B. aufge druckt. Dieser Wirkstoffpunkt ist mit 14 bezeichnet.
Gemäss Fig. 4 sind fünf solche Wirkstoffträger an einander befestigt. Diese Wirkstoffträger können bei spielsweise im Stanzvorgang hergestellt werden. Die obe ren Enden sind aneinander befestigt. Entweder wird die ser kombinierte Verband als Ganzes in den Nährboden eingesteckt oder die einzelnen Zähne werden abge trennt und gesondert eingesteckt. Aus Fig. 4 ist auch zu erkennen, dass auf die oberen Enden verschiedene Markierungen, dargestellt durch die Buchstaben A, B, C, D und E aufgebracht sind.
Mit 14 sind wiederum die punktförmigen Wirkstoffe angedeutet.
Bei der Ausführungsform nach Fig. 5 sind die Wirk stoffträger zweiseitig in einer kammartigen Gruppe an gebracht. Diese Gruppe kann entlang der gestrichelt gezeichneten Linie 13 geknickt werden, um die Wirk stoffträger-Kombination gemeinsam in den Nährboden einstecken zu können. In diesem Fall müssen die ein- zelnen Wirkstoffträger allerdings mit verschiedenen Wirkstoffen versehen werden.
Method for carrying out microbiological or microchemical tests by influencing a nutrient medium with various types of active ingredients and active ingredient carriers for carrying out the method. The invention relates to a method for carrying out microbiological tests
or microchemical tests and an active ingredient carrier to carry out this process.
Investigations of this kind have hitherto been carried out either with the tube dilution method or with the diffusion method, in particular the so-called leaflet test. In the latter process, a nutrient medium, for example in a Petri dish, is inoculated with the bacteria to be examined. A number of leaflets provided with different active ingredients are then placed on the inoculated nutrient medium. Such active ingredients can be antibiotics, for example.
In this case, leaflets can be provided which have been impregnated with penicylhn, streptomycin, tetracycline, erythromycin or, for example, also with sulfonamides. These impregnated test discs are placed on the inoculated culture. The effectiveness of the active ingredient applied to the growth of the bacteria is then determined by observing the so-called inhibition zone that forms.
Both from the fact of the formation of such an inhibition zone and its size, one can determine the effectiveness of the active ingredients used and then, for example, set up the treatment of a patient.
The disadvantages of this method are to be explained with reference to FIG. 1 of the drawing, in which the leaflet test is shown again in principle. 1 with a Petri dish is designated in FIG. 1, into which a nutrient liquid 3 has been poured.
This nutrient fluid has such a composition that it solidifies to a gelatinous mass after it is introduced. This mass is denoted by 3. The surface of this nutrient medium 3 is now inoculated with a culture of bacteria and the whole is then introduced into the incubator so that the bacteria can multiply. Before that, however, various test sheets 4 are placed on the nutrient medium prepared in this way, which are filled with active ingredients, e.g.
B. antibiotics, have been impregnated. For example, if you want to examine six different antibiotics with regard to their effect on the bacteria to be examined, you have to use six test papers and impregnate each of these test papers with a different antibiotic.
These test sheets prepared in this way are then placed evenly distributed on the surface of the inoculated nutrient medium 3 before the Petri dish is placed in the incubator.
According to the effectiveness of the antibiotics bil form around the test papers 4 so-called inhibition zones 5, the diameter of which is a measure of the effectiveness of the antibiotic in question on the bacteria to be examined. However, it can already be seen from Fig. 1 that one must first subtract the diameter 6 of the test sheets 4 from the diameter of the inhibition zone 5 in order to be able to arrive at comparable results with other investigations.
The arrangement according to FIG. 1 also shows, however, that the paper test is time-consuming and cumbersome. In order to achieve the formation of clean inhibition zones, it is necessary to
that the leaflets 4 are placed on the nutrient medium surface as evenly as possible. Has a leaflet z. B. only 90% of its surface is in contact with the nutrient medium so there is insufficient diffusion of the active ingredient from this leaf into
the breeding ground, which in turn leads to an inadequately developed inhibition zone and thus to an incorrect test result. Another disadvantage of the leaflet test is that the impregnation of the individual leaflets 4 cannot be dosed with absolute precision, a disadvantage for the standardization sought. It should be evident that the effectiveness of an active ingredient applied to such a leaflet depends not only on the type of active ingredient but also on the amount used.
In the impregnation of the leaflets 4, however, it is extremely difficult to precisely dose the amount of active ingredient applied. For this reason one encounters very considerable difficulties in the endeavor to standardize the test discs produced on the one hand by various bodies and on the other hand industrially produced.
To eliminate the disadvantages of the known method known as the leaflet test, a method is proposed for carrying out microbiological or microchemical tests by influencing a nutrient medium with various types of active ingredients,
in which, according to the invention, the active substances are applied to the tips of rod-shaped carriers and these carriers are inserted into the nutrient medium. In the test method according to the invention, the active ingredient is therefore not applied to the surface of the inoculated culture, but it gets into the interior of the nutrient medium precisely at the puncture site. Since the active ingredient is preferably applied in a punctiform manner,
therefore, diffusion into the interior of the nutrient medium occurs from a point-like center radially in all directions.
A major advantage of this new, compared to all previously used diffusion methods, is that the same test effect can be achieved with 50 to 100 times smaller doses of active ingredient; with doses of active ingredients that correspond to those of the quantitative, previously only scientifically exact, or mentioned tube dilution process.
The method according to the invention is thus the first test method based on diffusion, which enables an exactly semi-quantitative or quantitative statement that could previously only be achieved with the tube dilution principle.
In the proposed method, the loading of the active ingredient carrier with the necessary, i. H. optimal amounts of active ingredient guaranteed with the greatest precision and reproducibility; In addition, the type of culture medium, agar layer thickness, diffusion time and the like can be determined. a. m. nominate and standardize the test methodology.
A further advantage of the method according to the invention is that the measure 6 explained with reference to FIG. 1 is omitted because a point-like center is assumed into which the active ingredient is introduced.
You can therefore work with smaller dimensions of the vaccine culture; In addition, the method according to the invention is easier to handle because the rod-shaped active ingredient carrier can be brought to the desired location of the nutrient medium more easily and with greater accuracy, namely through egg sticks @ who can.
According to the invention, the tip of the rod-shaped active ingredient carrier is now provided with the active ingredient. In this case, it is advisable to apply the active ingredient to the carrier using the dot printing process. In particular when using this method, the active ingredient can be applied to the active ingredient carrier in a precisely metered amount.
The active ingredient can also be applied to a limited or non-absorbent carrier with the aid of a stamp. It appears essential that the active substance dot is printed on the free end of the active substance carrier in such a way that it remains in the middle of the nutrient medium (in the middle between the upper and lower agar layer boundary) after the active substance carrier has been inserted into the nutrient medium,
so that the active ingredient can optimally diffuse into the nutrient medium that surrounds it on all sides.
The active ingredient carrier should expediently have such a hang that it can be grasped with tweezers, possibly even with the fingers, and that after insertion the free end remains outside the nutrient medium. This free end of the active substance carrier is expediently seen ver with a marking which indicates the type of active substance printed. This marking can then be seen in the finished culture and one immediately overlooks which active ingredient has resulted in the desired inhibition zone.
The active ingredient carrier itself can have any shape that makes it possible to insert it as punctiform as possible into the nutrient medium at its precisely specified location.
Most expediently, an active substance carrier is used to carry out the method according to the invention, which has the shape of a flat stick of a needle or a capillary: In the first two cases, the active substance is expediently applied in the manner already described above by printing or stamping onto the lower tip upset.
In the case of using a capillary, the active ingredient can be introduced into the capillary opening.
The active ingredient carriers can expediently be produced in a bandage, so that the user can separate individual such active ingredient carriers from this bandage as required. This association suitably has a comb-like design in such a way that the free ends of the active ingredient carriers are connected to one another.
The ends of the active substance carriers to be impregnated with the active substance are expediently slightly pointed in order to make it easier to insert into the nutrient medium.
You can now bring these active ingredient carriers on the market already prepared, for example in such a way that such a comb-like group of active ingredient carriers are impregnated with the same active ingredient. But you can also impregnate the individual carriers of such an association with different active ingredients, so that such a combined group is used to carry out a test. The teeth of the comb-like association can therefore be prepared in the shape desired in each case.
Another possible embodiment for such a comb-like association consists in a two-sided design, such that the comb has two-sided teeth, which represent the individual active ingredient carriers.
Such a bandage, the teeth of which are loaded with ver different active ingredients, is bent before use in the center line 13 (Fig. 5) in such a way that all teeth can be inserted into the nutrient medium at the same distance from each other; testing is thus further simplified.
Finally, it should be mentioned that an essential advantage of the method according to the invention is seen in the fact that (e.g.
B. in the case of bacterial testing) from the industrial side, apart from the ready-to-use dot-printed active ingredient carriers, plastic ampoules filled with special nutrients and small bowls to hold the nutrient substrate for the incubation could be made available.
Instead of the previously required amount of 15 to 20 ml of nutrient medium in a layer thickness of about 5 mm, in this case only 2 to 3 ml in a layer thickness of 1 to 1.5 mm would be required; the test result would then be available after four to six hours of incubation.
Possible embodiments for the method according to the invention are explained in the drawing.
In FIG. 2, the principle of the method according to the invention is first shown in contrast to the lamina test explained with reference to FIG. The same reference numerals represent the same arrangements as in the arrangement of FIG. 1. The difference compared to the leaflet test consists in the use of the rod-shaped, downwardly pointed active substance carrier 7, which is inserted into the nutrient medium 3 who the.
In FIG. 3, a rod-shaped active substance carrier is shown on a greatly enlarged scale, while FIGS. 4 and 5 show embodiments for the comb-like configuration of carrier groups.
In FIG. 3, the tip of the active substance carrier to be inserted into the nutrient medium is denoted by 9 and the wider rear end is denoted by 10. On the front tip 9, the active ingredient is applied in dots, for. B. printed up. This active ingredient point is designated by 14.
According to FIG. 4, five such active substance carriers are attached to one another. These active ingredient carriers can be produced in the punching process, for example. The upper ends are attached to each other. Either this combined dressing is inserted as a whole into the nutrient medium or the individual teeth are separated and inserted separately. From FIG. 4 it can also be seen that various markings, represented by the letters A, B, C, D and E, have been applied to the upper ends.
At 14, the point-like active ingredients are again indicated.
In the embodiment of FIG. 5, the active fabric carriers are brought on two sides in a comb-like group. This group can be bent along the dashed line 13 in order to be able to plug the active substance carrier combination into the nutrient medium together. In this case, however, the individual active ingredient carriers must be provided with different active ingredients.