Verfahren zur Herstellung eines Trachom-Schutzimpfstoffes
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trachom-Schutzimpfstoffes.
Das Trachom-Virus wurde zum erstenmal im Jahre 1957 von Tang und Mitarbeitern (Chinese Med. J. 75, 1957, S. 429) isoliert, und ein Jahr danach isolierten C. H. Collier und Mitarbeiter (J. Lancet 1958, I, 993) dasselbe Virus nach der von Tang beschriebenen Methode und bestätigten die Indentität desselben, wobei sie die Augen freiwilliger Patienten mit Trachom infizierten.
Später wurde das Trachom-Virus von trachomatösen Patienten in verschiedenen Laboratorien isoliert.
Das Trachom-Virus wird aus den Bindehautepithelien von trachomatösen Augen isoliert und mittels Dottersackbeimpfung von Hühnerbruteiern gezüchtet; daraufhin werden die infizierten Dottersackgewebe gesam malz. Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines Trachom-Schutzimpfstoffes durch Reinigung der Dottersackgewebe. Es können dadurch die darin enthaltenen unerwünschten Produkte abgetrennt werden, und es wird schliesslich eine wässrige Suspension erhalten. Die besagte wässrige Suspension, und zwar entweder als solche oder nach Zusatz von Hilfsmitteln, wie z. B. Aluminiumhydroxyd oder Mineralölen, die die Wirkung erhöhen, wird als Trachom-Schutzimpfstoff verwendet.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass infiziertes Dottersackgewebe, welches durch Züchtung des Trachom-Virus im Dottersackgewebe von Huhnembryonen erhalten worden ist, mit einer Suspension von Trypsin in einer Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,5-8 und bei einer Temperatur zwischen 35 bis 40 C versetzt wird, und dass der durch Zentrifugieren abgetrennte aktive Teil mit Kieselgur behandelt, durch Zentrifugieren abgetrennt und schliesslich mit Äthyläther behandelt wird.
Das genannte erfindungsgemässe Reinigungsverfahren gewährleistet einen hohen Reinheitsgrad des Trachom-Schutzimpfstoffes, wobei die Fremdsubstanzen ohne Virus-Verlust und Herabsetzung seiner antigenischen Eigenschaften beseitigt werden.
Der erfindungsgemässe Reinigungsprozess besteht aus drei aufeinanderfolgenden Behandlungsschritten, durch welche mit Trachom-Virus infizierte Dottersackgewebe in einen therapeutisch anwendbaren Trachom Schutzimpfstoff umgewandelt werden. Die genannten aufeinanderfolgenden Behandlungsschritte sind: a) Behandlung mit einer Trypsinsuspension, um das Virus von der Proteinfraktion zu befreien; b) Behandlung mit Kieselgur, um die im Impfstoff enthaltenen Fremdsubstanzen zu entfernen; c) Behandlung mit Äther, um Fette und andere in Äther lösliche Fremdsubstanzen zu entfernen.
Die Abtrennung des Virus aus der Suspension kann während jeder Behandlung in bekannter Weise durch Zentrifugieren vorgenommen werden.
Das mit dem Trachom-Virus infizierte Dottersackgewebe, das in dem erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung des Trachom-Schutzimpfstoffes angewandt wird, wird zum Beispiel in folgender Weise hergestellt:
In den Dottersackhohlraum von befruchteten Eiern, die 6 Tage bei 390 C bebrütet wurden, wird der mit einer verdünnten Pufferlösung bei pH 7 vermischte Virus-Stamm injiziert (Puffer Saccharose, Kaliumphosphat und Kaliumglutamat, J. Bact. 59, 1950, S. 509).
Wenn eine 500/oige Sterblichkeit der Eier erreicht ist, werden die noch lebenden Eier geöffnet und die betreffenden Gewebe (bei-70 C gehalten) werden zum Animpfen von weiteren Eiern mit dem Virus verwendet.
Die infizierten Gewebe werden in 500/oigen Saccharose-,
Kaliumphosphat-, Glutamatlösungen aufgeschlämmt und bei niedriger Temperatur bis zum Moment der Impfstoffproduktion aufbewahrt.
Beispiel
Das infizierte Dottersackgewebe wird unter Rühren homogenisiert und 3 Teile einer Trypsinsuspension in Phosphatpufferlösung (100 mg Trypsin/100 ml Puffer) werden bei einem pH-Wert von 7,5-8 und bei einer Temperatur zwischen 35 und 40 C zu einem Teil einer homogenisierten Suspension hinzugefügt. Die erhaltene Suspension wird während 15 Min. durch Rühren bei einer Temperatur zwischen 35 bis 400 C homogenisiert; während dieser Phase wird das Virus von der Proteinfraktion befreit, die dann durch Zentrifugieren bei einem g-Wert von 125-650 abgeschieden wird. Dann wird der aktive Teil durch Zentrifugieren bei 2000-6500 g von dem auf der Oberfläche schwimmenden Teil abgetrennt.
Der gewonnene aktive Teil wird bis zum Ausgangsvolumen mit einer Phosphatpufferlösung bei einem pH Wert von 7,5-8 aufgefüllt; dann wird 2 g Kieselgur (Celite, eingetragene Schutzmarke) je 100 ml Suspension zugesetzt, und es werden danach weitere Fremdsubstanzen bei 650 g abzentrifugiert. Der obenstehende Teil wird gesammelt und bei 2000-6500 g zentrifugiert, wobei wieder der aktive Teil abgetrennt wird.
Der aktive Teil wird in einer Phosphatpufferlösung, deren Volumen gleich dem der Ausgangssupension der infizierten Gewebe ist, aufgeschlämmt und wird einige Minuten mit dem gleichen Volumen Äthyläther versetzt, um Fette und in Äther lösliche Fremdsubstanzen zu extrahieren.
Die ätherische Schicht wird verworfen, der Äther wird vom wässrigen Teil abgedampft, und der aktive Teil wird von der entstehenden Suspension bei 2000 bis 6500 g abzentrifugiert.
Der aktive Teil wird in einer Phosphatpufferlösung gesammelt. Die so erhaltene Suspension enthält den Schutzimpfstoff, der als solcher verwendet werden kann; es können auch Hilfsstoffe, wie Aluminiumhydroxyd oder Mineralöle, zugesetzt werden. Die oben erwähnten Hilfsstoffe werden der den Schutzimpfstoff enthaltenden Suspension zugesetzt, um ein homogenes Produkt zu gewinnen.
Der Trachom-Schutzimpfstoff, der nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wird, kann in verschiedenen therapeutischen Dosen dargereicht werden.
Der Impfstoff kann bei einer Temperatur von 4" C sehr lange aufbewahrt werden, ohne seine Wirksamkeit zu verlieren. Auch nach 6 Monaten wird keine Änderung der antigenischen Wirkung bemerkt.
Toxizitätsproben, die an 15 Meerschweinchen durch intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion des Impfstoffes ausgeführt wurden, zeigten keine schädliche Reaktion. Der Impfstoff, der entsprechend dem erfindungs- gemässen Verfahren gereinigt wurde, zeigt Trachom Schutzwirkung, die in den folgenden Tabellen veranschaulicht wird, wobei die Ergebnisse der am Spital von Asmara ausgeführten klinischen Versuche angegeben sind.
Zu diesem Zweck wurden 4 Dörfer ausgewählt und in jedem von diesen wurden 50 Kinder geimpft (25 mit Aluminiumhydroxyd-Vakzine und 25 mit ÖIvakzine) und 50 Kinder unter Kontrolle gehalten, die alle vom Trachom befallen waren.
Tabelle 1 Ergebnisse der Trachom-Schutzimpfung 2 Monate nach der Behandlung Fälle geimpft mit geimpft mit nicht geimpft dem ölimpfstoff dem Al (OH) 3-
Impfstoff Genesene 58 O/o 20 O/o 0 o/o Gebesserte 16 /o 42 O/o 10 O/o Stationäre 26 o/o 30 o/o 80 O/o Verschlechterte 0 O/o 8 O/o 10 O/o
Tabelle 2 Ergebnisse der Trachom-Schutzimpfung 8 Monate nach der Behandlung Fälle geimpft mit geimpft mit nicht geimpft dem Ölimpfstoff dem AI(OH),
-
Impfstoff Genesene 35 O/o 23 O/o 11 O/o Gebesserte 20 ovo 3 o/o O o/o Stationäre 40 /o 74 O/o 78 o/o Verschlechterte 0 O/o 0 o/o 11 O/o Rückfälle 5 O/o 0 O/o 0 O/o
In den vorerwähnten Tabellen sind die Patienten als genesen zu betrachten, bei denen das Verschwinden der intraplasmatischen Bindehaut-Einschlusskörper nachgewiesen werden kann;
jene, die eine Abnahme der Anzahl der oben erwähnten Einschlusskörper zeigen, können als Gebesserte betrachtet werden; jene, die eine Zunahme der Einschlusskörperanzahl zeigen, können als Verschlechterte und die anderen als Stationäre betrachtet werden.
Process for the preparation of a trachoma protective vaccine
The present invention relates to a method of making a trachoma protective vaccine.
The trachoma virus was first isolated in 1957 by Tang and coworkers (Chinese Med. J. 75, 1957, p. 429) and one year later CH Collier and coworkers (J. Lancet 1958, I, 993) isolated the same Virus according to the method described by Tang and confirmed its identity, infecting the eyes of volunteer patients with trachoma.
The trachoma virus was later isolated from trachomatous patients in various laboratories.
The trachoma virus is isolated from the conjunctival epithelia of trachomatous eyes and bred from hatching eggs using the yolk sac inoculation; the infected yolk sac tissue then becomes all of the malt. The object of the present invention is to provide a method of producing a trachoma protective vaccine by cleaning the yolk sac tissues. The undesired products contained therein can thereby be separated off, and an aqueous suspension is finally obtained. Said aqueous suspension, either as such or after the addition of auxiliaries, such as. B. Aluminum hydroxide or mineral oils, which increase the effect, is used as a trachoma protective vaccine.
The inventive method is characterized in that infected yolk sac tissue, which has been obtained by culturing the trachoma virus in the yolk sac tissue of chicken embryos, with a suspension of trypsin in a phosphate buffer solution at a pH of 7.5-8 and at a temperature between 35 to 40 C is added, and that the active part separated by centrifugation is treated with kieselguhr, separated by centrifugation and finally treated with ethyl ether.
The above-mentioned cleaning method according to the invention ensures a high degree of purity of the trachoma protective vaccine, the foreign substances being eliminated without loss of virus or reduction of its antigenic properties.
The cleaning process according to the invention consists of three successive treatment steps by which yolk sac tissue infected with trachoma virus is converted into a therapeutically applicable trachoma protective vaccine. The successive treatment steps mentioned are: a) treatment with a trypsin suspension in order to free the virus from the protein fraction; b) treatment with kieselguhr to remove the foreign substances contained in the vaccine; c) Treatment with ether in order to remove fats and other foreign substances soluble in ether.
The virus can be separated off from the suspension during each treatment in a known manner by centrifugation.
The yolk sac tissue infected with the trachoma virus, which is used in the process according to the invention for producing the trachoma protective vaccine, is produced, for example, in the following manner:
The virus strain mixed with a dilute buffer solution at pH 7 is injected into the yolk sac cavity of fertilized eggs which have been incubated for 6 days at 390 C (buffer sucrose, potassium phosphate and potassium glutamate, J. Bact. 59, 1950, p. 509) .
When the eggs have reached 500% mortality, the eggs that are still alive are opened and the tissues concerned (kept at -70 C) are used to inoculate further eggs with the virus.
The infected tissues are in 500% sucrose,
Potassium phosphate, glutamate solutions slurried and kept at low temperature until the moment of vaccine production.
example
The infected yolk sac tissue is homogenized with stirring and 3 parts of a trypsin suspension in phosphate buffer solution (100 mg trypsin / 100 ml buffer) at a pH of 7.5-8 and at a temperature between 35 and 40 C become part of a homogenized suspension added. The suspension obtained is homogenized for 15 minutes by stirring at a temperature between 35 and 400 C .; During this phase the virus is freed from the protein fraction, which is then separated off by centrifugation at a g value of 125-650. Then the active part is separated from the part floating on the surface by centrifugation at 2000-6500 g.
The active part obtained is made up to the initial volume with a phosphate buffer solution at a pH of 7.5-8; then 2 g of kieselguhr (Celite, registered trademark) are added per 100 ml of suspension, and further foreign substances are then centrifuged off at 650 g. The above part is collected and centrifuged at 2000-6500 g, again separating the active part.
The active part is suspended in a phosphate buffer solution, the volume of which is the same as that of the initial suspension of the infected tissue, and the same volume of ethyl ether is added for a few minutes in order to extract fats and foreign substances soluble in ether.
The ethereal layer is discarded, the ether is evaporated from the aqueous part, and the active part is centrifuged off from the resulting suspension at 2000 to 6500 g.
The active part is collected in a phosphate buffer solution. The suspension thus obtained contains the protective vaccine, which can be used as such; auxiliaries such as aluminum hydroxide or mineral oils can also be added. The above-mentioned excipients are added to the suspension containing the protective vaccine in order to obtain a homogeneous product.
The trachoma protective vaccine which is obtained by the method according to the invention can be administered in various therapeutic doses.
The vaccine can be stored at a temperature of 4 "C for a very long time without losing its effectiveness. Even after 6 months, no change in the antigenic effect is noticed.
Toxicity tests performed on 15 guinea pigs by intraperitoneal or intramuscular injection of the vaccine showed no deleterious response. The vaccine, which was purified according to the method according to the invention, shows trachoma protective effect, which is illustrated in the following tables, the results of the clinical trials carried out at the Asmara hospital being given.
For this purpose 4 villages were selected and in each of these 50 children were vaccinated (25 with aluminum hydroxide vaccine and 25 with oil vaccine) and 50 children were kept under control, all of whom had trachoma.
Table 1 Results of trachoma vaccination 2 months after treatment Cases vaccinated with vaccinated with not vaccinated the oil vaccine Al (OH) 3-
Vaccine recovered 58 O / o 20 O / o 0 o / o Improved 16 / o 42 O / o 10 O / o Inpatients 26 o / o 30 o / o 80 O / o Worsened 0 O / o 8 O / o 10 O /O
Table 2 Results of the trachoma vaccination 8 months after the treatment Cases vaccinated with vaccinated with not vaccinated the oil vaccine the AI (OH),
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Vaccine recovered 35 o / o 23 o / o 11 o / o improved 20 ovo 3 o / o o / o inpatients 40 / o 74 o / o 78 o / o deteriorated 0 O / o 0 o / o 11 o / o Relapses 5 O / o 0 O / o 0 O / o
In the tables mentioned above, patients are to be regarded as recovered if the disappearance of the intraplasmic conjunctival inclusion bodies can be demonstrated;
those showing a decrease in the number of the above-mentioned inclusion bodies can be regarded as improved; those showing an increase in the number of inclusion bodies can be regarded as deteriorated and the others as stationary.