Verfahren zur Herstellung eines schwerlöslichen Derivates des Kalfikrein-Inaktivators Es ist bekannt, dass man eiweissfreie Derivate des Kallikrein-Inaktivators (KI) aus tierischen Drüsen her stellen kann, indem man seine Lösungen durch Zusatz von Eiweissfällungsmitteln, wie Sulfosalicylsäure und Trichloressigsäure, umsetzt. Der KI wird durch diese Mittel also nicht gefällt (vgl. DP Nr. 1084 433).
Es wurde nun gefunden, dass man den KI in Form eines schwerlöslichen Derivates fällen kann, indem man ihn mit Metaphosphorsäure umsetzt.
Man kann dabei auch so verfahren, dass man die Lösungen des KI mit wasserlöslichen Salzen der Meta phosphorsäure umsetzt, wobei keine Fällung eintritt, und dann durch Ansäuern das schwerlösliche Derivat abscheidet. Hierfür geeignete Salze der Metaphosphor säure sind vor allem die Alkali- und Ammonium salze.
Die erfindungsgemässe Fällung findet auch in ei weissfreien Lösungen des KI statt, z. B. in solchen, die zuvor mit Sulfosalicylsäure oder Trichloressigsäure quantitativ enteiweisst wurden. Daraus geht hervor, dass es sich bei der erfindungsgemässen Massnahme nicht um eine Eiweissfällung handelt. Vielmehr gibt das erfin dungsgemässe Verfahren die Möglichkeit, ein eiweiss freies, schwerlösliches Derivat des KI zu gewinnen.
Durch die erfindungsgemässe Fällung findet keine Denaturierung des KI statt, was ein weiterer Hinweis dafür ist, dass es sich hier nicht um eine Eiweissfällung handelt; denn Eiweissfällungen sind im allgemeinen von Denaturierungen des gefällten Eiweisses begleitet, was sich durch den Verlust der biologischen Wirksamkeit der betreffenden Substanz anzeigt.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird der KI quantitativ in schwerlöslicher Form abgeschieden. In diesem Präparat ist die biologische Wirksamkeit völlig erhalten. Auf Grund der Schwerlöslichkeit des erhaltenen Produktes ist das Verfahren auch zur Reinigung von unreinem KI geeignet.
Die Suspensionen des Fällungsproduktes in Wasser sind nicht dialysierbar, während sich der KI in seiner löslichen Form, auch aus Gemischen, leicht dialysieren lässt. Das Erzeugnis des erfindungsgemässen Verfahrens zeigt bei der Anwendung in vivo eine Depotwirkung. Es ist nicht toxisch, ausgesprochen gewebefreundlich und daher für die therapeutische Anwendung, auch für Injektionen gut geeignet. <I>Beispiel 1</I> 114 mg Kallikrein-Inaktivator (0,38 gγE), entspre chend 300 000 KIE, werden in 5 cm3 redest. Wasser gelöst und mit 2,5 cm3 10%iger Metaphosphorsäure gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, dreimal mit redest. Wasser gewaschen und in 10 cm3 redest. Wasser suspendiert. Die Suspension enthält etwa 100 der Kallikrein-Inaktivatoraktivität.
<I>Beispiel 2</I> 114 mg KI (0,38 gγE), entsprechend 300000 KIE, werden in 2,5 cm3 redest. Wasser gelöst. 10%ige Me taphosphorsäure wird mit NaOH auf pH 6,0 (Syphan) eingestellt, 2,5 cm3 dieser Nametaphosphorlösung werden in obige Kallikrein-Inaktivatorlösung eingerührt. Nach Zusatz von 1 cm3 1:10 verd. Eisessig ent steht ein Niederschlag, der abzentrifugiert wird. Er wird dreimal mit redest. Wasser gewaschen und dann in 10 cm3 redest. Wasser suspendiert. Die Suspension enthält etwa 100 % der Kallikrein-Inaktivatoraktivität.
Beispiel <I>3</I> 300 mg Kallikrein-Inaktivator vom Reinheitsgrad 0,6 y entsprechend 500 000 KIE, die aus Pankreas her gestellt waren, werden in 10 cm3 redestilliertem Was ser gelöst und mit 7,2 cm-3 10%iger Meta,phosphor- säure gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, dreimal mit redestilliertem Wasser gewaschen und in 22,5 cm3 aqua redest. suspendiert. Die Ausbeute be trägt 90%, 1 cm3 der Suspension enthält also 20000 KIE.
<I>Beispiel 4</I> 100 cm3 einer salzfreien wässrigen Lösung von Kallikrein-Inaktivator aus Parotis vom Reinheitsgrad 0,42 y enthaltend 250 000 KIE, wurden mit 0,2 cm3 10 % iger Metaphosphorsäure gefällt. Der Niederschlag wurde nach dem Abzentrifugieren zweimal mit aqua redest. gewaschen und der Rückstand sodann in 20 cm3 redest. Wasser suspendiert. 1 cm3 der Sus pension enthielt 11250 KIE, die Ausbeute betrug also 90 %.
<I>Beispiel S</I> 150 cm3 einer salzfreien wässrigen Lösung von Kallikrein-Inaktivator aus Lunge vom Reinheitsgrad 0,3 y, enthaltend 9,9 Millionen KIE, wurden mit 10 cm3 einer 10%igen Metaphosphorsäurelösung ge fällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und zwei mal mit redest. Wasser gewaschen.
Danach wurde der Rückstand in 330 cm3 redest. Wasser suspendiert. Die dabei entstandene Suspension enthält den gesamten eingesetzten Kallikrein-Inaktiva- tor. Die Ausbeute beträgt also 100 %. 1 KIE dieser Suspension ist gebunden 0,22 y.
Process for the production of a poorly soluble derivative of the kallikrein inactivator It is known that protein-free derivatives of the kallikrein inactivator (KI) can be made from animal glands by converting its solutions by adding protein precipitants such as sulfosalicylic acid and trichloroacetic acid. The AI is therefore not liked by these means (see DP No. 1084 433).
It has now been found that the KI can be precipitated in the form of a poorly soluble derivative by reacting it with metaphosphoric acid.
One can also proceed in such a way that the solutions of the KI are reacted with water-soluble salts of metaphosphoric acid, with no precipitation occurring, and then the poorly soluble derivative is separated off by acidification. Metaphosphoric acid salts suitable for this purpose are, above all, the alkali metal and ammonium salts.
The inventive precipitation also takes place in egg white-free solutions of the KI, z. B. in those that have previously been quantitatively deproteinized with sulfosalicylic acid or trichloroacetic acid. From this it can be seen that the measure according to the invention is not a matter of protein precipitation. Rather, the method according to the invention gives the possibility of obtaining a protein-free, sparingly soluble derivative of the KI.
The precipitation according to the invention does not result in any denaturation of the KI, which is a further indication that this is not a protein precipitation; for protein precipitations are generally accompanied by denaturation of the precipitated protein, which is indicated by the loss of the biological effectiveness of the substance in question.
In the method according to the invention, the KI is deposited quantitatively in a form that is difficult to dissolve. The biological effectiveness is completely retained in this preparation. Due to the poor solubility of the product obtained, the process is also suitable for cleaning impure KI.
The suspensions of the precipitation product in water cannot be dialyzed, while the KI in its soluble form, even from mixtures, can easily be dialyzed. The product of the method according to the invention shows a depot effect when used in vivo. It is non-toxic, extremely tissue-friendly and therefore well-suited for therapeutic use, including injections. <I> Example 1 </I> 114 mg kallikrein inactivator (0.38 g γU), corresponding to 300,000 KIU, are spoken in 5 cm3. Dissolved water and precipitated with 2.5 cm3 of 10% metaphosphoric acid. The precipitate is centrifuged off, three times with redest. Water washed and talking in 10 cm3. Suspended in water. The suspension contains approximately 100% of the kallikrein inactivator activity.
<I> Example 2 </I> 114 mg KI (0.38 g γE), corresponding to 300,000 KIE, are spoken in 2.5 cm3. Dissolved in water. 10% metaphosphoric acid is adjusted to pH 6.0 (syphan) with NaOH, 2.5 cm3 of this nametaphosphorus solution are stirred into the above kallikrein inactivator solution. After adding 1 cm3 1:10 diluted glacial acetic acid, a precipitate is formed which is centrifuged off. He'll talk to you three times. Washed water and then talking in 10 cm3. Suspended in water. The suspension contains approximately 100% of the kallikrein inactivator activity.
Example <I> 3 </I> 300 mg of kallikrein inactivator with a degree of purity of 0.6 y corresponding to 500,000 KIE, which were made from the pancreas, are dissolved in 10 cm3 of redistilled water and mixed with 7.2 cm-3 of 10% iger meta, phosphoric acid like. The precipitate is centrifuged off, washed three times with redistilled water and redest in 22.5 cm3 of aqua. suspended. The yield is 90%, so 1 cm3 of the suspension contains 20,000 KIE.
<I> Example 4 </I> 100 cm 3 of a salt-free aqueous solution of kallikrein inactivator from parotid with a purity of 0.42 y and containing 250 000 KI were precipitated with 0.2 cm 3 of 10% metaphosphoric acid. After centrifugation, the precipitate was redest twice with aqua. washed and the residue then talking in 20 cm3. Suspended in water. 1 cm3 of the suspension contained 11250 KIE, so the yield was 90%.
<I> Example S </I> 150 cm 3 of a salt-free aqueous solution of kallikrein inactivator from lung of a purity grade 0.3 y, containing 9.9 million KI, were precipitated with 10 cm 3 of a 10% metaphosphoric acid solution. The precipitate was centrifuged off and spoke twice. Water washed.
Then the residue was talking in 330 cm3. Suspended in water. The resulting suspension contains all of the kallikrein inactivator used. The yield is therefore 100%. 1 KIE of this suspension is bound 0.22 y.