Procédé de préparation d'une composition contenant du lysozyme stable thermiquement La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation d'une composition contenant du lysozyme, stable thermiquement, caractérisé en ce qu'on soumet une matière naturelle contenant du lysozyme à une extraction au moyen d'un acide et qu'on mélange la solution aqueuse de sel d'acide de lysozyme ainsi obtenue avec un agent stabilisant constitué par au moins un diol, ou un polyol.
Le lysozyme est un produit naturel sensible aux variations des conditions extérieures ; il est ins table et se dégrade en présence d'eau, d'autant plus vite que les solutions en sont plus diluées. Le lyso zyme est également instable à la chaleur, cette ins tabilité étant d'ailleurs différente selon l'état d'humi dité du lysozyme : à sec le lysozyme résiste jusqu'à 1200 C à la décomposition; tandis qu'en solution aqueuse, il reste stable jusqu'à 65 - 700 C, se dégrade lentement vers 80o C, puis se dégrade brutalement vers 1000 C.
Or, on a fait la constatation que des solutions de lysozyme mélangées à l'un des agents précités sont plus stables que les solutions aqueuses simples. La solution aqueuse de lysozyme est de préférence obtenue par extraction à partir de blanc d'#uf et la stabilisation de cette solution s'effectue de pré férence en ajoutant une quantité de sucre portant sa concentration jusqu'à celle du sirop du Codex pharmaceutique, à savoir environ 65%.
L'eau de ce sirop peut être évaporée par des procédés bon marché, pour donner une poudre sucrée d'excellente conservation.
Dans les deux cas, la composition obtenue à savoir le lysozyme en sirop ou en poudre sucrée, est vraiment concentrée et parfaitement stable. Cette composition peut être associée à du sucre en vue d'obtenir un sucre dont la concentration en lysozyme est au maximum de 100 parties par million.
A cet effet on peut pulvériser la solution sucrée de lysozyme en particules très divisées sous faible pression. Cette pulvérisation a lieu sur du sucre en mouvement lui-même de façon que les particules très fines de la pulvérisation permettent une répar tition homogène du lysozyme qui se fixe sur chaque grain de sucre sous forme d'une fine particule de sirop par adsorption, particule qui devient elle- même du sucre lysozymé par évaporation de l'eau dans la tour de séchage,
sans que la chaleur ait pu détruire l'enzyme car l'évaporation de l'eau du sirop absorbe les calories qui auraient pu dégrader le lysozyme.
Le moment de cette pulvérisation, pour tenir compte des risques de perte de solution, est choisi à la sortie des turbines, juste à l'entrée de la tour de séchage.
La pulvérisation des solutions de lysozyme dans ces conditions n'augmente l'humidité du sucre que de 2'%, ce qui ne provoque aucune surcharge importante à l'appareillage de séchage.
Dans certains cas, la présence de sucre commu nique à la composition un goût parfois peu compa- tible ou même incompatible avec l'emploi envisagé pour celle-ci, par exemple l'incorporation dans un dentifrice ou bien peut rendre difficile la réalisation d'émulsions, ou nuire à la solubilité de principes actifs, par exemple dans le cas de la préparation de pommades et/ou d'onguents et de solutions.
Dans ce cas, on utilisera comme agent stabilisant au lieu du sucre, un diol ou un polyol tel que l'éthy- lène-glycol, le propylène-glycol, le glycérol, le pen- taérythritol, le sorbitol, le mannitol, l'inositol et le quercitol.
Pour démontrer l'efficacité des agents envisagés sur la stabilisation des solutions de lysozyme, on a effectué une comparaison de stabilité à différentes températures et pendant différentes durées entre une solution aqueuse témoin contenant 100 Etg/ml de lysozyme et des solutions identiques contenant en outre 35 % (p/v)
de chacun des agents étudiés. La technique d'essai est celle décrite par SMOLELIS & HART-SELL (J.
Bact. 1949,<I>58,</I> 731) et consiste à évaluer la lyse d'une culture fraîche centrifugée et lavée de Micrococcus Lysodekticus à pH 6,2 et à température ambiante,
après addition des diffé rentes solutions lysozymées. Les conditions de trai tement préalable de ces solutions en vue de l'appré- ciation de la stabilité du lysozyme sont les suivantes
EMI0002.0049
<I>Température <SEP> <SEP> C <SEP> Durée</I>
<tb> 45 <SEP> 8 <SEP> jours
<tb> 60 <SEP> 3 <SEP> 'heures
EMI0002.0050
<I>Température <SEP> <SEP> C <SEP> Durée</I>
<tb> 80 <SEP> 2 <SEP> heures
<tb> 100 <SEP> 1 <SEP> heure Le calcul permettant la comparaison
entre .les dif férentes activités se fait d'après la formule
EMI0002.0054
EMI0002.0055
dans <SEP> laquelle <SEP> Al. <SEP> = <SEP> activité <SEP> relative,
<tb> Te <SEP> = <SEP> temps <SEP> en <SEP> secondes <SEP> nécessaire
<tb> à <SEP> la <SEP> solution <SEP> étalon <SEP> pour <SEP> abais ser <SEP> d'environ <SEP> 400/1000 <SEP> la <SEP> i
<tb> densité <SEP> optique <SEP> du <SEP> substrat.
<tb> T@ <SEP> = <SEP> temps <SEP> mis <SEP> <I>par</I> <SEP> la <SEP> solution
<tb> essayée <SEP> pour <SEP> obtenir <SEP> le <SEP> même
<tb> résultat.
II est bien évident qu'il y aura action protec trice quand Ar sera supérieure à 1 et que cette action sera d'autant plus efficace que Ar sera élevée.
Les résultats obtenus pour un certain nombre des agents indiqués ont été les suivants
EMI0002.0060
Valeur <SEP> de <SEP> Ar
<tb> Produits <SEP> essayés <SEP> Températures
<tb> 45o <SEP> 60,, <SEP> 800 <SEP> 1000
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> .<B>...................... <SEP> .....</B> <SEP> ...- <SEP> 1,88 <SEP> 1,41 <SEP> 1,76 <SEP> 4,3
<tb> Propylène <SEP> glycol <SEP> <B>.....................</B> <SEP> .<B>.......</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> 2,1 <SEP> 1,46 <SEP> 2,22 <SEP> 4,3
<tb> Glycérol <SEP> ..<B>.....</B> <SEP> __<B>-------------</B> <SEP> ..........................._ <SEP> 1,46 <SEP> 1,82 <SEP> 1,15 <SEP> 2,22
<tb> Sorbitol <SEP> <B>--------</B> <SEP> . <SEP> <B>-------------</B> <SEP> ._-. <SEP> ......... <SEP> -. <SEP> ..........
<SEP> 1,37 <SEP> 1,11 <SEP> 1,54 <SEP> 2,67
<tb> Pentaérythritol<B>............</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> .<B>-------------</B> <SEP> -<B>------</B> <SEP> 1,41 <SEP> 0,37 <SEP> 0,48 <SEP> 0,66
<tb> Mannitol <SEP> <B>------</B> <SEP> ...-_<B>...... <SEP> ...... <SEP> ......</B> <SEP> .........<B>......</B> <SEP> 1,75 <SEP> 1,00 <SEP> 1,00 <SEP> 1,00 Il ressort clairement de ces résultats que l'addition de diols et de polyols, aux solutions de lysozyme a un effet stabilisateur spectaculaire sur celles-ci, et cela spécialement aux températures plus élevées, auxquelles, comme indiqué dans le préambule,
ces solutions ont précisément une forte tendance à se dégrader.
La proportion de ces agents stabilisateurs pour laquelle les résultats reportés ci-dessus ont été obte- nus est de 35%. Toutefois, cette, proportion peut être plus basse ou plus élevée, à la fois selon la nature de l'agent protecteur choisi et selon 1e, tem pérature et/ou la durée de conservation de la solu tion de lysozyme à protéger.
Le nombre de variables intervenant dans cette évaluation de la concentration pour un cas particulier est tel qu'il n'est pas possi ble de donner une règle précise pour le choix de la proportion à utiliser. On peut cependant indiquer d'une manière très générale que l'on peut dans l'ensemble utiliser des proportions de 10 à 75 b/9 et de préférence de 20 à <RTI
ID="0002.0097"> 40'% de l'agent protecteur choisi dans les classes définies plus haut. On obtient, en fait, une stabilisation à toutes les concentrations. Seul le degré de cette stabilisation peut varier en fonction de la concentration en agent stabilisateur.
L'association du sucre avec le lysozyme, réalisée par l'intermédiaire d'une composition obtenue con formément à l'invention a démontré une surprenante efficacité contre la carie dentaire. On a constaté que l'association de 10 à 25 gamma de lysozyme par gramme de sucre ordinaire empêche l'apparition de la carie dentaire et l'ostéolyse alvéolaire (voir en particulier l'article du Dr R.
DUBOIS-PREVOST dans Hygie , 18 juin 1961, pages 5 à 16).
De très nombreuses préparations à usage sani taire ou thérapeutique, peuvent être préparées à par tir des compositions obtenues conformément à l'in vention, telles que dentifrices, pommades, solutés ou onguents, et contenant du lysozyme dont la stabilité est assurée grâce à la présence d'un diol ou d'un polyol, y compris le sucre,
ces préparations bénéfi ciant alors en outre éventuellement des propriétés adoucissantes ete émollientes de l'agent stabilisateur compris dans la composition utilisée pour réaliser ces préparations.
Process for preparing a composition containing thermally stable lysozyme The present invention relates to a process for the preparation of a composition containing lysozyme, thermally stable, characterized in that subjecting a natural material containing lysozyme to an extraction by means of an acid and mixing the aqueous solution of lysozyme acid salt thus obtained with a stabilizing agent consisting of at least one diol, or one polyol.
Lysozyme is a natural product sensitive to variations in external conditions; it is unstable and degrades in the presence of water, the faster the more dilute the solutions are. Lysozyme is also unstable to heat, this instability being moreover different according to the state of humidity of the lysozyme: when dry, lysozyme resists decomposition up to 1200 C; while in aqueous solution, it remains stable up to 65 - 700 C, degrades slowly around 80o C, then degrades abruptly around 1000 C.
However, it has been observed that lysozyme solutions mixed with one of the aforementioned agents are more stable than simple aqueous solutions. The aqueous lysozyme solution is preferably obtained by extraction from egg white and the stabilization of this solution is preferably carried out by adding a quantity of sugar bringing its concentration up to that of the syrup of the Pharmaceutical Codex, namely about 65%.
The water in this syrup can be evaporated by inexpensive methods, to give a sweet powder of excellent preservation.
In both cases, the composition obtained, namely lysozyme in syrup or in sweet powder, is really concentrated and perfectly stable. This composition can be combined with sugar in order to obtain a sugar whose lysozyme concentration is at most 100 parts per million.
For this purpose, the sweet lysozyme solution can be sprayed into highly divided particles under low pressure. This spraying takes place on the moving sugar itself so that the very fine particles of the spray allow a homogeneous distribution of the lysozyme which is fixed on each grain of sugar in the form of a fine particle of syrup by adsorption, particle which itself becomes lysozymated sugar by evaporation of the water in the drying tower,
without the heat being able to destroy the enzyme because the evaporation of the water from the syrup absorbs the calories which could have degraded the lysozyme.
The moment of this spraying, to take into account the risk of loss of solution, is chosen at the outlet of the turbines, just at the inlet of the drying tower.
Spraying the lysozyme solutions under these conditions only increases the humidity of the sugar by 2%, which does not cause any significant overload on the drying apparatus.
In certain cases, the presence of sugar communicates to the composition a taste which is sometimes incompatible or even incompatible with the use envisaged for the latter, for example incorporation into a toothpaste or else can make it difficult to prepare. emulsions, or adversely affect the solubility of active ingredients, for example in the case of the preparation of ointments and / or ointments and solutions.
In this case, instead of sugar, a diol or a polyol such as ethylene glycol, propylene glycol, glycerol, pentaerythritol, sorbitol, mannitol, pentaerythritol, sorbitol, mannitol, or inositol and quercitol.
To demonstrate the effectiveness of the agents envisaged on the stabilization of lysozyme solutions, a comparison of stability at different temperatures and for different times between a control aqueous solution containing 100 Etg / ml of lysozyme and identical solutions containing additionally 35 % (w / v)
of each of the agents studied. The test technique is that described by SMOLELIS & HART-SELL (J.
Bact. 1949, <I> 58, </I> 731) and consists in evaluating the lysis of a fresh centrifuged and washed culture of Micrococcus Lysodekticus at pH 6.2 and at room temperature,
after addition of the various lysozymium solutions. The conditions for the preliminary treatment of these solutions with a view to assessing the stability of lysozyme are as follows
EMI0002.0049
<I> Temperature <SEP> <SEP> C <SEP> Duration </I>
<tb> 45 <SEP> 8 <SEP> days
<tb> 60 <SEP> 3 <SEP> 'hours
EMI0002.0050
<I> Temperature <SEP> <SEP> C <SEP> Duration </I>
<tb> 80 <SEP> 2 <SEP> hours
<tb> 100 <SEP> 1 <SEP> hour The calculation allowing the comparison
between the different activities is done according to the formula
EMI0002.0054
EMI0002.0055
in <SEP> which <SEP> Al. <SEP> = <SEP> relative <SEP> activity,
<tb> Te <SEP> = <SEP> time <SEP> in <SEP> seconds <SEP> necessary
<tb> to <SEP> the <SEP> solution <SEP> standard <SEP> for <SEP> lowers <SEP> by approximately <SEP> 400/1000 <SEP> the <SEP> i
<tb> optical <SEP> density <SEP> of the <SEP> substrate.
<tb> T @ <SEP> = <SEP> time <SEP> put <SEP> <I> by </I> <SEP> the <SEP> solution
<tb> tried <SEP> to <SEP> get <SEP> the same <SEP>
<tb> result.
It is quite obvious that there will be a protective action when Ar is greater than 1 and that this action will be all the more effective as Ar is high.
The results obtained for a number of the agents indicated were as follows
EMI0002.0060
<SEP> value of <SEP> Ar
<tb> Products <SEP> tested <SEP> Temperatures
<tb> 45o <SEP> 60 ,, <SEP> 800 <SEP> 1000
<tb> Ethylene <SEP> glycol <SEP>. <B> ...................... <SEP> ..... </B> < SEP> ...- <SEP> 1.88 <SEP> 1.41 <SEP> 1.76 <SEP> 4.3
<tb> Propylene <SEP> glycol <SEP> <B> ..................... </B> <SEP>. <B> .... ... </B> <SEP>. <B> ------ </B> <SEP> 2.1 <SEP> 1.46 <SEP> 2.22 <SEP> 4.3
<tb> Glycerol <SEP> .. <B> ..... </B> <SEP> __ <B> ------------- </B> <SEP> .. ........................._ <SEP> 1.46 <SEP> 1.82 <SEP> 1.15 <SEP> 2.22
<tb> Sorbitol <SEP> <B> -------- </B> <SEP>. <SEP> <B> ------------- </B> <SEP> ._-. <SEP> ......... <SEP> -. <SEP> ..........
<SEP> 1.37 <SEP> 1.11 <SEP> 1.54 <SEP> 2.67
<tb> Pentaerythritol <B> ............ </B> <SEP>. <B> ........ </B> <SEP>. <B> - ------------ </B> <SEP> - <B> ------ </B> <SEP> 1.41 <SEP> 0.37 <SEP> 0, 48 <SEP> 0.66
<tb> Mannitol <SEP> <B> ------ </B> <SEP> ...-_ <B> ...... <SEP> ...... <SEP>. ..... </B> <SEP> ......... <B> ...... </B> <SEP> 1.75 <SEP> 1.00 <SEP> 1 , 00 <SEP> 1.00 It is clear from these results that the addition of diols and polyols, to lysozyme solutions has a dramatic stabilizing effect thereon, especially at higher temperatures, at which, as indicated in the preamble,
precisely these solutions have a strong tendency to degrade.
The proportion of these stabilizing agents for which the results reported above were obtained is 35%. However, this proportion may be lower or higher, both depending on the nature of the protective agent chosen and depending on the temperature and / or the shelf life of the lysozyme solution to be protected.
The number of variables involved in this evaluation of the concentration for a particular case is such that it is not possible to give a precise rule for the choice of the proportion to be used. It can, however, be stated in a very general manner that it is generally possible to use proportions of 10 to 75 b / 9 and preferably of 20 to <RTI
ID = "0002.0097"> 40 '% of the protective agent chosen from the classes defined above. In fact, stabilization is obtained at all concentrations. Only the degree of this stabilization can vary as a function of the concentration of stabilizing agent.
The association of sugar with lysozyme, produced by means of a composition obtained in accordance with the invention, has demonstrated surprising efficacy against dental caries. It has been found that the association of 10 to 25 gamma of lysozyme per gram of ordinary sugar prevents the appearance of dental caries and alveolar osteolysis (see in particular the article by Dr R.
DUBOIS-PREVOST in Hygie, June 18, 1961, pages 5 to 16).
Very many preparations for sanitary or therapeutic use can be prepared by shooting compositions obtained in accordance with the invention, such as dentifrices, ointments, solutes or ointments, and containing lysozyme, the stability of which is ensured thanks to the presence a diol or a polyol, including sugar,
these preparations then also optionally benefiting from the softening and emollient properties of the stabilizing agent included in the composition used to make these preparations.