Verfahren zur Herstellung neuer Heptapeptide
Als Peptide mit Hypertensinwirkung sind das im Pferdeserum vorkommende Dekapoptid Hypertensin I mit der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure, L-Ar- ginin, L-Valin-L-Tyrosin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Leucin, als Ileu5-Hypertensin I bezeichnet, und das im Rinderserum vorkommende Val5-Hypertensin I, ebenfalls ein Dekapeptid, das sich von dem vorher genannten nur durch die fünfte Aminosäure, L-Valin, unterscheidet, bekannt.
Aus Pferdeserum wurde ferner ein Oktapeptid, Ileu5-Hypertensin II, isoliert, das sich vom entsprechenden Hypertensin I durch Fehlen der 9. und 10. AminosÏure unterscheidet und mittels eines im Serum vorhandenen Enzyms aus dem Dekapeptid gebildet wird. Gemäss dem Schweiz. Patent Nr. 358 431 wurde auch das dem VaP-Hypertensin I entsprechende Oktapeptid, Val5-Hypertensin II, syn thetisiert. Es wurde auch gezeigt, dass den genannten Peptide entsprechende Polypeptide, welche statt der Asparaginsäure das Asparagin aufweisen, Hypertensinwirkung haben und weiter, dass die Aminosäuren 2, 3 und 5 durch verwandte Aminosäuren ersetzt werden können, wobei die Hypertensinwirkung erhalten bleibt.
In anderen FÏllen von Abwandlungen des Mo leküls geht die Wirkung grösstenteils oder vollständig verloren. So zeigt sich insbesondere, dass das Heptapeptid, das die 8. Aminosäure des Oktapeptids nicht enthält, keine Hypertensinwirkung mehr hat (Lentz, Skeggs et al., Journ. exp. Med. 104 [1956], 190).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung neuer Heptapeptide der Formel
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worin Ri eine Arninoniederalkylgmppe und R2 eine Niederalkylgruppe bedeuten.
Überraschenderweise zeigen sie eine gute Hyper tensinwirkung, insbesondere das L-Arginyl-L-valyl-Ltyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin.
Die genannten Heptapeptide bieten insofern bedeutende technische Vorteile gegenüber den bekannten Hypertensinen, als sie sehr viel leichter und billiger herstellbar sind.
Als Reste einer a-Aminoniederalkyl-aminoessig- sÏure seien Arginyl, Ornithyl und Lysyl, als Reste einer a-Amino-niederalkylessigsäure Valyl und Norvalyl, ferner Leucyl, Isoteucyl und Norleucyl sowie Alanyl, genannt.
Die neuen Peptide können nach f r die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Pep tideinheiten verknüpft werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine L-a-Aminoniederalkyl- aminoessigsäure, eine L-a-Amino-niederalkylessig- säure, L-Tyrosin, eine L-a-Amino-niederalkylessig- saure, L-Histidin, L-Prolin und L-Phenylalanin un ter intermediärem Schutz von Amino-bzw. Carb oxylgruppen miteinander durch Kondensation ver einigt.
Zweckmässig werden alle an der Reaktion nicht beteiligten freien funktionellen Gruppen geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Aminogruppe beispielsweise durch den Tosyl-oder Tritylrest und insbeson- dere die Carbobenzoxygruppe oder farbige Schutzgruppen, wie die p-Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und die p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxy- carbonylgruppe. Die Hydroxylgruppe des Tyrosyls muss bei der Reaktion nicht notwendigerweise geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die Uberführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Heptapeptido und Zwischenpro- dukte kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln erfolgen.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Fonn von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze gewinnen.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Heptapeptide können als blutdrucksteigemde Mittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 a) N-Carbobenzyloxy-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl
L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin methylester
775 mg (0, 001 Mol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester, hergestellt gemäss Beispiel 2 des Schweiz. Patentes Nr.
358 341, und 462 mg (0, 0015 Mol) Na-Carbobenzyl- oxy-L-arginin werden in 5 ml frisch destilliertem Di methylformamid gelöst bzw. suspendiert und dazu 0, 125 ml (0, 0015 Mol) 12, 0-n. wässerige Salzsäure gegeben. Nach kurzem Erwärmen auf 30 tritt klare Lösung ein. Es wird auf 0 abgekühlt, 340 mg (0, 00165 Mol) Dicyclobexylcarbodiimid zugegeben und 4 Stunden bei 0 stehen gelassen. Nach weiteren 10 Stunden bei 20 gibt man 0, 1 ml Eisessig zu, lässt nochmals 1 Stunde stehen und filtriert dann vom gebildeten Dicyclohexylhamstoff ab.
Das Filtrat wird im Hochvakuum bei 40 eingedampft, in wenig Wasser gelöst, unter Eiskühlung mit Soda alkalisch gemacht und die käsigeFällung mitn-Butanol extrahiert.
Nach dem Neutralwaschen und Eindampfen erhält man 1, 28 g eines Rohproduktes, das zur Reinigung im System Methanol-Wasser 1 : 1/Chloroform (Phasenvolumen je 10 ml) einer Craig-Verteilung über 45 Stufen unterworfen wird. Aus Röhrchen 17 bis 33 (Max. bei Nr. 24) erhält man 660 mg eines weissen Pulvers, das direkt zum freien Peptid hydrolysiert wird.
b) L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl- L-prolyl-L-phenylalanin
660 mg N-Carbobenzyloxy-L-arginyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninmethylester werden in 5 ml konz. Salzsäure gelöst und während 70 Minuten auf 40 erwärmt. Man erhält nach Eindampfen zur Trockne bei 402 im Hoch- vakuum 630 mg eines pulverigen Hydrochlorids, das zur Freisetzung des Peptides durch eine schwach basische Ionenaustauschersäule filtriert wird [ Merck Nr. IInB (Markenprodukt), 0 = 12 mm, I = 13 cm] unter Verwendung von Methanol-Wasser 1 :
1 als Lö sungsmittel. Nach Abdampfen des Methanols im Vakuum und Lyophilisieren erhält man 510 mg eines farblosen Pulvers.
Dieses Rohprodukt wird durch eine Craig-Verteilung im System n-Butanol/0, 3-m. Ammoniumace- tatlösung (pH 7, 0) über 63 Stufen verteilt. Aus Röhr- chen 17 bis 32 (Max. bei Nr. 24 ; G = 0, 62) erhält man nach Eindampfen zur Trockne und Wegsublimieren des Puffers im Hochvakuum bei 45 insgesamt 280 mg L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histi- dyl-L-prolyl-L-phenylalanin als farbloses, amorphes Pulver vom F. ca. 200 (unter Zersetzung). Die Ver- bindung ist leicht löslich in Wasser und Methanol.
Im Papierchromatogramm zeigt sie in den Systemen tert.- Amylalkohol-Triäthylamin-Veronal-Wasser-Isopropa- nol (100 : 0, 8 : 1, 8 : 50 : 40) und sek.-Butanol-Veronal- natrium-Wasser-Isopropanol (100 : 0, 5 : 70 : 15) einheitliche Flecken mit Rf-Werten von 0, 51 bzw. 0, 69.
(Positiv auf Pauly-Reagens und Ninhydrin.)
Beispiel 2 a) N-Carbobenzyloxy-nitroo-L-argit2yl-L-vcslyl-
L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl alanin-methylester
775 mg (0, 001 Mol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl- L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester, her- gestellt gemäss Beispiel 2 des Schweiz. Patentes Nr.
358431, und 565 mg (0, 00275 Mol) Dicyclohexyl- carbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid und 10 ml Acetonitril gelöst und dazu 882 mg (0, 0025 Mol) N-Carbobenzyloxy-nitro-L-arginin, gelöst in wenig Dimethylformamid, zugetropft. Es bildet sich rasch eine kristalline Fällung von Dicyclohexylharnstoff und das Gemisch wird über Nacht bei Zimmer- temperatur stehen gelassen. Nach Zugabe von 0, 2 ml Eisessig wird nochmals 1 Stunde stehen gelasse, dann filtriert und mit wenig Methanol gewaschen. Das Filtrat wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, in Butanol gelöst, mit eiskalter Sodalösung und dann mit Wasser bis neutral gewaschen und zur Trockne eingedampft.
Man erhält 1, 6 g eines Rohgemisches, das im System Methanol-Wasser-Chloro form-Benzol 3 : 1 : 3 : 1 über 60 Stufen verteilt wird.
(Phasenvolumen je 10 ml.) Der Inhalt der Röhrchen 10 bis 21 ergibt beim Eindampfen zur Trockne 900 mg Material, das zur Hydrierung verwendet wird. b) L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl L-prolyl-L-phenylalanin-methylester
900 mg N-Carbobenzyloxy-nitro-L-arginyl-L-va- lyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester werden in 10 ml Methanol und 5 ml 1-n. Salzsäure (in Methanol) gelöst und nach Zugabe von 300 mg Palladiumkohle (10%) bis zum Stillstand hydriert, unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds. Die Aufnahme von etwas mehr als 5 Mol l Wasserstoff ist nach 6 Stunden beendigt. Der Katalysator wird abfiltriert, das farblose Filtrat eingedampft und im Hochvakuum bei 40'bis zur Gewichtskon- stanz getrocknet.
Man erhält 890 mg eines weissen Pulvers (Gemisch von Heptapeptid-methylester-tri- hydrochlorid und Ammoniumchlorid), das direkt hy drolysiert werden kann. c) L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl L-prolyl-L-phenylalanin
890 mg roher Mothylester werden in 6 ml konzentrierter, wÏssriger SalzsÏure gel¯st und wÏhrend l Stundo auf 40 erwärmt. Es wird dann im Hoch- vakuum bei 40 zur Trockne eingedampft (Dauer ca.
20 Minuten), in wenig Wasser gelost und langsam durch eine Säule von schwach basischem Ianevausr tauscher filtriert [ Merck II (Markenprodukt), in der Acetatform vorliegend ; Ï = 12, 5 mm, 1 = 13 cm]. Das wässrige Eluat wird lyophilisiert und die dabei erhaltenen 770 mg Rohprodukt im System n Butanol-Wasser ber 100 Stufen verteilt. (Phasen- volumen jo 10 ml.) Aus Röhrchen 6 bis 17 (Maximum bei Nr. 11 ; G = 0, 13) gewinnt man total 484 mg reines L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-monoacetat.
Process for the production of new heptapeptides
The decapoptide hypertensin I, which occurs in horse serum and has the amino acid sequence L-aspartic acid, L-arginine, L-valine-L-tyrosine, L-isoleucine, L-histidine, L-proline, L-phenylalanine, L, are peptides with hypertensin effects -Histidine, L-leucine, known as Ileu5-hypertensin I, and Val5-hypertensin I, which occurs in bovine serum, is also a decapeptide which differs from the previously mentioned only in the fifth amino acid, L-valine.
An octapeptide, Ileu5-Hypertensin II, was isolated from horse serum, which differs from the corresponding Hypertensin I in that the 9th and 10th amino acids are missing and is formed from the decapeptide by means of an enzyme present in the serum. According to Switzerland. In Patent No. 358,431, the octapeptide corresponding to VaP-Hypertensin I, Val5-Hypertensin II, was also synthesized. It was also shown that polypeptides corresponding to the peptides mentioned, which have asparagine instead of aspartic acid, have a hypertensin effect and further that amino acids 2, 3 and 5 can be replaced by related amino acids, the hypertensin effect being retained.
In other cases of modifications of the molecule, the effect is largely or completely lost. In particular, it can be seen that the heptapeptide, which does not contain the 8th amino acid of the octapeptide, no longer has any hypertensin effect (Lentz, Skeggs et al., Journ. Exp. Med. 104 [1956], 190).
The present invention now relates to a process for producing new heptapeptides of the formula
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where Ri is an amino lower alkyl group and R2 is a lower alkyl group.
Surprisingly, they show a good hypertensin effect, in particular L-arginyl-L-valyl-Ltyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine.
The heptapeptides mentioned offer significant technical advantages over the known hypertensins insofar as they are much easier and cheaper to produce.
Arginyl, ornithyl and lysyl may be mentioned as residues of an a-amino-lower alkyl-aminoacetic acid, and valyl and norvalyl as residues of an a-amino-lower alkyl-aminoacetic acid, and also leucyl, isoteucyl and norleucyl and alanyl.
The new peptides can be obtained by methods known for peptide production, the amino acids being linked individually in the order mentioned or after prior formation of smaller peptide units.
The process according to the invention is characterized in that a La-amino-lower alkyl aminoacetic acid, a La-amino-lower alkyl acetic acid, L-tyrosine, a La-amino-lower alkyl acetic acid, L-histidine, L-proline and L-phenylalanine are used ter intermediate protection of amino or. Carb oxyl groups united with one another by condensation.
All free functional groups not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals which can be easily split off by hydrolysis or reduction, the amino group, for example, by the tosyl or trityl radical and in particular the carbobenzoxy group or colored protective groups such as the p-phenylazo-benzyloxy carbonyl group and the p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl group. The hydroxyl group of the tyrosyl does not necessarily have to be protected during the reaction.
The conversion of a protected amino group into a free amino group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for the preparation of the heptapeptido and intermediate products can be carried out according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
Depending on the method of operation, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts.
The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids.
The heptapeptides obtained according to the method can be used as blood pressure-increasing agents in the form of pharmaceutical preparations.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1 a) N-Carbobenzyloxy-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl
L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester
775 mg (0.001 mol) of L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester, prepared according to Example 2 of Switzerland. Patent No.
358 341 and 462 mg (0.0015 mol) of Na-carbobenzyl oxy-L-arginine are dissolved or suspended in 5 ml of freshly distilled dimethylformamide and, in addition, 0.125 ml (0.0015 mol) of 12.0-n . given aqueous hydrochloric acid. After a short warming to 30, a clear solution appears. It is cooled to 0, 340 mg (0.00165 mol) of dicyclobexylcarbodiimide are added and the mixture is left to stand at 0 for 4 hours. After a further 10 hours at 20, 0.1 ml of glacial acetic acid is added, the mixture is left to stand for a further 1 hour and the dicyclohexylurea formed is then filtered off.
The filtrate is evaporated in a high vacuum at 40, dissolved in a little water, made alkaline with soda, while cooling with ice, and the cheesy precipitate is extracted with n-butanol.
After neutral washing and evaporation, 1.28 g of a crude product are obtained which, for purification in the methanol-water 1: 1 / chloroform system (phase volume 10 ml each), is subjected to a Craig distribution over 45 stages. 660 mg of a white powder are obtained from tubes 17 to 33 (max. At no. 24), which is hydrolyzed directly to the free peptide.
b) L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine
660 mg of N-carbobenzyloxy-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester are concentrated in 5 ml. Dissolved hydrochloric acid and heated to 40 for 70 minutes. After evaporation to dryness at 402 in a high vacuum, 630 mg of a powdery hydrochloride is obtained which is filtered through a weakly basic ion exchange column [Merck No. IInB (branded product), 0 = 12 mm, I = 13 cm] to release the peptide Use of methanol-water 1:
1 as a solvent. After evaporation of the methanol in vacuo and lyophilization, 510 mg of a colorless powder are obtained.
This crude product is by a Craig distribution in the n-butanol / 0.3-m system. Ammonium acetate solution (pH 7.0) distributed over 63 levels. From tubes 17 to 32 (max. At No. 24; G = 0.62), after evaporation to dryness and sublimation of the buffer in a high vacuum at 45, a total of 280 mg of L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl- L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine as a colorless, amorphous powder with a temperature of approx. 200 (with decomposition). The compound is easily soluble in water and methanol.
In the paper chromatogram it shows in the systems tert-amyl alcohol-triethylamine-veronal-water-isopropanol (100: 0, 8: 1, 8: 50:40) and sec-butanol-veronal sodium-water-isopropanol ( 100: 0, 5: 70: 15) uniform spots with Rf values of 0.51 and 0.69, respectively.
(Positive to Pauly's reagent and ninhydrin.)
Example 2 a) N-carbobenzyloxy-nitroo-L-argit2yl-L-vcslyl-
L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl alanine methyl ester
775 mg (0.001 mol) of L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester, prepared according to Example 2 of Switzerland. Patent No.
358431, and 565 mg (0.00275 mol) of dicyclohexylcarbodiimide are dissolved in 2 ml of dimethylformamide and 10 ml of acetonitrile, and 882 mg (0.0025 mol) of N-carbobenzyloxy-nitro-L-arginine, dissolved in a little dimethylformamide, are added dropwise . A crystalline precipitate of dicyclohexylurea quickly forms and the mixture is left to stand overnight at room temperature. After adding 0.2 ml of glacial acetic acid, the mixture is left to stand for another hour, then filtered and washed with a little methanol. The filtrate is evaporated to dryness in a high vacuum, dissolved in butanol, washed with ice-cold soda solution and then with water until neutral and evaporated to dryness.
1.6 g of a crude mixture are obtained which is distributed over 60 stages in the methanol-water-chloroform-benzene 3: 1: 3: 1 system.
(Phase volume of 10 ml each.) The contents of tubes 10 to 21 yield 900 mg of material when evaporated to dryness, which is used for hydrogenation. b) L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester
900 mg of N-carbobenzyloxy-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester in 10 ml of methanol and 5 ml of 1-n . Hydrochloric acid (dissolved in methanol) and, after the addition of 300 mg of palladium carbon (10%), hydrogenated to a standstill, with absorption of the carbon dioxide that forms. The uptake of a little more than 5 mol l of hydrogen is complete after 6 hours. The catalyst is filtered off, the colorless filtrate is evaporated and dried in a high vacuum at 40 ° to constant weight.
890 mg of a white powder (mixture of heptapeptide methyl ester trihydrochloride and ammonium chloride) which can be directly hydrolyzed is obtained. c) L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl L-prolyl-L-phenylalanine
890 mg of crude methyl ester are dissolved in 6 ml of concentrated, aqueous hydrochloric acid and heated to 40 over an hour. It is then evaporated to dryness in a high vacuum at 40 (duration approx.
20 minutes), dissolved in a little water and slowly filtered through a column of weakly basic Ianevausr exchanger [Merck II (branded product), in the acetate form; Ï = 12.5 mm, 1 = 13 cm]. The aqueous eluate is lyophilized and the resulting 770 mg of crude product is distributed over 100 levels in the n-butanol-water system. (Phase volume jo 10 ml.) From tubes 6 to 17 (maximum at No. 11; G = 0.13) a total of 484 mg of pure L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L is obtained - histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine monoacetate.