Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide
Als Peptide mit Hypertensinwirkung sind das im Pferdeserum vorkommende Dekapeptid Hypertensin I mit der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure, L-Arginin, L-Valin, L-Tyrosin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Leucin, als Ileu5-Hypertensin 1 bezeichnet, und das im Rinderserum vorkommende Val5-Hyperten- sin I, ebenfalls ein Dekapeptid, das sich von dem vorher genannten nur durch die fünfte Aminosäure, L-Valin, unterscheidet, bekannt. Aus Pferdeserum wurde ferner ein Oktapeptid, Ileu5-Hypertensin II, isoliert, das sich vom entsprechenden Hypertensin 1 durch Fehlen der 9. und 10.
Aminosäure unterscheidet und mittels eines im Serum vorhandenen Enzyms aus dem Dekapeptid gebildet wird. Offensichtlich wäre es für die Synthese von hypertensinwirksamen Verbindungen ein grosser Vorteil, wenn gewisse Aminosäuren durch einfachere und ver fahrensmässig günstigere Aminosäuren ersetzt werden könnten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide der Formel
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worin Ri eine Aminoniederalkylgruppe und R2 eine Niederalkylgruppe bedeuten.
Oberraschenderweise zeigen die genannten Oktapeptide eine gute Hypertensinwirkung, insbesondere das Glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin. Die genannten Oktapeptide bieten insofern bedeutende technische Vorteile gegenüber den bekannten Hypertensinen, als sie sehr viel leichter und billiger herstellbar sind.
Als Reste einer a-Aminoniederalkyl-aminoessigsäure seien Arginyl, Ornithyl und Lysyl, als Reste einer a-Amino-niederalkylessigsäure Valyl und Norvalyl, ferner Leucyl, Isoleucyl und Norleucyl sowie Alanyl genannt.
Die neuen Peptide können nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Glycyl-L-a-aminoniederalkylaminoessigsäure, eine L-a-Amino-niederalkylessigsäure, L-Tyrosin, eine L-a-Amino-niederalkylessigsäure, L-Histidin, L-Prolin und L-Phenylalanin unter intermediärem Schutz von Amino-bzw. Carboxylgruppen miteinander durch Kondensation vereinigt.
Zweckmässig werden alle an der Reaktion nicht beteiligten freien funktionellen Gruppen geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Aminogruppe beispielsweise durch den Tosyl-oder Tritylrest und insbesondere die Carbobenzoxygruppe oder farbige Schutzgruppen, wie die p-Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und die p- (p'-Methoxy-phenylazo)-benzyl- oxy-carbonylgruppe. Die Hydroxylgruppe des Tyrosyls muss bei der Reaktion nicht notwendigerweise geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die tuber- führung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Oktapeptide und Zwischenprodukte kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln erfolgen.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze gewinnen.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Oktapeptide können als blutdrucksteigernde Mittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Im nachfolgenden Beispiel sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel a) N-Carbobenzyloxy-giycyl-nitro-L-arginin.
1,35 g (0,005 Mol) fein pulverisiertes Nitro-L- arginin-methylester-hydrochlorid wird in 7 ml Dimethylformamid suspendiert und nach Zugabe von 1,21 ml (0,0051 Mol) Tributylamin bis zur vollständigen Auflösung gerührt. Sodann gibt man auf einmal 1,85 g (0,009 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid und 1,46 g (0,007 Mol) N-Carbobenzyloxy-glycin in fester Form zu und lässt bei Zimmertemperatur über Nacht stehen. Nach Zugabe von 0,5 ml Eisessig wird nochmals 1 Stunde stehengelassen, dann vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff (1,6 g) abfiltriert, im Hochvakuum nahezu zur Trockne eingedampft und in Essigester aufgenommen. Es wird nun nacheinander mit 2n Salzsäure, 2n Natriumcarbonat (eiskalt) und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält 2,8 g rohen.
N-Carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginin-methylester, der wie folgt verseift wird :
2,8 g Methylester werden in 10 ml Methanol gelöst und im Laufe von 1 Stunde bei 20 10 ml ln wässrige Natronlauge zugetropft. Nach beendigtem Zutropfen wird noch 1/2 Stunde weitergerührt, dann von ein wenig ungelöstem Material (= Dicyclohexylharnstoff) abfiltriert und das Filtrat durch Zugabe von 10,5 ml ln Salzsäure angesäuert. Die dabei ausfallende ölige Substanz wird mit n-Butanol extrahiert, die Butanolphase mit Wasser gewaschen und zur Trockne eingedampft. Beim Zerreiben mit Essigester tritt Kristallisation ein.
Man erhält g N-Carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginin vom F. 135 bis 138 . Beim einmaligen Umkristallisieren aus heissem Methanol'erhält man 1,22 g Substanz vom F. 142-144 . b) N-Carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginyl L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-
L-phenylalanin-methylester.
775 mg (0,001 Mol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester, hergestellt gemäss Beispiel 2 des schweiz. Patentes Nr. 358 431, und 474 mg (0,0023 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid und 10 ml Acetonitril gelöst und dazu 820 mg (0,002 Mol) N-Carbo-benzyloxy-glycyl-nitro-L- arginin, gelöst in 2 ml Dimethylformamid, gegeben.
Das Gemisch wird über Nacht bei 20 stehengelas- sen. Nach Zugabe von 0, 2 ml Eisessig wird nochmals eine Weile stehengelassen und dann vom auskristallisierten Dicyclohexyl-harnstoff (450 mg) abfiltriert. Das Filtrat wird im Hochvakuum bei 40 so weit wie möglich eingedampft, dann in n-Butanol aufgenommen und die organische Schicht nacheinan- der mit Sodalösung (eiskalt) und Wasser gewaschen und ohne zu trocknen bei 50 Badtemperatur im Vakuum auf ungefähr die Hälfte eingeengt. Dabei fällt ein feinkörniger Niederschlag aus, der abfiltriert, mit Essigester gewaschen und bei 50 getrocknet wird.
Man erhält so 828 mg N-Carbobenzyloxy- glycyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester vom F. etwa 160 (Zersetzung), der zur im folgenden beschriebenen Weiterverarbeitung genügend rein ist.
Das Butanolfiltrat liefert beim weiteren Einengen nur noch wenig und unreines Material. c) Glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-
L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methyl- ester.
828 mg N-Carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginyl L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin-methylester werden in 10 ml Methanol und 4,2 ml ln Salzsäure (in Methanol) gelöst und nach Zugabe von 300 mg Katalysator (Palladiumkohle 10 au) unter Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Nach Aufnahme von 5,1 Mol Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand (Dauer 12 Stunden), und es wird vom Katalysator abfiltriert, im Vakuum einge- dampft und im Hochvakuum bei 40 getrocknet.
Man erhält 763 mg eines amorphen Pulvers (Gemisch von Oktapeptid-methylester-trihydrochlorid und Ammoniumchlorid), das direkt zur im folgenden beschriebenen Hydrolyse verwendet wird. d) Glycyl-L-arginyl-L=valyl-L-tyrosyl-L-valyl- L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin.
760 mg roher Methylester werden in 5 ml konzentrierter, wässriger Salzsäure gelöst und 1 Stunde bei 40 gehalten. Nach Eindampfen zur Trockne im Hochvakuum erhält man 750 mg eines pulverigen Hydrochlorids, das in wenig Wasser gelöst und durch einen schwach basischen Ionenaustauscher filtriert wird. [ Merck II (Markenprodukt) als Acetat ; Säule mit (P = 12,5 mm, 1 = 12 cm]. Das Filtrat ergibt beim Lyophilisieren 675 mg Rohpro- dukt, das in einer Craig-Verteilung (System : n-Buta nol-Wasser-Methanol 5 : 5 : 1 ; Phasenvolumen je 10 ml) über 60 Stufen gereinigt wird.
Aus Röhrchen 6-19 (Max. bei Nr. 12 ; G = 0,26) werden 562 mg reines Glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-monoacetat isoliert.
Die Verbindung ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol, schwerlöslich in Äthanol. Sie wird aus der wässrigen Lösung durch Zugabe von gesättigter Natriumchloridlösung ausgefällt. F. etwa 220 (Zersetzung). Im Papierchromatogramm (absteigend auf Whatman Nr. 3) werden einheitliche Flecken erhalten, die positiv auf Pauly-Reagens und Ninhydrin sind. Im System tert. Amylalkohol-Triäthylamin- Veronal-Wasser-Isopropanol (100 : 0,8 : 1,8 : 50 : 40) erhält man Rf = 0, 48, in sek.-Butanol-Monochlor- essigsäure-Wasser-Isopropanol (70 : 3 : 40 : 10) = 0,44.
Process for the production of new octapeptides
The decapeptide hypertensin I, which occurs in horse serum and has the amino acid sequence L-aspartic acid, L-arginine, L-valine, L-tyrosine, L-isoleucine, L-histidine, L-proline, L-phenylalanine, L-histidine, are peptides with hypertensin effects , L-leucine, referred to as Ileu5-hypertensin 1, and Val5-hypertensin I, which occurs in bovine serum, is also a decapeptide which differs from the previously mentioned only in the fifth amino acid, L-valine. An octapeptide, Ileu5-Hypertensin II, was also isolated from horse serum, which is different from the corresponding Hypertensin 1 due to the absence of the 9th and 10th grade.
Amino acid and is formed from the decapeptide by means of an enzyme present in the serum. Obviously it would be of great advantage for the synthesis of hypertensin-active compounds if certain amino acids could be replaced by simpler amino acids which are more advantageous in terms of process.
The present invention now relates to a method for producing new octapeptides of the formula
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where Ri is an amino lower alkyl group and R2 is a lower alkyl group.
Surprisingly, the mentioned octapeptides show a good hypertensin effect, in particular glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine. The octapeptides mentioned offer significant technical advantages over the known hypertensins insofar as they are much easier and cheaper to produce.
Arginyl, ornithyl and lysyl are mentioned as residues of an α-amino-lower alkyl-aminoacetic acid, and valyl and norvalyl as residues of an α-amino-lower alkyl-aminoacetic acid, and also leucyl, isoleucyl and norleucyl and alanyl.
The new peptides can be obtained by the methods known for peptide production, the amino acids being linked individually in the order mentioned or after prior formation of smaller peptide units. The inventive method is characterized in that a glycyl-La-amino-lower alkylaminoacetic acid, a La-amino-lower alkylacetic acid, L-tyrosine, a La-amino-lower alkyl acetic acid, L-histidine, L-proline and L-phenylalanine with intermediate protection of amino -or. Carboxyl groups combined with one another by condensation.
All free functional groups not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals that can be easily split off by hydrolysis or reduction, the amino group, for example, by the tosyl or trityl radical and in particular the carbobenzoxy group or colored protective groups such as the p-phenylazo-benzyloxycarbonyl group the p- (p'-methoxy-phenylazo) -benzyl-oxy-carbonyl group. The hydroxyl group of the tyrosyl does not necessarily have to be protected during the reaction.
The conversion of a protected amino group into a free amino group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for preparing the octapeptides and intermediates can be carried out by methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts.
The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids.
The octapeptides obtained according to the method can be used as blood pressure-increasing agents in the form of pharmaceutical preparations.
In the following example, the temperatures are given in degrees Celsius.
Example a) N-carbobenzyloxy-giycyl-nitro-L-arginine.
1.35 g (0.005 mol) of finely powdered nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride is suspended in 7 ml of dimethylformamide and, after addition of 1.21 ml (0.0051 mol) of tributylamine, stirred until it is completely dissolved. 1.85 g (0.009 mol) of dicyclohexylcarbodiimide and 1.46 g (0.007 mol) of N-carbobenzyloxy-glycine in solid form are then added all at once, and the mixture is left to stand overnight at room temperature. After adding 0.5 ml of glacial acetic acid, the mixture is left to stand for another hour, then the dicyclohexylurea (1.6 g) which has crystallized out is filtered off, evaporated to almost dryness under high vacuum and taken up in ethyl acetate. It is then washed successively with 2N hydrochloric acid, 2N sodium carbonate (ice cold) and water, dried with sodium sulfate and evaporated. 2.8 g of crude are obtained.
N-carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginine methyl ester, which is saponified as follows:
2.8 g of methyl ester are dissolved in 10 ml of methanol and 10 ml of 1N aqueous sodium hydroxide solution are added dropwise over the course of 1 hour at 20. When the dropwise addition is complete, stirring is continued for a further 1/2 hour, then a little undissolved material (= dicyclohexylurea) is filtered off and the filtrate is acidified by adding 10.5 ml of 1N hydrochloric acid. The oily substance which precipitates out is extracted with n-butanol, the butanol phase is washed with water and evaporated to dryness. Crystallization occurs when rubbed with ethyl acetate.
One receives g of N-carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginine with a melting point of 135 to 138. A single recrystallization from hot methanol gives 1.22 g of substance with a melting point of 142-144. b) N-carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginyl L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-
L-phenylalanine methyl ester.
775 mg (0.001 mol) of L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester, prepared according to Example 2 of Switzerland. Patent No. 358 431, and 474 mg (0.0023 mol) of dicyclohexyl-carbodiimide are dissolved in 2 ml of dimethylformamide and 10 ml of acetonitrile and 820 mg (0.002 mol) of N-carbo-benzyloxy-glycyl-nitro-L-arginine, dissolved in 2 ml of dimethylformamide, given.
The mixture is left at 20 overnight. After adding 0.2 ml of glacial acetic acid, the mixture is left to stand for a while and the dicyclohexyl urea (450 mg) which has crystallized out is then filtered off. The filtrate is evaporated as much as possible in a high vacuum at 40, then taken up in n-butanol and the organic layer washed successively with soda solution (ice-cold) and water and concentrated to about half at a bath temperature without drying. A fine-grain precipitate separates out, which is filtered off, washed with ethyl acetate and dried at 50.
This gives 828 mg of N-carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester with a temperature of about 160 (decomposition) which is sufficiently pure for further processing described below.
The butanol filtrate provides little and impure material when it is further concentrated. c) Glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-
L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester.
828 mg of N-carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginyl L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine methyl ester are dissolved in 10 ml of methanol and 4.2 ml Dissolved in hydrochloric acid (in methanol) and, after addition of 300 mg of catalyst (palladium / carbon 10 au), hydrogenated with absorption of carbon dioxide. After uptake of 5.1 mol of hydrogen, the hydrogenation comes to a standstill (duration 12 hours), and the catalyst is filtered off, evaporated in vacuo and dried at 40 in a high vacuum.
763 mg of an amorphous powder (mixture of octapeptide methyl ester trihydrochloride and ammonium chloride) are obtained, which is used directly for the hydrolysis described below. d) Glycyl-L-arginyl-L = valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanine.
760 mg of crude methyl ester are dissolved in 5 ml of concentrated, aqueous hydrochloric acid and kept at 40 for 1 hour. After evaporation to dryness in a high vacuum, 750 mg of a powdery hydrochloride are obtained, which is dissolved in a little water and filtered through a weakly basic ion exchanger. [Merck II (branded product) as acetate; Column with (P = 12.5 mm, 1 = 12 cm). On lyophilization, the filtrate gives 675 mg of crude product, which in a Craig distribution (system: n-butanol-water-methanol 5: 5: 1; Phase volume 10 ml each) is purified over 60 stages.
From tubes 6-19 (max. For no. 12; G = 0.26) 562 mg of pure glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L are obtained -phenylalanine monoacetate isolated.
The compound is easily soluble in water, soluble in methanol, sparingly soluble in ethanol. It is precipitated from the aqueous solution by adding saturated sodium chloride solution. F. about 220 (decomposition). Uniform spots positive for Pauly's reagent and ninhydrin are obtained in the paper chromatogram (descending to Whatman No. 3). In the system tert. Amyl alcohol-triethylamine-veronal-water-isopropanol (100: 0.8: 1.8: 50: 40) one obtains Rf = 0.48, in sec-butanol-monochloroacetic acid-water-isopropanol (70: 3: 40:10) = 0.44.