Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der Formel
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in der X einen ss-Oxymethylenrest oder Carbonyl- rest, Y Wasserstoff, Fluor, Chlor oder Brom, und R Wasserstoff, Fluor, Hydroxyl oder einen Acyl- oxyrest einer Carbonsäure darstellen.
Ausgangsstoffe für das erfindungsgemässe Ver fahren sind Verbindungen der Formel II:
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In dieser bedeutet X einen Carbonylrest (>C=O) oder einen ss-Oxymethylenrest (>CHOH), Y Wasser stoff, Fluor, Chlor oder Brom, R Wasserstoff, Fluor, Hydroxyl oder einen Acyloxyrest einer organischen Carbonsäure, vorzugsweise einer Kohlenwasserstoff- Carbonsäure mit 1 bis einschliesslich 12 C-Atomen.
Die neuen Verbindungen besitzen die wertvolle antirheumatisch-arthritische, entzündungshemmende und glukocorticoide Wirkung der Ausgangsverbin dungen, vereinigt mit günstigen mineralcorticoiden Eigenschaften. Die neuen Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Entzündungen der Haut, der Augen und Ohren, Kontaktdenmatitis und andern allergischen Reaktionen.
Sie können bei oraler An wendung in üblichen Dosierungsformen, wie Pillen, Tabletten und Kapseln, bei parenteraler Anwendung in den üblichen flüssigen Formen verabreicht werden, wie sie bei natürlichen und synthetischen Cortical- steroidhormonen verwendet werden. Bei örtlicher Anwendung können sie in Form von Salben, Cremen, Lotionen und dergleichen angewendet werden, und zwar mit oder ohne andere wirksame Antibiotica, keimtötende Mittel und dergleichen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekenn zeichnet, dass man Verbindungen der Formel 1I
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in 1,2-Stellung dehydriert. Die Dehydrierung kann entweder fermentativ oder chemisch erfolgen. Die fermentative Dehydrierung erfolgt durch An wendung von Mikroorganismen, wie Septomyxa, Corynebacterium, Fusarium und dergleichen unter bekannten Gärungsbedingungen (vgl.
USA-Patent schrift Nr.<B>2602769).</B> Bei der Dehydrierung mit Septomyxa ist es vorteilhaft, zusammen mit dem Sub strat und Gärungsmedium einen Steroidpromotor, wie Progesteron, 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, 3-Ketobisnorcholensäure, 11 ss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und dergleichen zu verwenden. Im allgemeinen wer den bei der fermentativen Dehydrierung die freien Alkohole als Ausgangsstoff verwendet.
Doch kön nen auch die 21 Acylate, wie das 21-Acetat, 21-Pro- pionat, 21-Butyrat, 21-Isobutyrat oder 21-Hemi- succinat, verwendet werden. In diesen Fällen wird die 21-Estergruppe im allgemeinen während des Gärungsvorganges verseift. Der entstandene freie 21-Alkohol kann gegebenenfalls nach bekannten 21- Acylierungsverfahren reacyliert werden.
Die chemische Dehydrierung kann mit Selen dioxyd, ebenfalls nach bekannten Verfahren, durch geführt werden [Meystre und Mitarbeiter, Helv. Chem. Acta, Band 39, S. 734 (1956)]. Bei der chemischen Dehydrierung werden vorzugsweise die 21-Acylate als Ausgangsstoff verwendet, die das ent sprechende 2a-Methyl-6-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion-21-acylat ergeben.
Das so erhaltene 21-Acylat kann gegebenen falls nach bekannten Verfahren zu dem freien 21- Alkohol verseift werden.
Diese Acylierung der 21-Alkohole kann nach be kannten Veresterungsmethoden durchgeführt werden, z. B. durch Umsetzung mit einem Säurehalogenid, wie dem Säurechlorid oder Säurebromid, oder dem Anhydrid einer organischen Karbonsäure, oder durch Umsetzung mit der gewählten Säure in Gegenwart eines Veresterungskatalysators, z. B.
p-Toluolsulfonylchlorid, Trifluoracetanhydrid, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Schwefelsäure, oder mit einem Ester unter Esteraustausch-Reak- tionsbedingungen. Reaktionsbedingungen, die die labile 11-Hydroxylgruppe oder die 6-Halogengruppe angreifen können, sind hierbei zu vermeiden. Die so hergestellten 21-Acylate können nach be kannten Verfahren zu den entsprechenden 21-Hy- droxylverbindungen hydrolysiert werden.
Ein bevor zugtes Verfahren besteht darin, mindestens ein Mol- äquivalent eines Alkalimetallbikarbonates in einer im wesentlichen sauerstofffreien Lösung eines Gemisches aus einem niederen Alkanol und Wasser zu verwen den. Die Hydrolyse wird zwischen 10 und 30 durch geführt; das Gemisch ist vor atmosphärischem Sauer stoff zu schützen. Wenn die Hydrolyse beendet ist, wird das Reaktionsgemisch mit einer Säure, z. B.
Essigsäure, neutralisiert und das hydrolysierte Pro dukt aus dem Reaktionsgemisch durch Verdampfen und Kristallisieren, Extraktion mit Methylenchlorid oder dergleichen gewonnen.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen sind durch die Anwesenheit eines 6-Fluorsubstituen- ten gekennzeichnet. Das Fluor kann sich entweder in 6a- oder 6ss-Stellung befinden. Arbeitet man unter Einhaltung fast neutraler Bedingungen, so erhält man als Endprodukt das entsprechende 6ss-Epimere. Wer den als Ausgangsmaterial das 6/3-Epimere oder Ge mische, in denen es dominiert, verwendet, so kann jedes nachfolgende Reaktionsprodukt entweder als 6@-Epimeres oder als Gemisch von 6a- und 6/3- Epimeren isoliert werden.
Ein 6a-epimerisiertes Pro dukt kann durch Behandlung des 6ss-Epimeren oder von Gemischen aus 6a- und 6ss-Epimeren mit Halo genwasserstoff, wie Chlorwasserstoffgas, bei Tempe raturen nahe 0 in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid oder Äther, in Ge genwart eines Protonen liefernden Mittels, wie Alko holen oder organischen Säuren, erhalten werden. Das Gemisch sollte nahe bei 0 gehalten werden, jedoch können auch während der Zugabe der Säure etwas höhere oder niedrigere Temperaturen angewendet werden.
Das Reaktionsgemisch wird dann nacheinan der mit verdünntem Alkali und Wasser gewaschen, getrocknet und unter verringertem Druck verdampft. Die 6a-Fluorprodukte werden aus dem rohen Reak tionsprodukt durch Umkristallisation gewonnen und gereinigt.
Die Epimerisierung kann auch mit Alkali durch geführt werden. Basen, z. B. Lösungen aus Natrium hydroxyd oder Kaliumhydroxyd, können zur Behand lung des 6ss-Epimeren in Lösung in einem organi schen Lösungsmittel, wie Methanol, verwendet wer den und ergeben das 6a-Epimere.
Verbindungen der Formel 1 mit R = Wasser stoff können z. B. nach folgendem Schema herge stellt werden:
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in dem R' einen organischen Rest, insbesondere einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis einschliesslich 10 C-Atomen, wie Methyl, Äthyl, Phenyl, Tolyl oder Naphthyl, darstellt, wobei Methyl bevorzugt ist.
Danach wird ein in der 11-Stellung Sauerstoff enthaltendes 2a-Methyl-6-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion III mit einem organischen Sulfonylhalogenid behandelt und bildet den entsprechenden 21-Ester IV.
Das 21-Alkyl- oder Arylsulfonat IV wird sodann mit einem Jodierungsmittel zum entsprechenden 21-Jod- steroid V umgesetzt, das mit einem reduzierenden Mittel zum 2a-Methyl-6-fluor-1 lss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion 1I dehalogeniert wird.
Das so erhaltene 2a-Methyl-6-fluor-1 lss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion wird sodann erfindungsgemäss zu dem entsprechenden 2-Methyl-6-fluor-1 Iss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion I dehydriert.
Die erfindungsgemässe Dehydrierung des in der 11-Stellung Sauerstoff enthaltenden 2a-Methyl-6 fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,20-dions, z. B. des 2a-Methyl 6-fluor-1 lss,17a-oxy-4-pregnen- 3,20-dions und 2a-Methyl-6 fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trions, zu den entsprechenden 1-Dehydroverbindungen, z. B.
2-Methyl-6-fluor-1 lss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion und 2-Methyl-6-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion erfolgt fermentativ durch Mikroorganismen, wie Septomyxa, Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria,
Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium, Leptosphaeria, Cucurbitaria, Nocardia und Pilze der Familie Tuberculariaceae unter bekannten Gärbedingungen, vgl. USA-Patent- schrift Nr. 2 602 769.
Bei Verwendung von Septomyxa zur Dehydrie- rung ist es vorteilhaft, im Substrat und Gärmedium einen Steroidpromotor, wie Progesteron, 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, 3-Ketobisnorcholensäure, 11ss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und dergleichen zu verwenden.
Die chemische Dehydrierung kann z. B. mit Selen dioxyd nach bekannten Verfahren (z. B. Mystre und Mitarbeiter, Helv. Chim. Acta, Band 39, S. 734 [1956]) durchgeführt werden.
6a-Fluor- und 6ss-Fluorsteroidverbindungen der Formel I mit R = Fluor können nach folgendem Reaktionsschema hergestellt werden:
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in dem R' die bereits angegebene Bedeutung hat. Zur Herstellung dieser Verbindungen wird z. B.
ein 21-Alkyl- oder Arylsulfonat VI mit einem Fluo- rierungsmittel behandelt und bildet das entsprechende 2a-Methyl-6,21-difluor-11ss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion.
Das 2a-Methyl-6,21-difluorprodukt kann gegebenen falls zum entsprechenden 2a-Methyl-6,21-difluor-17a-4-pregnen- 3,11,20-trion oxydiert werden. Auch das 2a-Methyl76-fluor-1 lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion VII kann zum 21-Fluorsteroid fluoriert werden.
Das so hergestellte 2a-Methyl-6,21-difluor-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6,21-diuor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20 trion wird dann erfindungsgemäss durch fermentative oder chemische Dehydrierung zum entsprechenden 2-Methyl 6,21-difluor-11ss,17a-dioxy-1,4- pregnadien-3,20-dion oder 2-Methyl-6,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien 3,11,
20-trion in 1-Stellung dehydriert, wobei analog wie bei den 21-Desoxyverbindungen vorgegangen wird. 6a-Fluor- und 6ss Fluorsteroidverbindungen der Formel I mit' Y = Halogen können nach folgendem Reaktionsschema hergestellt werden:
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in dem Y' Halogen ist und R' die bereits angegebene Bedeutung hat.
Nach vorstehendem Verfahren wird z. B. 2a-Methyl-6 fluor-9a-halogen-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion VIII mit einem organischen Sulfonylhalogenid behandelt, wobei der entsprechende 21-Ester IX erhalten wird.
Darauf wird das so hergestellte 21-Alkyl oder Aryl- sulfonat mit einem Jodierungsmittel zum entspre chenden 2a-Methyl-6 fluor-9a-halogen-11ss,17a-dioxy- 21-jod-4-pregnen-3,20-dion X und dieses schliesslich mit einem reduzierenden Mittel zum 2a-Methyl-6 fluor-9a-halogen-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,
20-dion II umgesetzt. Das Produkt 1I kann gegebenenfalls zum entsprechenden 2a-Methyl-6-fluor-9a-halogen-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion oxydiert werden.
Das so hergestellte 2a-Methyl-6-fluor-9a-halogen-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6-fluor-9a-halogen 17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion wird dann erfindungsgemäss durch fermentative oder chemische Dehydrierung in der 1-Stellung dehydriert, wobei das entsprechende 2-Methyl-6-fluor-9a-halogen-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,
20-dion I oder das entsprechende 2-Methyl 6-fluor-9 halogen-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-dion erhalten wird.
Die Dehydrierung erfolgt fermentativ oder che misch in der bereits beschriebenen Weise.
6a-Fluor- und 6ss-Fluorsteroidverbindungen der Formel I, in der R = Fluor und Y = Halogen ist, können nach folgendem Schema hergestellt werden:
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in dem R' die bereits angegebenen Bedeutungen hat und Y Halogen ist.
Das Verfahren besteht darin, dass das 2a-Methyl 6 fluor-9a-halogen-llss,17a-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-alkyl- oder -arylsulfonat XI mit einem Fluorierungsmittel behandelt wird, wo durch das entsprechende 2a-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-l lss,17a- dioxy 4-pregnen-3,20-dion II erhalten wird.
Das 6,21-Difluorprodukt kann gege benenfalls zum entsprechenden 2a-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion oxydiert werden. Auch das 2a-Methyl-6-fluor-8a-halogen-1 lss,17a-dioxy- 21 jod 4-pregnen-3,20-dion kann zum 21-Fluorsteroid 1I fluoriert werden.
Das so hergestellte 2a-Methyl-6,2l-difluor-9a-halogen-1 lss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion wird durch fermentative oder chemische Dehydrie- rung in der 1-Stellung dehydriert, und man erhält das entsprechende 2-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-11ss,17a- dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion oder das entsprechende 2-Methyl-6,
21-difluor-9a-halogen-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion. Auch hier schliesst sich sodann die erfindungs gemässe Dehydrierung in der bereits beschriebenen Weise an.
<I>Präparat 1:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-l lss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion.
278 mg (0,637 Millimol) 2a-Methyl-6a-fluor 11ss,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion- 21-acetat wurden in 30 cm3 Methylalkohol gelöst. Diese Lö sung wurde von Luft befreit, indem man 5 Minuten lang Stickstoff hindurchleitete. Eine Lösung aus 150 mg Kaliumbikarbonat in 3 cm3 Wasser wurde ebenfalls mit Stickstoff luftfrei gemacht und der Steroidlösung hinzugefügt. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt und 5 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre gehalten.
Durch Zu gabe von zwei Tropfen Eisessig wurde das Reak tionsgemisch schwach sauer gemacht und dann mit 30 cm3 Wasser verdünnt. Durch Destillation bei ver mindertem Druck wurde das Methanol entfernt. Das Produkt wurde aus dem wässrigen Gemisch dreimal mit je 10 cm3 Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft.
Er ergab 100 mg (0,254 Millimol) 2a-Methyl-6a-fluor-I lss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion, einen weissen kristallinen Stoff, der bei 200-206' schmilzt.
<I>Beispiel 1</I> 2-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm- eines aus 10/9 Glukose, 2% Maisquellwasser (601/o Feststoffe) und Leitungswasser bestehenden Nähr mediums werden auf einen pH-Wert von 4,9 einge stellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem ein, bis zwei Tage alten vegetativen Wachstum von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raum temperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 10 Liter des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquell wasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasser bad von 28 gestellt, der Inhalt kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luftlmin/10 1 Gär- medium). Nach 20stündiger Inkubationszeit, nachdem sich ein<I>gutes</I> Wachstum entwickelt hat, fügt man 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion und 1/2 g in 16 cm3 Dimethylformamid gelöstes 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al zu.
Die Inkubation wird bei der gleichen Temperatur (28 ) und die Belüftung 72 Stunden (bis zu einem endgültigen pH-Wert von 8,3) durchgeführt. Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gär- medium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert. Darauf werden die Acetonextrakte und die des Nährmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der er haltene Rückstand wird durch Chromatographie über einer Säule aus wasserfreiem, synthetischem Magne- siumsilikat (Florisil) und Umkristallisation aus Hexan- kohlenwasserstoffen gereinigt.
Man erhält kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. Anstelle von Septomyxa können auch andere Arten, wie Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium,
Leptosphaeria, C.icurbitaria, Nocardia oder Enzyme von Pilzen der Familie Tuberculariaceae zur Einführung einer dl-Bindung in das 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion verwendet werden.
Diese Verbindung wird wie folgt zum 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-acetat umgesetzt: 50 mg 2-Methyl-6a-fluor-llss,l7a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion werden in 1 cm3 Pyridin und 1 cm3 Essigsäure anhydrid gelöst.
Diese Lösung wird 21 Stunden bei Raumtemperatur abgestellt und darauf in Eiswasser gegossen, wodurch man kristallines 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-acetat erhält, das durch Umkristallisation aus Hexan- kohlenwasserstoff gereinigt werden kann.
2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat: 0,5 g Succinsäureanhydrid und 0,1 g 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion werden in 5 cm3 Pyridin gelöst. Diese Lösung wird 20 Stunden abgestellt, mit Wasser verdünnt, das Ge misch gekühlt und filtriert.
Das auf einem Filtrier papier gesammelte Ausfällprodukt wird zweimal aus Methanol umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat. 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat- natriumsalz:
Zu einer Lösung von 100 mg 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat in 2 cm3 Aceton wird langsam unter Rühren so lange Natriumhydroxydlösung (0,1 normal) zugefügt, bis der pH-Wert auf etwa 7,4 gestiegen ist. Während die Natriumhydroxydlösung zugefügt wird, werden zugleich 5 cm3 Wasser zugegeben.
Die Lösung wird dann bei 25 unter Vakuum zur Entfernung des Acetons konzentriert. Die erhaltene wässrige Lösung aus 2-Methyl-6a-fluor-l lss,l7a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat- natriumsalz wird filtriert und durch Gefrieren getrocknet, wo durch man reines 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat- natriumsalz erhält.
<I>Beispiel 2</I> 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion Fünf 250-cm?>-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm?, eines aus 1 a/Q Glukose, 2 % Maisquellwasser (60 % Feststoffe) und Leitungswasser bestehenden Nähr mediums werden auf einen pH-Wert von 4,9 einge stellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten mit einem Druck von 1,05 kg/cm9 sterilisiert und mit einem ein bis zwei Tage alten Wachstum von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyer- kolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden diese 500 cm3 als Impfstoff für 10 1 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Ge misch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, ver wendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt; der Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/Minute/10 1 Gärmedium). Die Inkubation wird bei der gleichen Temperatur (28 ) und die Belüftung 72 Stunden (bis zu einem endgültigen pH-Wert von 8,3) durchge führt.
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird darauf dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, dann werden die Acetonextrakte und die des Gär- mediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat gärocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über einer Säule aus wasserfreiem synthetischem Magnesiumsilikat und Umkristallisation aus Hexankohlenwasserstoffen ge reinigt und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
Die Verbindung wird wie folgt zum 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion-21-acetat umgesetzt: 50 mg 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion werden in 1 cm3 Pyridin und 1 cm3 Essigsäure anhydrid gelöst.
Diese Lösung wird 21 Stunden bei Raumtemperatur abgestellt und darauf in Eiswasser gegossen, wodurch man kristallines 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion-21-acetat erhält, das durch Umkristall'isieren aus Hexankohlen- wasserstoffen gereinigt werden kann.
<I>Beispiel 3</I> 2-Methyl-6ss-fluor-11 ss, l 7a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion Eine stöchiometrische äquivalente Menge 2a-Methyl-6ss-fluor-11 /3,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion wird anstelle von 2a-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion im Verfahren von Beispiel 1 verwendet und ergibt kristallines 2-Methyl-6ss fluor-llss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,
20-dion. <I>Beispiel 4</I> 2-Methyl-6ss-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion Eine stöchiometrisch äquivalente Menge 2a-Methyl-6ss-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion wird anstelle von 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 4-pregnen-3,11,20-trion im Verfahren des Beispiels 2 verwendet und ergibt kristallines 2-Methyl-6ss-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 5</I> Isomerisierung von 2 - Methyl - 6ss-fluor-11 ss,17a,21- trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion zu 2-Methyl-6a-fluor- 11/3,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion Eine Lösung von 0,150 g 2-Methyl-6ss-fluor-11 P,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion in 12 cm3 Chloroform und 0,1 cm3 absolutem Alkohol wird in einem Eis-Kochsalz-Gemisch auf -10 abgekühlt;
ein Strom wasserfreien Chlorwasser stoffes wird etwa 2,5 Stunden lang langsam durch die Lösung geleitet, während die Temperatur zwi schen etwa -5 und -15 gehalten wird. Darauf wird die Lösung mit verdünntem Natriumbikarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Die Umkristallisation des Rückstandes aus Hexankohlenwasserstoffen ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. <I>Präparat 2:</I> 2a-Methyl 6a-fluor-17a,21-dioxy- 4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-21-acetat. Zu einer Lösung von 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-1 1ss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion-21-acetat in 10 cm3 Pyridin werden 0,4 g N-Bromacetamid ge geben.
Das Gemisch wird etwa 20 Minuten in eine Stickstoffatmosphäre gebracht, worauf es auf 5 ab gekühlt wird. Unter Rühren wird wasserfreies Schwefeldioxyd über die Oberfläche geleitet, bis die Lösung mit angesäuertem Jod-Stärke-Papier keine Farbveränderungen mehr gibt. Während der Schwe- feldioxyd-Zugabe lässt man die Temperatur des Re aktionsgemisches nicht über 20\1 ansteigen. Das Ge misch wird dann etwa 5 Minuten abgestellt und dann in 100 cm3 Eiswasser gegossen, wobei ein roher Feststoff ausfällt.
Die Umkristallisation aus Aceton gibt kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-17a, 21-dioxy-4, 9 (11)- pregnadien-3,20-dion-21-acetat. <I>Präparat 3:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregn:
en-3,20-dion-21-acetat. Zu einer Lösung von 420 mg 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4,9(11)- pregnadien-3,20-dion-21-acetat in 6,5 cm3 Methylenchlorid werden 12,5 cm3 tert. Butylalkohol, eine Lösung von 1,0 cm3 72 % ige Perchlorsäure in 7,
5 cm3 Wasser und eine Lösung von 182 mg N-Bromacetamid in 3,2 cm3 tert. Butyl- alkohol gegeben. Nachdem etwa 15 Minuten gerührt worden ist, wurde eine Lösung von 182 mg Natrium sulfit in 10 cm3 Wasser zugefügt und das Gemisch unter vermindertem Druck bei etwa 60 eingedampft, bis eine Auskristallisierung stattfand. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wurden 30 cm-' Wasser unter Rühren zugefügt.
Das kristalline Produkt wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wo durch im wesentlichen reines 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-11 ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat erhalten wurde. Das Produkt wurde in dem nach folgenden Beispiel ohne weitere Reinigung verwendet.
<I>Präparat 4:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-9ss, l lss-oxido-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat. Ein Gemisch von 2,816 g 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat, 2,816g Kaliumacetat und 90 cm3 Aceton wird unter Rühren bei Rückflusstemperatur etwa 18 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf etwa die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingedampft und in einem Eisbad gekühlt.
Die Zugabe von 250 cm3 Wasser ergibt kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-9ss,11 ss-oxido-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat, das durch Umkristallisation aus Aceton weitergerei nigt wird.
<I>Präparat 5:</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat. Zu 3,41 g in einem Bad aus fester Kohlensäure gekühltem flüssigem Fluorwasserstoff wird portions- weise eine Suspension von 1,875 g 2a-Methyl-6a fluor-9ss,llss-oxido-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat in 5,97 g (über Natriumhydroxyd destilliertem)
Tetra- hydrofuran und 20 em33 Methylenchlorid, die gleich falls in einem Bad aus fester Kohlensäure gekühlt wurde, gegeben. Das Steroid wird vollständig gelöst. Nachdem das Reaktionsgemisch etwa 17 Stunden bei 0-5 abgestellt worden war, wurde es langsam unter Rühren in ein Gemisch von 300 cm3 Eiswasser, 50 em3 Methylenchlorid und 20g Natriumbikarbonat gegossen.
Das Gemisch wird einige Minuten gerührt, die Methylenchloridschicht abgetrennt und die Wasserphase zweimal mit je 50 em3 Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridlösungen werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel eingedampft, wodurch ein Öl erhalten wird. Das Öl wird in einem Gemisch aus 10 cm3 Essigsäureanhydrid in 10 cm3 Pyridin gelöst und etwa 20 Stunden abgestellt.
Das Acetylierungsgemisch wird dann in Eiswasser gegossen und mit Methylen- chlorid extrahiert. Der Extrakt wird mit verdünnter Säure, verdünnter Base und Wasser gewaschen, ge trocknet und über einer Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat chromatographiert. Die Eluierung der Säule mit Aceton in Hexankohlenwasserstoffen gibt ein kristallines Produkt, das mehrere Male aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert wird und kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a,
21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat ergibt.
Die Verwendung von wässrigem Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff anstelle des Fluorwasserstoffes ergibt das entsprechende 9a-Chlor- bzw. 9a-Brom- produkt.
<I>Präparat 6:</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Stickstoff wird etwa 15 Minuten lang durch eine Lösung von 0,33 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat in 33 cm3 Methanol geleitet. Hierzu wird eine Lö sung von 0,33g Kaliumbikarbonat in 4 cm3 Wasser, die ebenfalls mit Stickstoff behandelt worden ist, ge fügt.
Nachdem die Base etwa 8 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre gerührt worden war, wurde sie durch Zugabe von 2,5 cm3 5 I/o-iger Salzsäure neutra lisiert. Das Gemisch wird dann unter vermindertem Druck bei etwa 50 auf etwa 5 cm3 eingeengt. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, ge waschen, getrocknet, und zur Trockne eingedampft.
Die Umkristallisation aus Aceton-Hexankohlen- wasserstoffen ergab kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a,21-trioxy- 4 pregnen-3,20-dion.
Bei Verwendung des entsprechenden 9a-Chlor- oder 9a-Brom-2a-methyl 6a fluor-llss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetates in der genannten Hydrolyse erhält man 2a-Methyl-6a-flnor-9a-chlor-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion und die entsprechende 9a-Bromverbindung.
Das 2a-Methyl-6a,9a-difluor-llss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion oder dessen 9a-Chlor- oder 9a- Bromanaloge können an der 21-ständigen Hydroxyl- gruppe mit einer organischen Karbonsäure, vorzugs weise einer beliebigen Kohlenwasserstoffkarbonsäure mit 1 - einschliesslich 12 C-Atomen oder dem davon abgeleiteten Anhydrid oder Acylhalogenid, rück verestert werden.
Wenn das Acyherungsmittel fest ist, so kann ein inertes Lösungsmittel, wie Toluol, Xylol oder Dioxan, zugefügt werden, um die Lösung zu bewirken und ein flüssiges Veresterungsmedium zu schaffen.
Wenn das Veresterungsmittel eine freie Säure ist, so wird die Umsetzung in Gegenwart eines Vereste- rungskatalysators, z. B.
p-Toluolsulfonylchlorid, Trifluoressigsäureanhydrid, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure, Schwefelsäure oder dergleichen, durchgeführt. <I>Präparat 7:
</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. Zu einer Lösung von 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in 1 cm3 Pyridin und 35 cm3 tert. Butylalkohol wer den 250 mg N-Bromacetamid gefügt.
Nachdem das Reaktionsgemisch etwa 16 Stunden bei Raum temperatur abgestellt worden war, wurde es mit 25 cm3 250 mg Natriumsulfit enthaltendem Wasser verdünnt und auf etwa 20 cm3 eingeengt, worauf die Ausfällung stattfand.
Das so erhaltene Ausfällprodukt wird auf einem Filter gesammelt und dreimal aus Athylacetat und Hexankohlenwasserstoffen umkristal lisiert und ergibt 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. Die Verwendung der entsprechenden 9a-Chlor- und 9a-Bromverbindung als Ausgangsmaterial in der obigen Oxydation ergab 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion und die entsprechende 9a Bromverbindung.
<I>Präparat 8:</I> 2a Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-acetat. 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat und 0,15g Chromtrioxyd werden in 10 cms Eisessig und 1/2 cm' Wasser gelöst. Dieses Gemisch wird ge rührt und etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur ge halten.
Darauf wird es in 50 cm3 Eiswasser gegossen und das erhaltene Ausfällprodukt auf einem Filter gesammelt und dreimal aus Äthylacetat und Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert, wodurch man 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-acetat erhält.
Bei Verwendung des entsprechenden 9a-Chlor- und 9a-Bromsteroides als Ausgangsmaterial in der obigen Umsetzung erhält man 2a-Methyl-öa-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-acetat und die entsprechende 9a-Bromverbindung. <I>Präparat 9:
</I> 2a-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat. Zu einer Lösung von 100 mg (0,254 Millimol) rohem 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in 3 cms vorher auf 0 abgekühltem Pyridin wurden 0,2 cm3 Methansulfonylchlorid gegeben und darauf bei einer Temperatur zwischen 0 und -5 2 Stunden gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert.
Dieser Extrakt wurde zur Entfernung des Pyridins mit eiskalter verdünnter Salzsäure gewaschen. Der Methylenchloridextrakt wurde dann mit kalter, ver dünnter, wässriger Natriumkarbonatlösung gewa schen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net. Der getrocknete Extrakt wurde anschliessend durch Destillation bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Das erhaltene halbkristalline, lederfarbene Produkt war 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat. <I>Präparat 10:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-21-jod-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Das rohe 2a Methyl-6a-fluor-llss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat wurde in 5 cm3 Aceton aufgenommen.
Eine Lösung von 150 mg Natriumjodid in 3 cm3 Aceton wurde zugefügt und das Gemisch 15 Minuten unter Rühren am Rückflusskühler behandelt. Darauf wurde die Wärmezufuhr gedrosselt und das Gemisch durch Destillation unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Das erhaltene 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion wurde in der nachfolgend beschriebenen Umsetzung verwendet.
Die Umkristallisierung aus Methylen- chlorid ergab sehr reines kristallines 2a-Methyl-6a fluor-11ss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion. <I>Präparat<B>1</B></I><B>1:
</B> 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Das 2a-Methyl-6a-fluor-llss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion wurde in 3 cm3 Eisessig aufgenommen und bei Raumtemperatur (etwa 25 ) 45 Minuten lang ge rührt. 200 mg Zinkpulver wurden hinzugegeben und das Gemisch weitere 15 Minuten gerührt. Darauf wurde das Gemisch mit Methylenchlorid verdünnt und auf einem Filter aus gesintertem Glas zur Ent fernung des überschüssigen Zinks filtriert. Das Fil trat wurde mit Wasser bzw. verdünntem Natrium bikarbonat gewaschen und über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet.
Der getrocknete Extrakt wurde zur Trockne eingedampft und ergab 105 mg eines teilweise kristallinen Feststoffes. Dieses rohe Produkt wurde nochmals in 30 cm3 Methylenchlorid gelöst und über 10 g synthetisches Magnesiumsilikat (Florisil)
chromatographiert. Das Produkt wurde mit 12 25-cm3-Fraktionen aus 1011/9 Aceton in Hexan- kohlenwasserstoffen eluiert. Die Fraktionen 5 bis einschliesslich 7 ergaben 36 mg 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion, die aus Äthylacetat und Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert wurden und 34 mg 2a-Methyl-6 a-fluor-11 ss,
17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion ergaben.
Schmelzpunkt 265-267 , Drehung [ab + 45 (in Dioxan).
<I>Präparat 12:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-17cc-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a-fluor-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 cm3 Eisessigsäure und 1/2 cm-' Wasser wurde ein Gemisch hergestellt. Dieses Gemisch wird gerührt und 8 Stunden auf Raum temperatur gehalten.
Anschliessend wird das Ge misch in 50 em3 Eiswasser gegossen, durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxyd neutralisiert. Das erhaltene Ausfällprodukt wird auf einem Filter ge sammelt und aus Äthylacetat-Hexankohlenwasser- stoffen umkristallisiert, worauf man kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion erhält.
<I>Präparat 13:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion-21-methansulfonat.
Nach dem Verfahren von Präparat 9 wird durch Umsetzung von 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion in 7 cm3 Pyridin mit 0,3 cm3 Methansulfonylchlorid in Pyridinlösung kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion-21-methansulfonat hergestellt. <I>Präparat 14:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Rohes 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-21-jod- 4-pregnen-3,11,20-trion wird mit 15 cm3 Eisessig aufgeschlämmt und 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Darauf wird 1 g Zinkstaub zugefügt und weitere 15 Minuten ge rührt. Der überschüssige Zinkstaub wird durch Fil trieren entfernt, das Filtrat mit Methylenehlorid ver dünnt und mit Wasser in kalter Natriumbikarbonat- lösung gewaschen, bis die gesamte Essigsäure neutra lisiert ist.
Nachdem die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden ist, wird sie über synthetischem Magnesiumsilikat chromatographiert. Die Umkristallisation aus Aceton -Hexankohlen- wasserstoffen ergibt im wesentlichen reines 2cc-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 6</I> 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm?, Nährmedium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (601/ü# Feststoffe) und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben wurden 3 Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm als Impfstoff für 10 1 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cms eines Anti- schaummittels (Gemisch aus Specköl und Oktadeka- nol) enthält, verwendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt kräftig ge rührt (300 Ufmin) und belüftet (0,11 Luft/min/101 Gärmedium). Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-1 Iss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion und i/;, g in 16 cm3 Dimethylformamid gelöstes 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al hinzugefügt.
Die Inku- bation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Be lüftung 24 Stunden fortgeführt (endgültiger pH- Wert 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gär- mediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rück stand wird durch Chromatographie über einer Säule aus wasserfreiem synthetischem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen um- kristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion. <I>Beispiel 7</I> 2-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,
20-trion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit 100 em3 Medium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Nähr medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/em2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 10 1 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 ems eines Antischaummittels (Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium). Nach 20stündiger Inku bation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 cm3 Dimethylformamid gelösteµ 2a-Methyl 6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt und die Inkubation bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgeführt (end gültiger pH-Wert 8,3).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhal tene Rückstand wird durch Chromatographie über einer Säule aus synthetischem wasserfreiem Magne- siumsilikat gereinigt und aus Aceton-Hexankohlen- wasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl 6a-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 8</I> 6-Epimere Durch Verwendung der 6ss-Epimeren als Aus gangsmaterial in den vorhergehenden Beispielen er hält man bei Beibehaltung fast neutraler Reaktions- begingungen die entsprechenden 2 Methyl-6ss-fluor- produkte einschliesslich 2-Methyl-6ss fluor-11ss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion und 2-Methyl-6ss-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
Die so erhaltenen 6ss-Epimeren ergeben bei Be handlung in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, mit einer wasserfreien Mineralsäure, wie Salzsäure, in Gegenwart von Alkohol bei Tempera turen von 0 oder etwa darunterliegenden Tempera turen der gesamten Zeit der Säurezugabe beibehalten werden.
Mehrmaliges Waschen mit verdünntem Alkali und nachfolgendes Eindampfen unter ver- mindertem Druck ergibt hohe Ausbeuten an 6a-Epi- meren.
<I>Präparat 15:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion.
Ein Gemisch von 20 mg 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion-21-methansulfonat und 10 mg Kaliumfluorid in 2 cm3 Dimethylsulfoxyd wird etwa 17 Stunden auf einem Dampfbad erhitzt, dann mit 50 cm3 Methylenchlorid verdünnt und drei mal mit je 10 cm3 Wasser gewaschen.
Nachdem man die Methylenchloridlösung über Natriumsulfat ge trocknet hatte, leitete man sie über eine Säule aus 10 g synthetischem Magnesiumsilikat. Die Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen plus Aceton ergibt zuerst rohe Kristalle von 2a-Methyl 6a-fluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dion. Diese Verbindung hat eine grosse harntreibende Wir kung, und zwar verursacht sie Salz- und Wasser verluste, wodurch sie bei der Behandlung von Leber schrumpfung,
von nephrotischem Syndrom und Eklampsia und Präeklampsia besonders wertvoll ist.
Weitere Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen und Aceton ergibt das 2a-Methyl-6a,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion, das bei der Umkristallisierung aus Äthylacetat- Hexankohlenwasserstoffen im wesentlichen reines, kristallines 2a-Methyl-6a,21-difluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion ergibt.
<I>Präparat 16:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy 4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a,21-difluor-llss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 cm3 Eisessigsäure und 1/2 cm3 Wasser wird eine Lösung hergestellt. Dieses Gemisch wird gerührt und etwa 8 Stunden bei Raum temperatur gehalten.
Darauf wird das Gemisch in 50 cm3 Eiswasser gegossen, durch Zugabe von ver dünntem Natriumhydroxyd neutralisiert und das derart erhaltene Ausfällprodukt auf einem Filter ge sammelt und dreimal aus Athylacetat und Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert, wobei 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion erhalten wird.
<I>Präparat 17:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion.
Zu einer Lösung von 0,57 g 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion in 55 cm3 Acetonitril werden, im Dunkeln bei 50-60 0,4 cm3 einer 50%igen wässrigen Silberfluoridlösung zugefügt. Die Lösung wird in drei gleichen Teilen in halbstündigen Abständen zugegeben.
Nachdem diese Temperatur insgesamt etwa 11/2 Stunden beibehalten wurde, wird sie für weitere etwa 21/2 Stunden auf 40-50 herabgesetzt. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei 50 entfernt und der schwarze Rückstand dreimal mit je 50 cm3 Aceton versetzt.
Das in der Acetonlösung enthaltene Produkt wird durch Chromatographie über einer Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat gereinigt und aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert, wobei man kristallines 2a-Methyl-6a,21-difluor-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion erhält.
Durch Substitution von 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-21-jod-4-pregnen- 3,11,20-trion als Ausgangsstoff in der vorstehenden Umsetzung er hält man 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion. Das 2a-Methyl-6a,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion kann zum 6a,21-Difluor-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trion oxydiert werden.
<I>Beispiel 9</I> 2-Methyl-6a,21-difluor-1 lss,l7a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. Fünf 250 cm3 fassende, je 100 cm- Medium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthaltende Erlenmeyerkolben werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Nährmedium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impf stoff für 10 1 des gleichen Glukose-Maisquellwasser- Mediums verwendet,
das zusätzlich 5 cm3 eines Anti- schaummittels (Gemisch aus Specköl und Oktadeka- nol) enthält. Der Gärbehälter wird in das Wasserbad von 28 gestellt, der Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luftimin,/10 1 Gär- medium). Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl-6,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 0,
5 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 16 cm3 Dimethylformamid gelöst, zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 48 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton filtriert. Das Gärmedium wird drei mal mit je 1 1 Methylenchlor extrahiert. Darauf wer den die Acetonextrakte und die des Gärmediums ver einigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthe tischem wasserfreiem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. <I>Beispiel 10</I> 2-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion Fünf 250 cm3 fassende, je 100 cm-' Medium aus 1% Glukose,
2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthaltende Erlenmeyerkolben werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Nährmedium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden diese 500 cm'. als Impfstoff für 10 1 des gleichen Glukose Maisquellwasser-Mediums verwendet, das zusätzlich noch 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält. Der Gär- behälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein. Inhalt wird kräftig gerührt (300 U.Jmin) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 cm s Dimethylformamid ge löstes 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Tempe ratur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wird abfil triert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert.
Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylen- chlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der er haltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthetischem wasserfreiem Magne- siumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasser- stoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 11</I> 6ss Epimere Durch Verwendung der 6ss-Epimeren als Aus gangsstoffe in den vorhergehenden Beispielen erhält man bei Beibehaltung fast neutraler Reaktionsbedin gungen die entsprechenden 2a-Methyl-6ss,21-difluor- produkte, einschliesslich 2-Methyl-6ss,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion und 2-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion. Die derart erhaltenen 6ss-Epimeren ergeben durch Behandlung in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform,
mit einer wasserfreien Mineralsäure, wie Salzsäure, in Gegenwart von Alkohol bei Tempe raturen von 0 oder etwas darunterliegenden Tempe raturen die 6a-Epimeren. Die niederen Temperaturen sollten während der gesamten Zeit der Säurezugabe beibehalten werden. Mehrmaliges Waschen mit ver dünntem Alkali und nachfolgendes Eindampfen unter vermindertem Druck ergibt hohe Ausbeuten an 6a- Epimeren.
Präparat <I>18:</I> 2a-Methyl 6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat. Zu einer Lösung von 500 mg 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in 6 cm3 vorher auf 0-5 abgekühltem Pyridin wer den 0,55 cm3 Methansulfonylchlorid gefügt.
Das Re aktionsgemisch wird bei etwa 6 bis zur Beendigung der Umsetzung gerührt und dann in kalte 5%ige Salzsäurelösung geschüttet. Das erhaltene feste Mexylat, 2a-Methyl 6a,9a-difluor-11ss,17a,21 trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat, wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
<I>Präparat 19:</I> 2a-Methyl-6a,9a-ditluor-l lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion und 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Zu einer Lösung von 370 mg rohem 2a-Methyl,-6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat in 10 cm-3 Aceton wird eine Lösung von 370 mg Na- triumjodid in 4 cm3 Aceton gefügt.
Das Gemisch wird etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, etwa 15 Minuten am Rückfluss behandelt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Der das 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion enthaltende Rückstand wird in 5 cm3 Essigsäure ge löst und etwa 45 Minuten gerührt. Eine Lösung von 600 mg Natriumthiosulfat in 7,2 cm3 Wasser wird zur Essigsäurelösung hinzugefügt, anschliessend wer den 70 cms Eis und Wasser zugegeben.
Der erhal tene feste Stoff wird durch Filtrieren isoliert, wird über synthetisches Magnesiumsilikat chromatogra- phiert und aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Ein weiteres Produkt wird erhalten,
indem man die Wasserphase der vorstehenden Ausfällstufe mit Me- thylenchlorid extrahiert und dann wie vorstehend chromatographiert und umkristallisiert. Das 2a-Methyl-6a,9a-difluor-llss,l7a-dioxy- 24-jod-4-pregnen-3,20-dion kann auch durch Umkristallisation aus Methylen- chlorid gereinigt werden.
<I>Präparat 20:</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 em3 Eisessigsäure und 1/2 cm-' Wasser wird eine Lösung hergestellt. Das Gemisch wird gerührt und bis zur Beendigung der Umsetzung bei Raumtemperatur gehalten. Anschlie ssend wird das überschüssige Oxydationsmittel durch Zugabe von Methanol zerstört, und das Gemisch wird in Eiswasser gegossen.
Das so ausgefällte 2a Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion wird auf einem Filter gesammelt, mit Wasser gewa schen und getrocknet.
<I>Präparat 21:</I> Za-Methyl-6a fluor-9a-chlor-llss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 2a-Methyl-6a fluor-9a-brom-llss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Durch Umsetzung von 2a-Methyl 6a-fluor-9a-chlor-1 Iss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in Pyridinlösung mit Methansulfonylchlorid,
Um- setzung des so hergestellten 21-Methansulfonats mit Natriumjodid in Aceton und Reduzieren des 21- Jodids mit wässrigem Natriumthiosulfat erhält man in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben das 2a Methyl-6a-fluor-9a-chlor-llss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion.
<I>Präparat 22:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion und 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
In der gleichen Weise erhält man durch Um- setzung von 2a-Methyl-6a fluor-9a-chlor-llss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion mit Chromtfoxyd in Essigsäure und Wasser das 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion. In ähnlicher Weise ergibt 2a Methyl-6a fluor-9a-brom-llss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion als Ausgangsstoff das 6a Fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,
20-trion. Bei Verwendung von Za-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion als Ausgangsstoff und Umsetzung dieser Verbindung mit Methansulfonylchlorid zum 21-Methansulfonat, Umsetzung des 21 Methansulfonats mit Natriumjodid in Aceton zum 21-Jodid und Umsetzung des 21- Jodids mit Natriumthiosulfat erhält man auch das 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
In ähnlicher Weise führt die Verwendung von 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion als Ausgangsmaterial zum 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 12</I> 2-Methyl-6a,9ri-difluor-l 1ss, l7a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm-' Nährmedium aus l 0/a Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe)
und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg!em2 sterilisiert und darauf mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 101 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet. Der Gärbe- hälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt kräftig gerührt (300U./min) und belüftet (0,11 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach einer 20stündigen lnkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 1/2 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 16 cm3 Dimethylformamid gelöst, zugefügt, die Inkubation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 48 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,4).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit einem Liter Methylenchlorid extrahiert, darauf wer den die Acetonextrakte und die des Nährmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus syntheti schem wasserfreiem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. <I>Beispiel 13</I> 2-Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,
2Qtrion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm3 Medium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impf stoff für 101 des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Anti- schaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Okta- dekanol) enthält, verwendet. Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach 20stündiger Inku bation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 cm3 Dimethylformamid gelöstes 2a-Methyl 6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Tempe ratur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert.
Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, worauf die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, getrocknet, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft werden.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatogra- phie über eine Säule aus synthetischem wasserfreiem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kri stallines 2-Methyl-6a,9a-difluor-17cc-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
In gleicher Weise erhält man durch Verwendung von 2a-Methyl-6a fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion oder 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion anstelle von 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion das 2-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-1 lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion bzw. das 2-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion. <I>Präparat 23:
</I> 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-1 lss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Ein Gemisch von 200 mg 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion-21-methansulfonat und 100 mg Kaliumfluorid in 2 cm3 Dimethyl- sulfoxyd wird bis zur Beendigung der Umsetzung auf einem Dampfbad erhitzt.
Darauf wird das Re aktionsgemisch mit 50 cm3 Methylchlorid verdünnt und dreimal mit je 10 cm3 Wasser gewaschen. Nach dem man die Methylenehloridlösung über Natrium sulfat getrocknet hatte, leitete man sie über eine Säule aus 10 g synthetischem Magnesiumsilikat. Die Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen + Aceton ergibt zuerst rohes kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dion.
Diese Verbindung besitzt eine starke harntreibende Wirkung, das heisst sie verursacht Salz- und Wasser verluste, wodurch sie für die Behandlung von Leber schrumpfung, von nephrotischem Syndrom und Eklampsie und Präeklampsie besonders wertvoll ist.
Weitere Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen + Aceton ergibt das 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion, das bei der Umkristallisierung aus Äthylacetat- Hexankohlenwasserstoffen im wesentlichen reines, kristallines 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion ergibt.
<I>Präparat 24:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-l lss,17a-dioxy- 4 pregnen-3,20-dion.
Bei Verwendung von 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat als Ausgangsmaterial im vorstehenden Verfahren er hält man kristallines 2 a-Methyl-6a,21-difluor-9 a-chlor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-l lss-oxy-17a,21- epoxy-4-pregnen-3,
20-dion. Die letztgenannte Verbindung besitzt ähnliche pharmakologische Eigenschaften wie das 2a-Methyl-6a,9a-lifluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dion. Präparat <I>24:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen 3,20-dion.
Verwendet man 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat als Ausgangsmaterial im vorstehenden Verfahren, so erhält man kristallines 2a Methyl-6a,21-difluor-9a-brom llss,17a-dioxy- 4 pregnen-3,20-dion und kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom 11ss-oxy-17a,21- epoxy-4 pregnen-3,20-dion.
Die letztgenannte Verbindung besitzt pharma kologische Eigenschaften, die denen des 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dions ähnlich sind. <I>Präparat 25:</I> 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-l lss,17a-dioxy- 4 pregnen-3,20-dion.
Zu einer Lösung von 0,57 g 2a-Methyl 6a,9a-difluor-11ss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion in 55 cm3 Acetonitril werden bei einer Temperatur von 50-60 im Dunkeln 0,4 em3 50o/oiger wässriger Silberfluoridlösung gefügt. Die Lösung wird in drei gleichen Teilen in halbstündigem Abstand zugegeben. Diese Temperatur wird insgesamt etwa 11/2 Stunden beibehalten, dann wird sie weitere etwa 21/2 Stunden auf 40-50 herabgesetzt.
Anschliessend wird das Lö- sungsmittel bei 50 herabgesetzt. Anschliessend wird das Lösungsmittel bei 50 unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird dreimal mit je 50 cm3 Aceton versetzt.
Das in der Acetonlösung enthaltene Produkt wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen umkristalli siert und ergibt kristallines 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. <I>Präparat 26:</I> 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-llss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 cm3 Eisessigsäure und I/2 em3 Wasser wird eine Lösung hergestellt. Dieses Gemisch wird bis zur Beendigung der Umsetzung gerührt und bei Raumtemperatur gehalten. Darauf wird das überschüssige Oxydationsmittel durch Zu gabe von Methanol zerstört und das Gemisch in Eis wasser gegossen.
Das. erhaltene Fällprodukt wird auf einem Filter gesammelt, aus Äthylacetat umkristalli siert und ergibt kristallines 2a Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
<I>Präparat 27:</I> 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion, 2a Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion und 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. In der in Präparat 23 gezeigten Weise erhält man durch Umsetzung von 2a Methyl 6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-methansulfonat, 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,
20-trion-2l-methansulfonat und 2a-Methyl-6a fluor-9a-brom-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-methansulfonat mit Kaliumfluorid in Dimethylsulfoxyd das 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion, 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion bzw.
das 2a Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. <I>Beispiel 14</I> 2-Methyl-6a,9a,21-trifluor-l Iss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. Fünf 250-em3 Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm3 Medium aus <B>1</B> % Glukose, 2 % Maisquellwasser (60% Feststoffe)
und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Nähr medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg!cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 10 1 des gleichen Glukose-Mais- quellwasser-Mediums, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet. Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach 20stündiger Inku bation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-11t3,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 0,5 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 16 em3 Dimethylformamid gelöst, zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird zur Reinigung über einer Säule aus synthetischem wasser freiem Magnesiumsilikat chromatographiert, aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a,9a,21-trifluor-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. In ähnlicher Weise erhält man bei Verwendung von 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-11/3,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-11/3,
17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion anstelle von 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion bzw.
das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-1 lss,17a-dioxy- 1,4.-pregnadien-3,20-dion. <I>Beispiel 15</I> 2-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm3 Medium aus 111/o Glukose, 2% Maisquellwasser (60%. Feststoffe)
und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Nähr medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg!em2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden darauf drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit wer den 500 cm3 Impfstoff für 101 des gleichen Glukose Maisquellwasser-Nährmediums verwendet, das zu- sätzlich 5 cms eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält. Der Gär- behälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 1 Medium).
Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 em3 Dimethylformamid gelöstes.
2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt, die Inkubation wird bei gleicher Tempera tur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (end gültiger pH-Wert 8,3).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 em3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der er haltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthetischem wasserfreiem Magne- siumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasser- stoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2 Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion. In der gleichen Weise erhält man bei Verwen dung von 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion oder 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,
20-trion anstelle von 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion bzw. das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion.
<I>Beispiel 16</I> 6ss-Epimere Bei Verwendung der 6ss-Epimeren als Ausgangs stoffe in den vorhergehenden Beispielen erhält man unter Einhaltung fast neutraler Reaktionsbedingun gen die entsprechenden 2-Methyl-6ss-fluorprodukte, wie 2-Methyl-6ss,9a,21-trifluor-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion, 2-Methyl 6ss,21-difluor-9a-chlor-11ss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion, 2-Methyl-6ss,21-difluor-9a-brom-11ss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion,
2-Methyl-6ss,9a,21-trifluor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion, 2-Methyl-6ss,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion und 2-Methyl 6ss,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion, die aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden kön nen.
Die so erhaltenen 6ss Epimeren können durch Behandlung mit Säure oder Base in einem organi schen Lösungsmittel in die 6a-Epimeren übergeführt werden.
Die 2a-Methyl-6ss fluor-9a-halogen-l lss-oxy- 17a,21-epoxy-4-pregnen-3,20-dione besitzen im allgemeinen die gleichen Wirksamkeiten wie die entsprechenden 6a Fluorverbindungen.
Process for the preparation of steroid compounds The invention relates to a process for the preparation of new compounds of the formula
EMI0001.0001
in which X represents an β-oxymethylene radical or carbonyl radical, Y represents hydrogen, fluorine, chlorine or bromine, and R represents hydrogen, fluorine, hydroxyl or an acyloxy radical of a carboxylic acid.
Starting materials for the inventive method are compounds of the formula II:
EMI0001.0010
In this X is a carbonyl radical (> C = O) or an β-oxymethylene radical (> CHOH), Y is hydrogen, fluorine, chlorine or bromine, R is hydrogen, fluorine, hydroxyl or an acyloxy radical of an organic carboxylic acid, preferably a hydrocarbon carboxylic acid with 1 to 12 carbon atoms inclusive.
The new compounds have the valuable anti-rheumatic-arthritic, anti-inflammatory and glucocorticoid effects of the starting compounds, combined with favorable mineral-corticoid properties. The new compounds are suitable for treating inflammation of the skin, eyes and ears, contact dermatitis and other allergic reactions.
When used orally, they can be administered in conventional dosage forms, such as pills, tablets and capsules, and when used parenterally in the usual liquid forms, such as are used with natural and synthetic cortical steroid hormones. When applied topically, they can be used in the form of ointments, creams, lotions and the like, with or without other effective antibiotics, germicides and the like.
The process according to the invention for the preparation of the compounds of the formula I is characterized in that compounds of the formula 1I
EMI0001.0036
dehydrated in the 1,2-position. The dehydration can be done either fermentatively or chemically. The fermentative dehydration is carried out by using microorganisms such as Septomyxa, Corynebacterium, Fusarium and the like under known fermentation conditions (cf.
USA Patent No. <B> 2602769). </B> When dehydrating with Septomyxa, it is advantageous to use a steroid promoter, such as progesterone, 3-ketobisnor-4-cholen-22-al, together with the substrate and fermentation medium, 3-ketobisnorcholenic acid, 11 ss, 21-dioxy-1,4,17 (20) -pregnatrien-3-one, and the like. In general, who used the free alcohols as starting material in fermentative dehydrogenation.
However, the 21 acylates, such as 21-acetate, 21-propionate, 21-butyrate, 21-isobutyrate or 21-hemisuccinate, can also be used. In these cases the 21-ester group is generally saponified during the fermentation process. The resulting free 21-alcohol can optionally be reacylated by known 21-acylation processes.
The chemical dehydrogenation can be carried out with selenium dioxide, likewise by known methods [Meystre and coworkers, Helv. Chem. Acta, volume 39, p. 734 (1956)]. In the chemical dehydration, the 21-acylates are preferably used as starting material, which give the corresponding 2a-methyl-6-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-acylate.
The 21-acylate thus obtained can, if appropriate, be saponified to give the free 21-alcohol by known processes.
This acylation of the 21-alcohols can be carried out by known esterification methods, for. B. by reaction with an acid halide such as the acid chloride or acid bromide, or the anhydride of an organic carboxylic acid, or by reaction with the chosen acid in the presence of an esterification catalyst, e.g. B.
p-Toluenesulfonyl chloride, trifluoroacetic anhydride, p-toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid or sulfuric acid, or with an ester under ester interchange reaction conditions. Avoid reaction conditions that could attack the labile 11-hydroxyl group or the 6-halogen group. The 21-acylates prepared in this way can be hydrolyzed to the corresponding 21-hydroxyl compounds by known processes.
A preferred method is to use at least one molar equivalent of an alkali metal bicarbonate in an essentially oxygen-free solution of a mixture of a lower alkanol and water. The hydrolysis is carried out between 10 and 30; the mixture must be protected from atmospheric oxygen. When the hydrolysis is complete, the reaction mixture is quenched with an acid, e.g. B.
Acetic acid, neutralized and the hydrolyzed product obtained from the reaction mixture by evaporation and crystallization, extraction with methylene chloride or the like.
The compounds obtainable according to the invention are characterized by the presence of a 6-fluorine substituent. The fluorine can be in either the 6a or 6ss position. If you work in compliance with almost neutral conditions, the end product obtained is the corresponding 6ss epimer. Anyone who uses the 6/3 epimers or mixtures in which it dominates as starting material, each subsequent reaction product can be isolated either as a 6 @ epimer or as a mixture of 6a and 6/3 epimers.
A 6a-epimerized product can be obtained by treating the 6ss epimers or mixtures of 6a and 6ss epimers with halogen hydrogen, such as hydrogen chloride gas, at temperatures close to 0 in an organic solvent such as chloroform, methylene chloride or ether, in the present a proton donating agent such as alcohol or organic acids can be obtained. The mixture should be kept close to 0, but slightly higher or lower temperatures can also be used during the addition of the acid.
The reaction mixture is then washed successively with dilute alkali and water, dried and evaporated under reduced pressure. The 6a-fluoroproducts are recovered from the crude reaction product by recrystallization and purified.
The epimerization can also be carried out with alkali. Bases, e.g. B. solutions of sodium hydroxide or potassium hydroxide can be used to treat the 6ss epimers in solution in an organic solvent, such as methanol, who and give the 6a epimers.
Compounds of formula 1 with R = hydrogen can z. B. are produced according to the following scheme:
EMI0003.0001
in which R 'represents an organic radical, in particular a hydrocarbon radical with 1 to 10 carbon atoms, such as methyl, ethyl, phenyl, tolyl or naphthyl, methyl being preferred.
Then a 2a-methyl-6-fluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,20-dione III containing oxygen in the 11-position is treated with an organic sulfonyl halide and forms the corresponding 21-ester IV.
The 21-alkyl or aryl sulfonate IV is then reacted with an iodizing agent to give the corresponding 21-iodine steroid V, which is converted to 2a-methyl-6-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3, 20-dione 1I is dehalogenated.
The 2a-methyl-6-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione obtained in this way is then according to the invention to the corresponding 2-methyl-6-fluoro-1 Iss, 17a-dioxy-1, 4-pregnadiene-3,20-dione I dehydrated.
The inventive dehydrogenation of 2a-methyl-6 fluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,20-dione, which contains oxygen in the 11-position, e.g. B. des 2a-methyl-6-fluoro-1-lss, 17a-oxy-4-pregnene-3,20-dione and 2a-methyl-6 fluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione, to the corresponding 1-dehydro compounds, e.g. B.
2-methyl-6-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione and 2-methyl-6-fluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20 -trion occurs fermentatively by microorganisms such as Septomyxa, Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria,
Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium, Leptosphaeria, Cucurbitaria, Nocardia and fungi of the Tuberculariaceae family under known fermentation conditions, cf. U.S. Patent No. 2,602,769.
When using Septomyxa for dehydration, it is advantageous to add a steroid promoter such as progesterone, 3-ketobisnor-4-cholen-22-al, 3-ketobisnorcholenic acid, 11ss, 21-dioxy-1,4,17 ( 20) -pregnatrien-3-one and the like to use.
The chemical dehydration can e.g. B. with selenium dioxide by known methods (z. B. Mystre and coworkers, Helv. Chim. Acta, Volume 39, p. 734 [1956]).
6a-fluoro and 6ss-fluoro steroid compounds of the formula I with R = fluorine can be prepared according to the following reaction scheme:
EMI0005.0001
in which R 'has the meaning already given. To produce these compounds, for. B.
Treated a 21-alkyl or aryl sulfonate VI with a fluorinating agent and forms the corresponding 2a-methyl-6,21-difluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione.
The 2a-methyl-6,21-difluoro product can optionally be oxidized to the corresponding 2a-methyl-6,21-difluoro-17a-4-pregnene-3,11,20-trione. 2a-methyl76-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnen-3,20-dione VII can also be fluorinated to form the 21-fluorosteroid.
The 2a-methyl-6,21-difluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione or 2a-methyl-6,21-diuoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11 prepared in this way , 20 trione is then according to the invention by fermentative or chemical dehydrogenation to the corresponding 2-methyl 6,21-difluoro-11ss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione or 2-methyl-6,21-difluoro 17a-oxy-1,4-pregnadiene 3.11,
20-trione is dehydrated in the 1-position, the procedure being analogous to that for the 21-deoxy compounds. 6a-fluoro and 6ss fluoro steroid compounds of the formula I with 'Y = halogen can be prepared according to the following reaction scheme:
EMI0006.0001
in which Y 'is halogen and R' has the meaning already given.
According to the above method, for. B. 2a-methyl-6 fluoro-9a-halogen-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione VIII treated with an organic sulfonyl halide, the corresponding 21-ester IX being obtained.
The 21-alkyl or aryl sulfonate thus prepared is then mixed with an iodizing agent to form the corresponding 2a-methyl-6 fluoro-9a-halogen-11ss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnene-3,20-dione X and this finally with a reducing agent to 2a-methyl-6 fluoro-9a-halogen-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,
20-dione II implemented. The product 1I can optionally be oxidized to the corresponding 2a-methyl-6-fluoro-9a-halogen-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione.
The 2a-methyl-6-fluoro-9a-halogen-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione or 2a-methyl-6-fluoro-9a-halogen 17a-oxy-4-pregnen thus prepared -3,11,20-trione is then dehydrogenated in the 1-position according to the invention by fermentative or chemical dehydration, the corresponding 2-methyl-6-fluoro-9a-halogen-lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene -3,
20-dione I or the corresponding 2-methyl 6-fluoro-9 halogen-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-dione is obtained.
The dehydration takes place fermentatively or chemically in the manner already described.
6a-fluoro and 6ss-fluoro steroid compounds of the formula I, in which R = fluorine and Y = halogen, can be prepared according to the following scheme:
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in which R 'has the meanings already given and Y is halogen.
The process consists in treating the 2a-methyl 6 fluoro-9a-halogen-llss, 17a-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-alkyl or -arylsulfonate XI with a fluorinating agent, whereby the corresponding 2a-methyl-6,21-difluoro-9a-halogen-lss, 17a-dioxy 4-pregnen-3,20-dione II is obtained.
The 6,21-difluoro product can, if necessary, be oxidized to the corresponding 2a-methyl-6,21-difluoro-9a-halogen-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione. 2a-methyl-6-fluoro-8a-halogen-1 lss, 17a-dioxy-21 iodine 4-pregnen-3,20-dione can also be fluorinated to form the 21-fluoro steroid 1I.
The 2a-methyl-6,2l-difluoro-9a-halogen-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione or 2a-methyl-6,21-difluoro-9a-halogen-17a- Oxy-4-pregnen-3,11,20-trione is dehydrogenated in the 1-position by fermentative or chemical dehydration, and the corresponding 2-methyl-6,21-difluoro-9a-halogen-11ss, 17a is obtained - dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione or the corresponding 2-methyl-6,
21-difluoro-9a-halogen-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione. Here, too, the dehydration according to the invention then follows in the manner already described.
<I> Preparation 1: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione.
278 mg (0.637 millimoles) of 2a-methyl-6a-fluoro 11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate were dissolved in 30 cm3 of methyl alcohol. This solution was de-aired by bubbling nitrogen through it for 5 minutes. A solution of 150 mg potassium bicarbonate in 3 cm3 water was also deflated with nitrogen and added to the steroid solution. This reaction mixture was stirred at room temperature and kept in a nitrogen atmosphere for 5 hours.
The reaction mixture was made slightly acidic by adding two drops of glacial acetic acid and then diluted with 30 cm3 of water. The methanol was removed by distillation under reduced pressure. The product was extracted from the aqueous mixture three times with 10 cm3 of methylene chloride each time. The extract was dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness.
It gave 100 mg (0.254 millimoles) of 2a-methyl-6a-fluoro-I lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione, a white crystalline substance which melts at 200-206 '.
<I> Example 1 </I> 2-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione Five 250 cm3 Erlenmeyer flasks, each with one 100 cm nutrient medium consisting of 10/9 glucose, 2% corn steep water (601 / o solids) and tap water are set to a pH of 4.9.
This medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old vegetative growth of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28). After this time, 500 cm3 are used as a vaccine for 10 liters of the same medium made from glucose and corn steep liquor, which also contains 5 cm3 of an antifoam (a mixture of lard oil and octadecanol).
The fermentation tank is placed in a 28 water bath, the contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 1 air / 10 1 fermentation medium). After an incubation time of 20 hours, after a <I> good </I> growth has developed, 1 g of 2a-methyl-6a-fluoro-11 ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione and 1/2 g of 3-ketobisnor-4-cholen-22-al dissolved in 16 cm3 of dimethylformamide.
Incubation is carried out at the same temperature (28) and aeration is carried out for 72 hours (up to a final pH of 8.3). The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time. The acetone extracts and those of the nutrient medium are then combined, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of anhydrous, synthetic magnesium silicate (Florisil) and recrystallization from hexane hydrocarbons.
Crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione is obtained. Instead of Septomyxa, other species such as Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium,
Leptosphaeria, C.icurbitaria, Nocardia or enzymes from fungi of the family Tuberculariaceae can be used to introduce a dl bond into the 2a-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione .
This compound is converted to 2-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-acetate as follows: 50 mg 2-methyl-6a-fluoro 11ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione are dissolved in 1 cm3 of pyridine and 1 cm3 of acetic anhydride.
This solution is stored at room temperature for 21 hours and then poured into ice water, whereby crystalline 2-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-acetate is obtained which can be purified by recrystallization from hexane hydrocarbons.
2-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-hemisuccinate: 0.5 g succinic anhydride and 0.1 g 2-methyl-6a-fluoro -11 ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione are dissolved in 5 cm3 of pyridine. This solution is turned off for 20 hours, diluted with water, the mixture is cooled and filtered.
The precipitate, collected on a filter paper, is recrystallized twice from methanol and gives crystalline 2-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-hemisuccinate. 2-methyl-6a-fluoro-11 ss, 17a, 21-trioxy 1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-hemisuccinate sodium salt:
To a solution of 100 mg of 2-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy 1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-hemisuccinate in 2 cm3 of acetone is slowly added sodium hydroxide solution (0 , 1 normal) added until the pH rises to around 7.4. While the sodium hydroxide solution is being added, 5 cm3 of water are added at the same time.
The solution is then concentrated at 25 under vacuum to remove the acetone. The resulting aqueous solution of 2-methyl-6a-fluoro-lss, 17a, 21-trioxy 1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-hemisuccinate sodium salt is filtered and dried by freezing, where pure 2 -Methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy 1,4-pregnadiene-3,20-dione-21-hemisuccinate sodium salt.
<I> Example 2 </I> 2-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione Five 250 cm?> Erlenmeyer flasks, each 100 cm ?, a nutrient medium consisting of 1 a / Q glucose, 2% corn steep water (60% solids) and tap water are adjusted to a pH value of 4.9.
This medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm9 and inoculated with a one to two day old growth of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28). After this time, these 500 cm3 are used as a vaccine for 10 1 of the same nutrient medium made from glucose and corn steep liquor, which also contains 5 cm3 of an antifoam (a mixture of lard oil and octadecanol).
The fermentation tank is placed in a 28 water bath; the contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 1 air / minute / 10 1 fermentation medium). Incubation is carried out at the same temperature (28) and aeration is carried out for 72 hours (up to a final pH of 8.3).
The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is then extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time, then the acetone extracts and those of the fermentation medium are combined, fermented over anhydrous sodium sulphate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography over a column of anhydrous synthetic magnesium silicate and recrystallization from hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione.
The compound is converted to 2-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione-21-acetate as follows: 50 mg of 2-methyl-6a-fluoro-17a , 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione are dissolved in 1 cm3 of pyridine and 1 cm3 of acetic anhydride.
This solution is stored for 21 hours at room temperature and then poured into ice water, whereby crystalline 2-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione-21-acetate is obtained, which can be purified by recrystallization from hexane hydrocarbons.
<I> Example 3 </I> 2-methyl-6ss-fluoro-11ss, l 7a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione A stoichiometric equivalent amount of 2a-methyl-6ss-fluoro 11 / 3,17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione is used instead of 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione in the process of Example 1 used and gives crystalline 2-methyl-6ss fluoro-llss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,
20-dione. <I> Example 4 </I> 2-methyl-6ss-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione A stoichiometrically equivalent amount of 2a-methyl-6ss-fluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione is used instead of 2a-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-4-pregnen-3,11,20-trione in the process of Example 2 used and gives crystalline 2-methyl-6ss-fluoro-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione.
<I> Example 5 </I> Isomerization of 2 - methyl - 6ss-fluoro-11 ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione to 2-methyl-6a-fluoro-11 / 3,17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione A solution of 0.150 g of 2-methyl-6ss-fluoro-11 P, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3.20 -dione in 12 cm3 chloroform and 0.1 cm3 absolute alcohol is cooled to -10 in an ice-common salt mixture;
a stream of anhydrous hydrogen chloride is slowly passed through the solution for about 2.5 hours while the temperature is maintained between about -5 and -15. The solution is then washed with dilute sodium bicarbonate and water, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness under reduced pressure.
Recrystallization of the residue from hexane hydrocarbons gives crystalline 2-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione. <I> Preparation 2: </I> 2a-methyl 6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4,9 (11) -pregnadiene-3,20-dione-21-acetate. 0.4 g of N-bromoacetamide are added to a solution of 1 g of 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate in 10 cm3 of pyridine .
The mixture is placed in a nitrogen atmosphere for about 20 minutes and then cooled to 5. While stirring, anhydrous sulfur dioxide is passed over the surface until the solution with acidified iodine-starch paper no longer changes its color. During the addition of sulfur dioxide, the temperature of the reaction mixture is not allowed to rise above 20 \ 1. The mixture is then turned off for about 5 minutes and then poured into 100 cm3 of ice water, a crude solid precipitating out.
Recrystallization from acetone gives crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4, 9 (11)-pregnadiene-3,20-dione-21-acetate. <I> Preparation 3: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregn:
en-3,20-dione-21-acetate. To a solution of 420 mg of 2a-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4,9 (11) - pregnadiene-3,20-dione-21-acetate in 6.5 cm3 of methylene chloride, 12.5 cm3 of tert . Butyl alcohol, a solution of 1.0 cm3 of 72% perchloric acid in 7,
5 cm3 of water and a solution of 182 mg of N-bromoacetamide in 3.2 cm3 of tert. Butyl alcohol given. After stirring for about 15 minutes, a solution of 182 mg of sodium sulfite in 10 cm 3 of water was added and the mixture was evaporated under reduced pressure at about 60 until crystallization occurred. After cooling in an ice bath, 30 cm water was added with stirring.
The crystalline product is filtered, washed with water and dried, where essentially pure 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21- acetate was obtained. The product was used in the example below without further purification.
<I> Preparation 4: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-9ss, lss-oxido-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate. A mixture of 2.816 g of 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate, 2.816 g of potassium acetate and 90 cm3 of acetone is added with stirring heated at reflux temperature for about 18 hours. The reaction mixture is then evaporated to about half the original volume and cooled in an ice bath.
The addition of 250 cm3 of water produces crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-9ss, 11ss-oxido-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate, which is further purified by recrystallization from acetone becomes.
<I> Preparation 5: </I> 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate. A suspension of 1.875 g of 2a-methyl-6a fluoro-9ss, llss-oxido-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3.20- is added in portions to 3.41 g of liquid hydrogen fluoride cooled in a bath of solid carbonic acid. dione-21-acetate in 5.97 g (distilled over sodium hydroxide)
Tetrahydrofuran and 20 cubic meters of methylene chloride, which was also cooled in a bath of solid carbonic acid, were added. The steroid is completely dissolved. After the reaction mixture had stood at 0-5 for about 17 hours, it was slowly poured into a mixture of 300 cm3 of ice water, 50 cm3 of methylene chloride and 20 g of sodium bicarbonate, with stirring.
The mixture is stirred for a few minutes, the methylene chloride layer is separated off and the water phase is extracted twice with 50 cubic meters of methylene chloride each time. The combined methylene chloride solutions are washed with water, dried and the solvent evaporated to give an oil. The oil is dissolved in a mixture of 10 cm3 acetic anhydride in 10 cm3 pyridine and left off for about 20 hours.
The acetylation mixture is then poured into ice water and extracted with methylene chloride. The extract is washed with dilute acid, dilute base and water, dried and chromatographed over a column of synthetic magnesium silicate. Eluting the column with acetone in hexane hydrocarbons gives a crystalline product which is recrystallized several times from acetone - hexane hydrocarbons and gives crystalline 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-11ss, 17a,
21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate gives.
The use of aqueous hydrogen chloride or hydrogen bromide instead of hydrogen fluoride results in the corresponding 9a-chlorine or 9a-bromine product.
<I> Preparation 6: </I> 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione. For about 15 minutes, nitrogen is passed through a solution of 0.33 g of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate in 33 cm3 of methanol directed. To this end, a solution of 0.33 g of potassium bicarbonate in 4 cm3 of water, which has also been treated with nitrogen, is added.
After the base had been stirred for about 8 hours in a nitrogen atmosphere, it was neutralized by adding 2.5 cm 3 of 5 I / O hydrochloric acid. The mixture is then concentrated to about 5 cm3 under reduced pressure at about 50. The residue is taken up in ethyl acetate, washed, dried and evaporated to dryness.
Recrystallization from acetone-hexane hydrocarbons gave crystalline 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4 pregnen-3,20-dione.
When using the corresponding 9a-chloro- or 9a-bromo-2a-methyl 6a fluoro-llss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate in the hydrolysis mentioned, 2a-methyl- 6a-flnor-9a-chloro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione and the corresponding 9a-bromine compound.
The 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-llss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione or its 9a-chloro or 9a-bromo analogs can be attached to the 21-position hydroxyl group with an organic Carboxylic acid, preferably any hydrocarbon carboxylic acid with 1 - including 12 carbon atoms or the anhydride or acyl halide derived therefrom, are re-esterified.
If the curing agent is solid, an inert solvent such as toluene, xylene or dioxane can be added to effect dissolution and create a liquid esterification medium.
If the esterifying agent is a free acid, the reaction is carried out in the presence of an esterification catalyst, e.g. B.
p-toluenesulfonyl chloride, trifluoroacetic anhydride, p-toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid, sulfuric acid or the like. <I> Preparation 7:
</I> 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnene-3,11,20-trione. To a solution of 0.5 g of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione in 1 cm3 of pyridine and 35 cm3 of tert. Butyl alcohol who added 250 mg of N-bromoacetamide.
After the reaction mixture had been turned off for about 16 hours at room temperature, it was diluted with 25 cm3 of water containing 250 mg of sodium sulfite and concentrated to about 20 cm3, whereupon precipitation took place.
The precipitate obtained in this way is collected on a filter and recrystallized three times from ethyl acetate and hexane hydrocarbons to give 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione. The use of the corresponding 9a-chloro and 9a-bromine compounds as starting materials in the above oxidation gave 2a-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione and the corresponding 9a bromine compound.
<I> Preparation 8: </I> 2a methyl-6a, 9a-difluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione-21-acetate. 0.5 g of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate and 0.15 g of chromium trioxide are dissolved in 10 cms of glacial acetic acid and 1/2 cm 'Dissolved water. This mixture is stirred and kept at room temperature for about 18 hours.
It is then poured into 50 cm3 of ice water and the precipitate obtained is collected on a filter and recrystallized three times from ethyl acetate and hexane hydrocarbons, resulting in 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3, 11,20-trione-21-acetate is obtained.
If the corresponding 9a-chloro and 9a-bromosteroids are used as starting material in the above reaction, 2a-methyl-öa-fluoro-9a-chloro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione 21-acetate and the corresponding 9a-bromo compound. <I> Preparation 9:
</I> 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnene-3,20-dione-21-methanesulfonate. To a solution of 100 mg (0.254 millimoles) of crude 2a-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione in 3 cms of pyridine which had previously been cooled to 0, 0.2 cm3 Given methanesulfonyl chloride and then stirred at a temperature between 0 and -5 2 hours. Then the reaction mixture was diluted with water and extracted with methylene chloride.
This extract was washed with ice-cold dilute hydrochloric acid to remove the pyridine. The methylene chloride extract was then washed with cold, dilute, aqueous sodium carbonate solution and dried over anhydrous sodium sulfate. The dried extract was then evaporated to dryness by distillation under reduced pressure.
The semi-crystalline, buff-colored product obtained was 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnene-3,20-dione-21-methanesulfonate. <I> Preparation 10: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-21-iodine-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione. The crude 2a methyl-6a-fluoro-IIss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate was taken up in 5 cm 3 of acetone.
A solution of 150 mg of sodium iodide in 3 cm 3 of acetone was added and the mixture was refluxed for 15 minutes with stirring. The heat supply was then throttled and the mixture was concentrated to dryness by distillation under vacuum. The 2a-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnen-3,20-dione obtained was used in the reaction described below.
Recrystallization from methylene chloride gave very pure crystalline 2a-methyl-6a fluoro-11ss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnen-3,20-dione. <I>Preparation<B>1</B></I> <B> 1:
</B> 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnene-3,20-dione. The 2a-methyl-6a-fluoro-llss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnen-3,20-dione was taken up in 3 cm3 of glacial acetic acid and stirred at room temperature (about 25) for 45 minutes. 200 mg of zinc powder were added and the mixture was stirred for an additional 15 minutes. The mixture was then diluted with methylene chloride and filtered on a sintered glass filter to remove the excess zinc. The filtrate was washed with water or dilute sodium bicarbonate and dried over anhydrous sodium sulfate.
The dried extract was evaporated to dryness giving 105 mg of a partially crystalline solid. This crude product was redissolved in 30 cm3 of methylene chloride and 10 g of synthetic magnesium silicate (Florisil)
chromatographed. The product was eluted with 12 25 cm3 fractions from 1011/9 acetone in hexane hydrocarbons. Fractions 5 to 7 inclusive gave 36 mg of 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, which were recrystallized from ethyl acetate and hexane hydrocarbons, and 34 mg of 2a-methyl-6a -fluor-11 ss,
17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione.
Melting point 265-267, rotation [from + 45 (in dioxane).
<I> Preparation 12: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-17cc-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione.
A mixture was prepared from 0.5 g of 2a-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, 0.15 g of chromium trioxide, 10 cm 3 of glacial acetic acid and 1/2 cm of water . This mixture is stirred and kept at room temperature for 8 hours.
The mixture is then poured into 50 cubic meters of ice water and neutralized by adding dilute sodium hydroxide. The precipitate obtained is collected on a filter and recrystallized from ethyl acetate-hexane hydrocarbons, whereupon crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione is obtained.
<I> Preparation 13: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnene-3,11,20-trione-21-methanesulfonate.
Following the procedure of preparation 9, reaction of 1 g of 2a-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnene-3,11,20-trione in 7 cm3 of pyridine with 0.3 cm3 of methanesulfonyl chloride in pyridine solution becomes crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnene-3,11,20-trione-21-methanesulfonate. <I> Preparation 14: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione.
Crude 2a-methyl-6a-fluoro-17a-oxy-21-iodo-4-pregnen-3,11,20-trione is slurried with 15 cm3 of glacial acetic acid and stirred for 45 minutes at room temperature. 1 g of zinc dust is then added and the mixture is stirred for a further 15 minutes. The excess zinc dust is removed by filtration, the filtrate is diluted with methylene chloride and washed with water in cold sodium bicarbonate solution until all of the acetic acid has neutralized.
After the solution has been dried over anhydrous sodium sulfate, it is chromatographed over synthetic magnesium silicate. Recrystallization from acetone-hexane hydrocarbons gives essentially pure 2cc-methyl-6a-fluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione.
<I> Example 6 </I> 2-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione Five 250 cm3 Erlenmeyer flasks, each 100 cm?, Nutrient medium from 1% glucose, 2% corn steep water (601 / ü # solids) and tap water are adjusted to a pH of 4.9.
This medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks were shaken at room temperature (about 26-28) for 3 days. After this time, 500 cm are used as a vaccine for 10 1 of the same nutrient medium made from glucose and corn steep water, which additionally contains 5 cm of an anti-foaming agent (mixture of lard oil and octadecanol).
The fermentation tank is placed in a 28 water bath, its contents are vigorously stirred (300 rpm) and aerated (0.11 air / min / 101 fermentation medium). After incubation for 20 hours, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl-6a-fluoro-1Iss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione and i /; g are dissolved in 16 cm3 of dimethylformamide 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al added.
The incubation is continued for 24 hours at the same temperature (28) and aeration (final pH 8.3). The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time, then the acetone extracts and those of the fermentation medium are combined, dried over anhydrous sodium sulphate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of anhydrous synthetic magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a-fluoro-11ss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3.20 -dion. <I> Example 7 </I> 2-methyl-6a-fluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,
20-trion Five 250 cc Erlenmeyer flasks with 100 cubic meters of medium consisting of 1% glucose, 2% corn steep water (60% solids) and tap water are adjusted to a pH of 4.9.
This nutrient medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28). After this time, 500 cm3 are used as a vaccine for 10 1 of the same nutrient medium made from glucose and corn steep water, which additionally contains 5 ems of an antifoam (mixture of lard oil and octadecanol).
The fermentation tank is placed in a 28 water bath, its contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 l air / min / 10 l fermentation medium). After 20 hours of incubation, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl 6a-fluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione dissolved in 16 cm3 of dimethylformamide is added and incubation at the same temperature (28) and ventilation continued for 24 hours (final pH value 8.3).
The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with 1 l of methylene chloride each time, then the acetone extracts and those of the fermentation medium are combined, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of synthetic anhydrous magnesium silicate and recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl 6a-fluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20 -trion.
<I> Example 8 </I> 6-epimers By using the 6ss-epimers as starting material in the preceding examples, the corresponding 2-methyl-6ss-fluorine products including 2-methyl- 6ss fluoro-11ss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione and 2-methyl-6ss-fluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione.
The 6ss epimers obtained in this way result in treatment in an organic solvent, such as chloroform, with an anhydrous mineral acid, such as hydrochloric acid, in the presence of alcohol at temperatures of 0 or approximately below temperatures for the entire time the acid is added.
Repeated washing with dilute alkali and subsequent evaporation under reduced pressure gives high yields of 6a-epimers.
<I> Preparation 15: </I> 2a-methyl-6a, 21-difluor-lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione.
A mixture of 20 mg 2a-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate and 10 mg potassium fluoride in 2 cm3 dimethyl sulfoxide is heated on a steam bath for about 17 hours, then diluted with 50 cm3 of methylene chloride and washed three times with 10 cm3 of water each time.
After the methylene chloride solution had been dried over sodium sulfate, it was passed through a column of 10 g of synthetic magnesium silicate. Elution with hexane hydrocarbons plus acetone first gives crude crystals of 2a-methyl 6a-fluoro-1 lss-oxy-17a, 21-epoxy-4-pregnen-3,20-dione. This compound has a great diuretic effect, causing salt and water loss, causing it to shrink in the treatment of liver,
from nephrotic syndrome and eclampsia and preeclampsia is particularly valuable.
Further elution with hexane hydrocarbons and acetone gives the 2a-methyl-6a, 21-difluoro-11 ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, which when recrystallized from ethyl acetate-hexane hydrocarbons is essentially pure, crystalline 2a Methyl-6a, 21-difluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione gives.
<I> Preparation 16: </I> 2a-methyl-6a, 21-difluoro-17a-oxy 4-pregnene-3,11,20-trione.
A solution is prepared from 0.5 g of 2a-methyl-6a, 21-difluoro-IIss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, 0.15 g of chromium trioxide, 10 cm3 of glacial acetic acid and 1/2 cm3 of water . This mixture is stirred and kept at room temperature for about 8 hours.
The mixture is then poured into 50 cm3 of ice water, neutralized by adding dilute sodium hydroxide and the precipitate obtained in this way is collected on a filter and recrystallized three times from ethyl acetate and hexane hydrocarbons, with 2a-methyl-6a, 21-difluoro-17a oxy-4-pregnen-3,11,20-trione is obtained.
<I> Preparation 17: </I> 2a-methyl-6a, 21-difluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione.
To a solution of 0.57 g of 2a-methyl-6a-fluoro-11 ss, 17a-dioxy-21-iodine-4-pregnen-3,20-dione in 55 cm3 of acetonitrile, in the dark at 50-60 0, 4 cm3 of a 50% aqueous silver fluoride solution was added. The solution is added in three equal parts at half-hour intervals.
After this temperature has been maintained for a total of about 11/2 hours, it is lowered to 40-50 for about another 21/2 hours. The solvent is then removed under reduced pressure at 50 and the black residue is treated three times with 50 cm3 of acetone each time.
The product contained in the acetone solution is purified by chromatography over a column of synthetic magnesium silicate and recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons, crystalline 2a-methyl-6a, 21-difluoro-lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3.20 -dion receives.
By substituting 2a-methyl-6a-fluoro-17a-oxy-21-iodo-4-pregnen-3,11,20-trione as the starting material in the above reaction, 2a-methyl-6a, 21-difluoro-17a is obtained -oxy-4-pregnene-3,11,20-trione. The 2a-methyl-6a, 21-difluoro-11 ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione can be converted into 6a, 21-difluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione are oxidized.
<I> Example 9 </I> 2-methyl-6a, 21-difluoro-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione. Five Erlenmeyer flasks containing 250 cm3, each 100 cm medium consisting of 1% glucose, 2% corn steep liquor (60% solids) and tap water are adjusted to a pH of 4.9.
This nutrient medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28). After this time, 500 cm3 are used as a vaccine for 10 1 of the same glucose-corn steep liquor medium,
which also contains 5 cm3 of an anti-foam agent (mixture of lard oil and octadecanol). The fermentation tank is placed in the water bath of 28, the contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 1 air imin, / 10 1 fermentation medium). After 20 hours of incubation, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl-6,21-difluoro-11 ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione and 0,
5 g of 3-ketobisnor-4-cholen-22-al, dissolved in 16 cm3 of dimethylformamide, were added. Incubation is continued for 48 hours at the same temperature (28) and aeration (final pH 8.3). The mycelium is filtered off and filtered three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time. Then who united the acetone extracts and those of the fermentation medium, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of synthetic anhydrous magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a-fluoro-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione . <I> Example 10 </I> 2-methyl-6a, 21-difluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene- 3,11,20-trione Five 250 cm3 medium, each 100 cm- 'from 1% Glucose,
Erlenmeyer flasks containing 2% corn steep water (60% solids) and tap water are adjusted to a pH of 4.9. This nutrient medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28).
After this time has elapsed, these are 500 cm '. used as a vaccine for 10 l of the same glucose corn steep liquor medium, which also contains 5 cm3 of an antifoam agent (a mixture of lard oil and octadecanol). The fermentation tank will be placed in a 28 water bath. The contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 l air / min / 10 l fermentation medium).
After 20 hours of incubation, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl-6a, 21-difluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione dissolved in 16 cm s of dimethylformamide is added. The incubation is continued at the same temperature (28) and aeration for 24 hours (final pH 8.3). The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time.
The fermentation medium is extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time, then the acetone extracts and those of the fermentation medium are combined, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of synthetic anhydrous magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a, 21-difluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3, 11.20-trion.
<I> Example 11 </I> 6ss epimers Using the 6ss epimers as starting materials in the preceding examples gives the corresponding 2a-methyl-6ss, 21-difluoro products, including 2-methyl, while maintaining almost neutral reaction conditions -6ss, 21-difluoro-11 ss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione and 2-methyl-6a, 21-difluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11, 20-trion. The 6ss epimers obtained in this way give, by treatment in an organic solvent such as chloroform,
with an anhydrous mineral acid, such as hydrochloric acid, in the presence of alcohol at temperatures of 0 or slightly lower temperatures, the 6a-epimers. The lower temperatures should be maintained during the entire time the acid is added. Repeated washing with dilute alkali and subsequent evaporation under reduced pressure gives high yields of 6a-epimers.
Preparation <I> 18: </I> 2a-methyl 6a, 9a-difluoro-lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate. To a solution of 500 mg of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione in 6 cm3 of pyridine previously cooled to 0-5, 0.55 cm3 Methanesulfonyl chloride added.
The reaction mixture is stirred at about 6 until the reaction is complete and then poured into cold 5% hydrochloric acid solution. The solid mexylate obtained, 2a-methyl 6a, 9a-difluoro-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate, is filtered, washed with water and dried.
<I> Preparation 19: </I> 2a-methyl-6a, 9a-ditluoro-lss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnen-3,20-dione and 2a-methyl-6a, 9a-difluoro -l lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione. To a solution of 370 mg of crude 2a-methyl, -6a, 9a-difluoro-lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate in 10 cm-3 acetone is a solution of 370 mg sodium iodide in 4 cm3 acetone added.
The mixture is stirred at room temperature for about 20 minutes, refluxed for about 15 minutes and then evaporated to dryness under reduced pressure.
The residue containing the 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss, 17a-dioxy-21-iodo-4-pregnen-3,20-dione is dissolved in 5 cm3 of acetic acid and stirred for about 45 minutes. A solution of 600 mg of sodium thiosulfate in 7.2 cm3 of water is added to the acetic acid solution, then 70 cms of ice and water are added.
The solid material obtained is isolated by filtration, is chromatographed over synthetic magnesium silicate and recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3.20 -dion. Another product is obtained
by extracting the water phase of the above precipitation stage with methylene chloride and then chromatographing and recrystallizing as above. The 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-llss, l7a-dioxy-24-iodo-4-pregnen-3,20-dione can also be purified by recrystallization from methylene chloride.
<I> Preparation 20: </I> 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione.
From 0.5 g of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, 0.15 g of chromium trioxide, 10 em3 of glacial acetic acid and 1/2 cm- 'of water becomes one Solution made. The mixture is stirred and kept at room temperature until the reaction is complete. The excess oxidizing agent is then destroyed by adding methanol and the mixture is poured into ice water.
The 2a methyl-6a, 9a-difluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione precipitated in this way is collected on a filter, washed with water and dried.
<I> Preparation 21: </I> Za-methyl-6a fluoro-9a-chloro-llss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione and 2a-methyl-6a fluoro-9a-bromo-llss, l7a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione. By reacting 2a-methyl 6a-fluoro-9a-chloro-1 Iss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione in pyridine solution with methanesulfonyl chloride,
Reaction of the 21-methanesulphonate thus prepared with sodium iodide in acetone and reduction of the 21-iodide with aqueous sodium thiosulphate gives 2a methyl-6a-fluoro-9a-chloro-llss, 17a-dioxy-4 in the same manner as described above -pregnen-3,20-dione.
<I> Preparation 22: </I> 2a-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trione and 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo- 17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione.
In the same way, the reaction of 2a-methyl-6a fluoro-9a-chloro-llss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione with chromium oxide in acetic acid and water gives 2a-methyl-6a fluoro-9a-chloro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione. In a similar way, 2a methyl-6a-fluoro-9a-bromo-llss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione gives the 6a fluoro-9a-bromo-17a-oxy-4-pregnen-3,11 as the starting material ,
20-trion. When using Za-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione as starting material and converting this compound with methanesulfonyl chloride to 21-methanesulfonate, conversion of the 21-methanesulfonate with Sodium iodide in acetone to form 21-iodide and reaction of the 21-iodide with sodium thiosulphate also gives 2a-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione.
Similarly, the use of 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione as starting material leads to 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo -17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione.
<I> Example 12 </I> 2-methyl-6a, 9ri-difluor-l 1ss, l7a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione Five 250 cm3 Erlenmeyer flasks, each with 100 cm '' Nutrient medium made from 10 / a glucose, 2% corn steep liquor (60% solids)
and tap water are adjusted to a pH of 4.9. This medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg em 2 and then inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28).
After this time, 500 cm3 are used as a vaccine for 101 of the same nutrient medium made from glucose and corn steep liquor, which also contains 5 cm3 of an antifoam (a mixture of lard oil and octadecanol). The fermentation tank is placed in a 28 water bath, its contents stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.11 air / min / 10 1 fermentation medium).
After a 20 hour incubation, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione and 1/2 g of 3-ketobisnor are obtained -4-cholen-22-al, dissolved in 16 cm3 of dimethylformamide, is added, the incubation is continued for 48 hours at the same temperature (28) and aeration (final pH value 8.4).
The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with one liter of methylene chloride, then who combined the acetone extracts and those of the nutrient medium, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of synthetic anhydrous magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3.20 -dion. <I> Example 13 </I> 2-methyl-6a, 9a-difluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,
2Qtrion Five 250 cm3 Erlenmeyer flasks, each with 100 cm3 of medium consisting of 1% glucose, 2% corn steep water (60% solids) and tap water are adjusted to a pH of 4.9.
This medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28).
After this time, 500 cm3 are used as a vaccine for 101 of the same medium made from glucose and corn steep liquor, which also contains 5 cm3 of an anti-foaming agent (a mixture of lard oil and octadecanol). The fermentation tank is placed in a 28 water bath, its contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 l air / min / 10 l fermentation medium).
After 20 hours of incubation, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl 6a, 9a-difluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione dissolved in 16 cm3 of dimethylformamide is added. The incubation is continued at the same temperature (28) and aeration for 24 hours (final pH 8.3). The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time.
The fermentation medium is extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time, whereupon the acetone extracts and that of the fermentation medium are combined, dried, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of synthetic anhydrous magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a, 9a-difluoro-17cc-oxy-1,4-pregnadiene-3, 11.20-trion.
Using 2a-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione or 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-17a-oxy is obtained in the same way -4-pregnen- 3,11,20-trione instead of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trione the 2-methyl-6a-fluoro-9a- chlorine-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione and 2-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20 -trion. <I> Preparation 23:
</I> 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione. A mixture of 200 mg of 2a-methyl-6a-fluoro-11 ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate and 100 mg of potassium fluoride in 2 cm3 of dimethyl sulfoxide is present until the reaction has ended heated in a steam bath.
The reaction mixture is then diluted with 50 cm3 of methyl chloride and washed three times with 10 cm3 of water each time. After the methylene chloride solution had been dried over sodium sulfate, it was passed over a column of 10 g of synthetic magnesium silicate. Elution with hexane hydrocarbons + acetone first gives crude crystalline 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss-oxy-17a, 21-epoxy-4-pregnen-3,20-dione.
This compound has a strong diuretic effect, that is, it causes salt and water losses, making it particularly valuable for the treatment of liver shrinkage, nephrotic syndrome and eclampsia and preeclampsia.
Further elution with hexane hydrocarbons + acetone gives the 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, which is essentially pure, crystalline when recrystallized from ethyl acetate-hexane hydrocarbons 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-11ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione gives.
<I> Preparation 24: </I> 2a-methyl-6a, 21-difluoro-9a-chloro-lss, 17a-dioxy-4 pregnen-3,20-dione.
If 2a-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-1 lss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate is used as the starting material in the above process, crystalline 2a-methyl is obtained -6a, 21-difluoro-9 a-chloro-11 ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione and crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-9a-chloro-1 lss-oxy-17a, 21 - epoxy-4-pregnen-3,
20-dione. The latter compound has similar pharmacological properties as 2a-methyl-6a, 9a-lifluor-1 lss-oxy-17a, 21-epoxy-4-pregnen-3,20-dione. Preparation <I> 24: </I> 2a-methyl-6a, 21-difluoro-9a-bromine-lss, 17a-dioxy-4-pregnen 3,20-dione.
If 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo-11ss, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-21-methanesulfonate is used as the starting material in the above process, crystalline 2a-methyl-6a is obtained, 21-difluoro-9a-bromo llss, 17a-dioxy-4 pregnen-3,20-dione and crystalline 2a-methyl-6a-fluoro-9a-bromo 11ss-oxy-17a, 21-epoxy-4 pregnen-3,20 -dion.
The latter compound has pharmacological properties which are similar to those of 2a-methyl-6a, 9a-difluoro-1 lss-oxy-17a, 21-epoxy-4-pregnen-3,20-dione. <I> Preparation 25: </I> 2a-methyl 6a, 9a, 21-trifluoro-lss, 17a-dioxy-4 pregnen-3,20-dione.
A solution of 0.57 g of 2a-methyl 6a, 9a-difluoro-11ss, 17a-dioxy-21-iodine-4-pregnen-3,20-dione in 55 cm3 of acetonitrile is added at a temperature of 50-60 in the dark 0.4 em3 50% aqueous silver fluoride solution joined. The solution is added in three equal parts at half-hour intervals. This temperature is maintained for a total of about 11/2 hours, then it is lowered to 40-50 for about 21/2 hours.
The solvent is then reduced to 50. The solvent is then removed at 50 under reduced pressure. The residue is mixed three times with 50 cm3 of acetone each time.
The product contained in the acetone solution is purified by chromatography on a column of synthetic magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-11 ss, 17a-dioxy-4-pregnen-3 , 20-dione. <I> Preparation 26: </I> 2a-methyl 6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione.
From 0.5 g of 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-llss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, 0.15 g of chromium trioxide, 10 cm3 of glacial acetic acid and 1/2 em3 of water becomes a Solution made. This mixture is stirred until the reaction is complete and kept at room temperature. The excess oxidizing agent is then destroyed by adding methanol and the mixture is poured into ice water.
The. The precipitate obtained is collected on a filter, recrystallized from ethyl acetate and gives crystalline 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione.
<I> Preparation 27: </I> 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione, 2a methyl-6a, 21-difluoro-9a-chlorine -17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione and 2a-methyl-6a, 21-difluoro-9a-bromo-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione. In the manner shown in preparation 23, the reaction of 2a methyl 6a, 9a-difluoro-17a, 21-dioxy-4-pregnene-3,11,20-trione-21-methanesulfonate, 2a-methyl-6a-fluoro 9a-chloro-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,
20-trione-2l-methanesulphonate and 2a-methyl-6a fluoro-9a-bromo-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione-21-methanesulphonate with potassium fluoride in dimethylsulphoxide, 2a-methyl-6a , 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-4-pregnene-3,11,20-trione, 2a-methyl-6a, 21-difluoro-9a-chloro-17a-oxy-4-pregnene-3,11.20 -trion or
the 2a methyl-6a, 21-difluoro-9a-bromo-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione. <I> Example 14 </I> 2-Methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-1 Iss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione. Five 250-em3 Erlenmeyer flasks, each with 100 cm3 medium made of <B> 1 </B>% glucose, 2% corn steeple water (60% solids)
and tap water are adjusted to a pH of 4.9. This nutrient medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are shaken for three days at room temperature (about 26-28).
After this time, 500 cm3 are used as a vaccine for 10 l of the same glucose-corn steep water medium, which additionally contains 5 cm3 of an antifoam (a mixture of lard oil and octadecanol). The fermentation tank is placed in a 28 water bath, its contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 l air / min / 10 l fermentation medium).
After 20 hours of incubation, when good growth has developed, 1 g of 2a-methyl 6a, 9a, 21-trifluoro-11t3,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione and 0.5 g of 3-ketobisnor are used -4-cholen-22-al, dissolved in 16 cubic meters of dimethylformamide, added. Incubation is continued for 24 hours at the same temperature (28) and aeration (final pH 8.3).
The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cm3 of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with 1 liter of methylene chloride each time, then the acetone extracts and those of the fermentation medium are combined, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
For purification, the residue obtained is chromatographed over a column of synthetic anhydrous magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and yields crystalline 2-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3 , 20-dione. Similarly, when using 2a-methyl-6a, 21-difluoro-9a-chloro-11 / 3,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione or 2a-methyl-6a, 21-difluoro 9a-bromo-11/3,
17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione instead of 2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-1 lss, 17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione, 2-methyl-6a, 21-difluoro-9a-chloro-lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione or
the 2-methyl-6a, 21-difluoro-9a-bromo-1 lss, 17a-dioxy-1,4.-pregnadiene-3,20-dione. <I> Example 15 </I> 2-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione Five 250 cm3 Erlenmeyer flasks of 100 cm3 each Medium of 111 / o glucose, 2% corn steep liquor (60%. Solids)
and tap water are adjusted to a pH of 4.9. This nutrient medium is sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg em 2 and inoculated with a one to two day old vegetative culture of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks are then shaken for three days at room temperature (about 26-28).
After this time has elapsed, the 500 cm3 vaccine is used for 101 of the same glucose corn steep water nutrient medium, which also contains 5 cms of an antifoam agent (a mixture of lard oil and octadecanol). The fermentation tank is placed in a 28 water bath, its contents are stirred vigorously (300 rpm) and aerated (0.1 1 1 medium).
After 20 hours of incubation, when good growth has developed, 1 g is dissolved in 16 cubic meters of dimethylformamide.
2a-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione are added, the incubation is continued at the same temperature (28) and aeration for 24 hours (final pH value 8.3).
The mycelium is filtered off and extracted three times with 200 cubic meters of acetone each time. The fermentation medium is extracted three times with 1 l of methylene chloride each time, then the acetone extracts and those of the fermentation medium are combined, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
The residue obtained is purified by chromatography on a column of synthetic anhydrous magnesium silicate, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons and gives crystalline 2-methyl-6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3 , 11.20-trion. In the same way, when using 2a-methyl-6a, 21-difluoro-9a-chloro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione or 2a-methyl-6a, 21-difluoro 9a-bromo-17a-oxy-4-pregnen-3,11,
20-trione instead of 2a-methyl 6a, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trione, 2-methyl-6a, 21-difluoro-9a-chloro-17a-oxy- 1,4-pregnadiene-3,11,20-trione or 2-methyl-6a, 21-difluoro-9a-bromo-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione.
<I> Example 16 </I> 6ss epimers If the 6ss epimers are used as starting materials in the preceding examples, the corresponding 2-methyl-6ss-fluorine products, such as 2-methyl-6ss, are obtained while observing almost neutral reaction conditions 9a, 21-trifluoro-1 lss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione, 2-methyl 6ss, 21-difluoro-9a-chloro-11ss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene- 3,20-dione, 2-methyl-6ss, 21-difluoro-9a-bromo-11ss, 17a-dioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione,
2-methyl-6ss, 9a, 21-trifluoro-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione, 2-methyl-6ss, 21-difluoro-9a-chloro-17a-oxy-1, 4-pregnadiene-3,11,20-trione and 2-methyl 6ss, 21-difluoro-9a-bromo-17a-oxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione, which can be isolated from the reaction mixture nen.
The 6ss epimers thus obtained can be converted into the 6a epimers by treatment with acid or base in an organic solvent.
The 2a-methyl-6ss fluoro-9a-halogen-lss-oxy-17a, 21-epoxy-4-pregnen-3,20-diones generally have the same activities as the corresponding 6a fluoro compounds.