Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen der Formel I
EMI0001.0003
und deren 9a-Fluoranalogen, das dadurch gekenn zeichnet ist, dass man ein 6-Methyl-16cc-oxy-hydro- cortison, dessen 21-Acylat oder 16,21-Diacylat bzw. ein 6-Methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocorti.son, des sen 21-Acylat oder 16,21-Diacylat mittels eines eine Doppelbindung in 1,
2-Stellung einführenden Organismus vergärt.
Die Ausgangsmaterialien des erfindungsgemässen Verfahrens können erhalten werden; indem man ein 6-Methyl-11 ss,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion-21- acylat, worin die Acylgruppe einer Carbonsäure, vorzugsweise einer Kohlenwasserstoff-Carbonsäure entstammt, mit Osmiumtetroxyd umsetzt und hydrolysiert, wobei das 6-Methyl-llss,16a,17a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acylat erhalten wird;
der Monoester kann zum 6-Methyl-16a-oxyhydro- cortison hydrolysiert und das freie Diol zum Diester 6-Methyl-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacylat verestert werden, der dann der erfindungsgemässen Umsetzung unterworfen wird.
Zur Herstellung der fluorhaltigen Ausgangsmaterialien kann der obige Diester mit einem N-Halogenacylamid oder einem N-Halogenacylamid und anschliessend mit Schwefel dioxyd behandelt werden, wobei das entsprechende 6-Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9 (11)-pregnadien- 3,20- dion 16,21-diacylat .erhalten wird;
das derart her gestellte 6-Methyl-16a,17a-trioxy-4,9(11)-pregnadien- 3,20-dion-16a,21-diacylat wird mit einer unterhalo- genigen Säure, die z. B. durch Umsetzung eines N-Halogenacylamides oder eines N-Halogenacyl- imides, worin das Halogen Chlor oder Brom ist, zum 6-Methyl-9a-halogen-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat umgesetzt;
das derart erhaltene 6-Methyl-9a-halogen-11ss,16a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat wird ent weder mit einer schwachen Base, wie Natrium- oder Kaliumacetat, oder der kleinsten berechneten Menge einer starken Base dehydrohalogeniert, wobei 6-Methyl-9ss,11 ss-oxido-16a,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion-16,21-diacylat erhalten wird;
diese Oxido- verbindung wird mit Fluorwas.serstoff zum entspre chenden 6-Methyl-9a-fluor-11ss,16a,17a,21-tetraoxy- 4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat (6-Methyl-9a- fluor-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacylat) umgesetzt.
Das 6a-Methyl-9a-fluor-llss,16a,17a,21-tetraoxy-4- pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat oder der durch Hydrolyse mit einer Base hergestellte freie Alkohol wird sodann der erfindungsgemässen Fermentein- wirkung durch die d'-Bindung einführende Organis men, z. B. Arten der Gattung Septomyxa, Coryne- bacterium, Fusarium oder dergleichen, unterworfen zur Herstellung des entsprechenden 4'-Analogen.
Die entsprechenden 11-Ketonanalogen dieser Verbindungen können durch Oxydation der 11- Oxy-16,21-diester-Verbindungen mit einem Oxy dationsmittel, wie Chromsäureanhydrid in Essig säure erhalten werden. Als Ausgangsverbindungen werden solche be vorzugt, die die Methylgruppe in 6a-Stellung ent halten.
Die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Ver bindungen 1-Dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortison, 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison und ihre Ester, insbesondere als 6a-Epimere, sind hochaktive Nebennierenrinden-Hormone mit einer grösseren glucocorticoiden Wirksamkeit als Hydro- cortison oder Cortison. Diese Verbindungen haben zusätzlich diuretische Wirksamkeit und Salzverlust hervorrufende Eigenschaften, die sie insbesondere für die Behandlung chronischer,
kongestiver Herz schäden und bei Leberzirrhose, nephrotischen und andrenogenitalen Syndromen und bei der Behand lung von Eklampsie oder Präeklampsie geeignet machen.
Die neuen Verbindungen können in oral, paren- teral oder örtlich anzuwendenden Zusammenset zungen verabreicht werden. Die zur oralen An wendung bestimmten Tabletten können 5-10 mg aktive Verbindung je Tablette und zusätzlich inerte Stoffe, wie Laktose, Sukrose, Calziumstearat oder dergleichen, gewöhnlich etwa 100-200 mg inerte Bindestoffe, enthalten.
Bei Verwendung von 1- Dehydro-6a-methyl-16a-oxyhydrocortison in Tablet tenform werden Mengen zwischen 3-6 mg je Ta blette bevorzugt, bei 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor- 16a-oxyhydrocortison-Tabletten sind 1-5 mg der aktiven Substanz befriedigend. Bei örtlicher Behand lung können die aktiven Steroidbestandteile in Form von Salben, Bougies, Lotionen, Gelees, Lösungen oder Suspensionen oder als Aerosol, z. B. bei Nasen behandlungen, angewandt werden.
In diesen Zusammensetzungen werden die 6a- Epimeren bevorzugt, die 6/3-Methylepimeren kön nen jedoch in pharmazeutisch äquivalenten Men gen auch verwendet werden. Für parenterale Ver wendung eignen sich insbesondere wasserlösliche Ester von mehrbasischen Säuren und deren Salze, wie 21-Hemisuccinatnatriumsalz oder das Hemi- /3,/3-dimethylglutaratnatriumsalz der obigen Produkte.
Die Herstellung der Ausgangsstoffe der vor liegenden Erfindung sowie mögliche Umsetzungen mit den Verfahrensprodukten kann wie in den Präparaten 1-33 gezeigt erfolgen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das 6-Methyl-16a-oxyhydrocortison oder 6-Methyl- 9cc-fluor-16a-oxyhydrocortison entweder als 21-Ester oder als 16,21-Diester oder als freier Alkohol der Fermenteinwirkung eines eine dl-Bindung erzeu genden Organismus, z.
B. einer Art der Gattung Septomyxa, Cornebacterium, Fusarium, Proamino- bacter, Microbacterium, Streptomyces (z. B. Laven- dulae), Pseudomonas (z.
B. Testosteroni), Ophiobolus, Calonectria, Alternaria, Dydimella, Cylindrocarpon, Listeria, Colletotrichum, Erysipelothrix, Ba:cillus (ins besondere B. sphaericus), Nocardia, Glieder der Familie Tuberculariaceae, Micromonospora und der gleichen, vorzugsweise der Art Septomyxa affinis, unterworfen.
Die Fermentation wird in üblicher Weise durchgeführt; vorzugsweise bei Temperatu ren zwischen 24 und 30, oder, je nach der Art des angewandten Organismus, bei etwas niedrigeren oder höheren Temperaturen, z. B. zwischen 15 und 35 , und das Substrat wird in einem Nährgemisch, das assimilierbaren Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen ent haltende Verbindungen enthält, suspendiert.
Nach dem man das Gemisch filtriert und die Feststoffe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel gewaschen hat, das Filtrat und die Waschlösungen mit einem organischen Lösungsmit tel extrahiert und das Lösungsmittel verdampft hat, erhält man das 6 -Methyl -11[>,16a,17a,21 -tetra- oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion bzw. dessen 9a-Fluor- analogen, das durch Umkristallisation und;"oder Chromatographie gereinigt werden kann.
Die Behandlung beispielsweise des Monoesters 6-Methyl-11/3,16a,17a,21-tetraoxy- 4- pregnen- 3,20- dion-21-acylat oder des 6-Methyl-11/3,16a,17a,21- tetraoxy-3,20-dions mit einem Acylierungsmittel führt zu dem entsprechenden 16,21-Diester von 6-Methyl- 16a-oxyhydrocortison bzw. 1-Dehydro-6-methyl-16a- oxyhydrocortison.
<I>Präparat 1</I> Eine 1,65 g Semicarbazidhydrochlorid in 10 cm Wasser enthaltende Lösung wurde zu einer Lösung von 1 g 6a-Methyl-hydrocortisonacetat [Spero et a1., J. Am. Chem. Soc. 78, S.<B>6213</B> (1956)] in 1,2 cm33 Pyridin und 40 cm3 Methanol gegeben. Dieses Gemisch wurde 18 Stunden am Rückflusskühler erhitzt, darauf auf 20 cm3 eingeengt und in 500 cm3 eiskaltes Wasser gegossen.
Dann wurde das Reak tionsgemisch 6 Stunden bei 0 gehalten und an schliessend filtriert. Der Niederschlag wurde mit Eiswasser gewaschen und getrocknet. Die farb losen Kristalle,<B>1,216</B> g 3,20-Disemicarbazon von 6a-Methyl-hydrocortison-21-acetat, hatten einen Schmelzpunkt von mehr als 300 ; [a]1,: A-173' (Dioxan).
<I>Präparat 2</I> 1 g des nach Präparat 1 hergestellten 6a-Methyl- hydrocortison-acetat-3,20-bisemicarbazons wurde in 20 cm-- Eisessig und 1 cm33 Essigsäureanhydrid gelöst. Dieses Gemisch wurde eine Stunde in einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluss erhitzt. Darauf wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum auf etwa 12 cm- eingeengt, mit 6 cm-- Brenztraubensäure behandelt und anschliessend 40 Stunden bei Raum temperatur gehalten. Dann wird das Gemisch 2 Stunden auf 60 C erhitzt, abgekühlt und mit 600 cm33 Wasser verdünnt.
Darauf wird das wäss- rige Gemisch dreimal mit je 400 cm33 Chloroform extrahiert, die Chloroformextrakte werden zweimal mit je 100 cm- 5 olodger Natriumkarbonatlösung und dreimal mit je 100 cm33 Wasser gewaschen. Die derart gewaschenen und vereinigten Chloroform- extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockne eingedampft.
Der rohe, 6a-Methyl-llss,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20- dion-21-acetat enthaltende Rückstand wurde an 70 g Aluminiumoxyd unter Verwendung von Benzol, Benzol : Äther, Äther, Äther : Methylenchlorid, Me- thylenchlorid und Methanol chromatographiert, wobei jeweils Fraktionen von 60 cms abgenommen wurden.
Die mit Äther erhaltenen Mittelfraktionen wur den vereinigt, kristallisiert und aus Benzol-Hexan kohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergaben insgesamt 122 mg 6a-Methylllss,21-dioxy-4,16- pregnadien-3,20-dion mit einem Schmelzpunkt von etwa 115 C und einem zweiten Schmelzpunkt von 152-1540 C; [a]D : + 177 C (Chloroform).
<I>Präparat 3</I> Ein Reaktionsgemisch aus 90 mg 6a-Methyl-11ss, 21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion-21-acetat, 6.5 mg Osmiumtetroxyd in 2,5 cm3 Benzol und 0,12 cm3 Pyridin liess man 95 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Darauf wurde dem Gemisch unter Rühren eine Lösung von 0,7 g wasserfreiem Natrium sulfit und 0,7g Kaliumbikarbonat in 65 etn3 Was ser zugegeben und das Rühren wurde weitere 16 Stunden fortgesetzt. Dann wurde das Gemisch mit 10 cm- Chloroform verdünnt und filtriert.
Der Rückstand auf dem Filter wurde mit insgesamt 100 cm3 heissem Chloroform gewaschen. Die Chloro- formwaschlösungen und das Filtrat wurden verei nigt, mit einer Salzlösung gesättigt und die Chloro- formschicht abgetrennt. Die Chloroformschicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat ge trocknet und zur Trockne eingedampft.
Der etwa 100 mg wiegende Rückstand wurde zweimal aus Aceton-Äther umkristallisiert und ergab 39 mg 6a- Methyl-11 ss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion mit einem Schmelzpunkt von 215-217 ; [a]D : -I-680 (Dioxan).
<I>Präparat 3a</I> Ein Reaktionsgemisch aus 200 mg 6a-Methyl- I lss,21-dioxy-4,16-pregnadien - 3,20-dion-21-acetat, 145 mg Osmiumtetroxyd in 6 cm3 Benzol und 0,30 cm3 Pyridin liess man 76 Stunden bei Raumtemperatur ste hen. Darauf wurde dem Gemisch unter Rühren eine Lösung von 1,5 g wasserfreiem Natriumsulfit und 1,5g Kaliumbikarbonat ün 140 em3 Wasser zugege ben und das Rühren eine weitere Stunde fortgesetzt.
Das Gemisch wurde mit 25 cm3 Chloroform verdünnt und filtriert und der Rückstand auf dem Filter mit insgesamt 200 cm3 heissem Chloroform gewaschen. Die Chloroformwaschlösungen und das Filtratwurden ver einigt, mit Salzlösungen gesättigt und die Chloroform- schichten abgetrennt. Dann wurde die Chloroform schicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde zweimal aus Aceton-Äther umkristallisiert und ergab 6a-Methyl - I1ss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20- dion-21-acetat.
<I>Präparat 4</I> 0,5 g 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy-4- pregnen-3,20-dion-21-acetat wurden in 20 cm3 einer Lösung von 0,3g Natriumhydroxyd in 18 cm3 Metha nol und 2 cm3 Wasser gelöst und 6 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre stehengelassen.
Darauf wurde die Lösung mit 100 cm3 Wasser verdünnt und auf 0-50 gekühlt. -Das wässrige Gemisch wurde dann fil triert und der Niederschlag zweimal aus Aceton- Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert. Es wurde reines 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen- 3,20-dion erhalten.
<I>Präparat 5</I> Ein Gemisch aus 0,2 g 6a-Methyl-llss,16a,17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,1 cm?, Essigsäure anhydrid und 1 cm3 Pyridin liess man vier Stunden stehen. Darauf wurde das Gemisch in 15 cm3 Wasser gegossen, das wässrige Gemisch wurde auf 0-50 ab gekühlt und filtriert. Der so gesammelte Niederschlag wunde wiederholt mit Wasser gewaschen und schliess lich aus Methanol umkristallisiert. Man erhielt 6a Methyll 1 0-16a,17a,21 -itetraoxy-4-Apregnen-3,20-dion- 16,21-diacetat.
<I>Präparat 6</I> Ein Gemisch aus 0,2 g6a-Methyl-11ss,16a,1-7a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acetat, 1 cm3 Ben- zoylchlorid und 2 cm3 Pyridin wurde über Nacht (18 Stunden) bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Gemisch wurde in 30 em3 Wasser gegossen und die wässrige Lösung zweimal mit je 20 cm3 Methylen- chlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wur den vereinigt, wiederholt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der so erhaltene Rückstand dreimal aus.
Äthanol um- kristallisiert. Er ergab ba-Methyl-llss,16a,17a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion16-benzoat,-21- acetat. <I>Beispiel 1</I> 6a- Methyl-11 ss,16a,17a,21 - tetraoxy -1,4 - preg- nadien-3,20-dion.
Je 100 cm?, eines Mediums aus 11/o, Glukose, 21/o Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungs- wasser in sechs je 250 cm3 fassenden Erlenmeyer- kolben wurden auf .einen pH-Wert von 5,9 einge stellt.
Dieses Medium wurde 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem ein- bis zweitägigen Wachstum von Septomyxa affi- nis ATCC 6737 geimpft. Die Erlenmeyer-Kolben wurden drei Tage lang bei Raumtemperatur (etwa 240) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit wurden die ganzen 600 cm3 als Impfstoff für 10 Liter des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 10: cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und 1% Oktadekanol) enthält, verwendet. Der Gärbehälter wurde in ein Wasserbad von 280 gestellt, der Inhalt gerührt (300 U. p. M.) und belüftet (0,5 1 Luft/10 1 Gärmedium).
Nach 17 stündiger Inkubation, als sich ein gutes Wachs tum entwickelt hatte und der Säuregrad auf einen pH-Wert von 6,7 angestiegen war, fügte man 2 g 6a-Methyl-,1 1ss,16a,17a,21-tetraoxy-4,pregnen - 3,20 - dion-21-acetat und 1 g 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, in<B>115</B> cm3 Dimethylformamid gelöst, zu. Die Inku- batnon wurde bei gleicher Temperatur und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt.
Das Mycel wurde abfiltriert, das Steroidmaterial mit Methylenchlorid extrahiert, die Methylenchlorid-Extrakte zur Trockne einge dampft und der erhaltene Rückstand über eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat ( Florisil ) chro- matographiert. Die Säule enthielt 200 g synthetisches Magnesiumsilikat und wurde fünfmal mit je 400-cm3- Fraktionen, die jeweils aus Methylenchlorid,
Hexan- kohlenwasserstoff-Aceton-Gemischen im Verhältnis 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3, 1 : 1 und Methanol bestanden, ent wickelt. Die mit Hexankohlenwasserstoff-Aceton (7: 3) eluierte Fraktion wurde zweimal aus Aceton umkristallisiert und ergab 1-Dehydro-6a-methyl-16a- oxyhydrocortison (6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetra- oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion).
In der im Beispiel 1 gezeigten Weise werden durch Fermentation mit Mikroorganismen der Gat tungen Corynebacterium, Didymella, Calonectria@, Alternaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Pro- aminobacter, Ophiobolus, Septomyxa, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, Mycobacterium, Streptomy- ces (z.
B. Lavendulae), Pseudermonas (z. B. Testo- steroni), Bacillus (insbesondere B. sphaericus), No- cardia, Micromonospora und Gliedern der Familie Tuberculariaceae 6-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 4-pregnen-3,20-dion und alle davon abgeleiteten Mono- oder Diester zum 6a-Methyl-llss,l6a,17a,21- tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion umgewandelt.
Das Produkt von Beispiel 1 kann wie folgt in das 1-Dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortison-16, 21-diacetat umgewandelt und zur 11-Ketoverbindung oxydiert werden: Eine Mischung aus 200 mg 6a-Methyl-llss,16a, 17a,21-tetra;oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion, 1 em3 Es sigsäureanhydrid und 2 cm3 Pyridin liess man fünf Stunden bei Raumtemperatur stehen und goss sie dann in 25 cm-' Wasser.
Die wässrige Lösung wurde auf etwa 5 C abgekühlt und abfiltriert und der Nieder schlag, der zweimal aus Methanol umkristallisiert wurde, ergab 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 1,4-pregnadien-3,20-dUon-16,21-diacetat (1-Dehydro- 6a-methyl-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacetat).
Ein Gemisch aus. 0,5 g 6a-Methyl-llss,16a,17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat, 0,20 g Natriumbichromat, 10 em3 Eisessig und 1 cm3 Wasser wurde gerührt und darauf acht Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Anschliessend wurde das Gemisch in 50 ein- Eiswasser gegossen, durch Zu gabe von verdünntem Natriumhydroxyd neutralisiert, der so erhaltene Niederschlag auf einem Filter ge sammelt und dreimal aus Äthylacetat und Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert. Es ergab 6a- Methyl -16u,17a,21 - trioxy-1,4-pregnadien-3,11,20- trion-16,21-diacetat.
Analog lässt sich 6a-Methyl-9a-fluor-11ss,16a,17a, 21-tetraoxy-1,4@pregnadien-3,20-dion-16,21- diacetat zum 6a-Methyl-9a-fluor-16a,17a,21-trioxy-1,4-preg- nadien-3.11.20-trion-16,21-diacetat oxydieren.
Nach dem obigen Veresterungsverfahren erhält man unter Verwendung anderer Säureanhydride oder Säurehalogenide in Pyridinlösung die entsprechenden Ester des 6a - Me.thyl - 1 lss,16a,17a,21- tetraoxy-1,4- pregnadien-3,20-dions, z.
B. das Dipropionat, Dibu- tyrat, Divalerat, Dihexanoat, Dilaurat, Bis-tert.- butylacetat, Di-(ss-cyclopentylproprionat), Dibenzoat, Bis-phenylacetat, Bis-phenylproprionat, Bis-(hemisuc- cinat), Diacrylat, Bis-crotonat, Dipropiolat,
Di-(2- butinoat), Bis-cinnamat und dergleichen.
Die 6/3-Epimeren werden unter Anwendung von 6ss-Methyl 1 lss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4 - pregnadien - 3,20-dion als Ausgangsmaterial in der gleichen Weise wie die 6a-Epimeren hergestellt.
<I>Präparat 7</I> Ein Gemisch aus 1 g 6a-Methyl-11/)',16a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat, 650 mg N-Bromacetamid und 6 cm3 Pyridin wurde im Dun keln 30 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde in einem Eiswasserbad gekühlt, und ein Schwefeldioxyd- Strom wurde so lange auf die Oberfläche des gerühr ten Gemisches geleitet, bis man einen negativen Kaliumjodid-Stärke-Test erhielt. Das. Gemisch wurde dann mit 50 cm3 Wasser versetzt und 30 Minuten auf einer Temperatur von etwa 5 gehalten.
Der ausgefällte weisse Feststoff wurde filtriert, mit Was ser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Nach der Umkristallisation aus Aceton erhielt man 6(.z- Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9 (11) -pregnadien - 3,20- dion-16,21-diacetat.
<I>Präparat 8</I> Eine Lösung von 0,5 g 6(i-Methyl-16a,17a,21- trioxy-4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat in 20 cm3 Methylenchlorid wurde mit einer Lösung von 1 cm-' 71 0/aiger Perchlorsäure in 10 ein- Wasser und 200 mg N-Bromacetamid in 50 cm3 tert. Butyl- alkohol versetzt. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann mit einer Lö sung von 0,3g Natriumsulfit in 12 cm?, Wasser ver mischt.
Das Gemisch wurde so lange bei vermin dertem Druck destilliert, bis die restliche Lösung wolkig wurde. Dann fällte man das Produkt durch Zugabe von 100 ein- eines Eis-Wasser-Gemisches aus. Der weisse kristalline Niederschlag wurde fil triert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus einem Gemisch von Aceton und Hexankohlenwas- serstoffen umkristallisiert. Es ergab 6a-Methyl-9a- brom-1 li)',16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion- 16,21-diacetat.
<I>Präparat 9</I> Ein Gemisch aus 0,45 g 6a-Methyl-9a-brom- l lss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21- diacetat, 0,45 g wasserfreiem Kaliumacetat und 20 cm3 Aceton wurde bei Rückflusstemperatur fünf Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde darauf abge kühlt, in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wurde ge trocknet und über eine Säule von 25 g synthetischem Magnesiumsilikat gegossen.
Die Säule wurde mit Hexankohlenwasserstoffen enwickelt, die zunehmende Anteile Aceton enthielten. Das Eluat aus Hexan- kohlenwasserstoff + 10-0/ü Aceton enthielt das 6a- Methyl - 9ss,11(3-oxido - 16a,17a,21-trioxy-4-pregnen 3,20-dion-16,21-d'iacetat.
<I>Präparat 10</I> Eine Lösung von 1 g 6a-Methyl-9ss,11/3-oxido- 16r-i,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-dti.acetat wurde in 50 cm3 Methylenchlorid gelöst und mit 5 cm- 48ühiger Fluorwasserstoffsäure und 0,5 cm3 71 ü/aiger Perchlorsäure versetzt. Das Gemisch wurde sechs Stunden kräftig gerührt und darauf in einen Überschuss kalter, wässriger, 5ü/oiger Natriumbikar- bonatlösung gegossen.
Die Methylenchlorid'schicht wurde abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, zur Trockne eingedampft und der so erhaltene Rückstand aus Aceton und Hexankohlen- wasserstoffen umkristallisiert. Er ergab 6a-Methyl- 9a-fluor - 11ss,16a,17a-21-tetra.oxy-4-pregnen - 3,20- dion-16,21-diacetat.
<I>Präparat 11</I> Aus 0,5g 6 a-Methyl-9a-fluor-11/3,16a,17a,21-tetra oxy-4-pregnen-3,20-dion-16,2i-diacetat, 100 mg Ka- liumhydroxyd in 10 em3 1 cm?, Wasser enthaltendem Methanol wurde eine Lösung hergestellt. Dieses Ge misch wurde sechs Stunden in einer Stickstoffatmo sphäre stehengelassen, in 50 CM3 Eiswasser gegos sen und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure neu tralisiert. Anschliessend wurde das wässrige Gemisch auf etwa 5 abgekühlt, zwei Stunden bei dieser Tem peratur stehengelassen und filtriert.
Der so erhal tene Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und zweimal aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen um kristallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor-llss,16a, 17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-ddon.
<I>Präparat 12</I> 0,2 g 6a-Methyl-9a-fluor-11/3,16a,17a,21-tetra- oxy-4-pregnen-3,20-dion werden mit 1 cm3 Propion- säureanhydrid in 2 CM3 Pyridin vermischt. Man liess das Gemisch etwa 18 Stunden stehen und goss es dann in 50 cm3 Wasser. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und nach dreimali gem Waschen aus Aceton-HexankohlenwasSerStoffen umkristallisiert.
Es ergab 6a-Methyl-9a-fluor-11ss, 16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen -3,20- dion-16,21- dipropionat.
<I>Beispiel 2</I> 6a-Methyl-9a fluor-11,ss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4- pregnadien-3,20-dion (1-Dehydro-6a-methyl-9a-fluor- 16a-oxyhydrocortison).
Je 100 CM3 eines Mediums aus<B>10/9</B> Glukose, <B>20/6</B> Maisquellwasser (60 0/ü Feststoffe) und Leitungs wasser in drei je 250 cms fassenden Erlenmeyer-Kol- ben wurden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem ein bis zwei Tage alten Wachstum von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyer-Kolben wurden drei Tage lang bei Raumtemperatur (etwa 26 bis 28 Grad) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit wurden die 300 cm3 als Impfstoff für 5 1 des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischäumers. (Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthielt, verwendet. Der Gärbehälter wurde in ein Wasserbad von 28 Grad gestellt, der Inhalt wurde gerührt (300 U. p. M.) und belüftet (0,3 1 Luft/51 Gärmedium). Nach 20 stündiger Inkubationszeit, als sich ein gutes.
Wachs tum entwickelt hatte, wurden 1 g 6a-Methyl-9a-fluor- llss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dilon und r/2 g 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, in 16 cm3 Di- methylformamid gelöst, zugegeben und die Inku bation bei gleicher Temperatur (28 Grad) und Be lüftung 72 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wurde abfiltriert und dreimal mit je 200 CM3 Methylenehlorid extrahiert.
Darauf wur den die Extrakte vereinigt, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet, eingeengt und der erhaltene Rückstand dreimal aus, Aceton-Hexankohlenwasser- stoffen umknistallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor- 11ss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4 -pregnadien-3,20 - dion (1-Dehydro-6a-methyl-9 a-fluor-16 a-oxyhydrocortisan).
In analoger Weise, unter Verwendung anderer Arten der Gattung Septomyxa bei bekannten Gä- rungsbedingungen, vorzugsweise in Gegenwart eines Promotors, wie 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, Proge steron, llss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on, 3- Ketobisnor-4-cholensäure oder dergleichen, erhält man aus 6-Methyl-9a-fluor-l 1ss, 16a,17a,21-tetraoxy- 4-pTegnen-3,20-dion das 6-Methyl-9a-fluor-11ss,
16a, 17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion. Anstelle von Septomyxa können andere Mikroorganismen wie Corynebacterium, Didymella, Bacillus, Calonectria" Alternaria, Col'letotrichum, Cylindrocarpon, Pro- aminobacter, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysü- pelothrix, Mycobacterium,
Leptosphaeria, Cucurbi- taria, Streptomyces, Nocardia, Pseudomonas, Micro- monospora und Pilze der Familie Tuberculariaceae verwendet werden, um eine dl-Bindung in das 6- Methyl-9a-fluor-1 lss,16a,17a,21-tetraioxy-4- pregnen- 3,20-dion einzuführen.
Wird bei der obigen Fermentation 6ss-Methyl-9a- fluor-1 lss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen- 3,20 - dion als Ausgangssteroid verwendet, so führt dies zu der Herstellung von 6ss-Methyl-9a-fluor-11ss,16a,17a,21- tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion.
Das Produkt von Beispiel 2 lässt sich wie folgt verestern:. a) Ein Gemisch aus 0,2 g 6a Methyl-9a-fluor- 11ss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4 -pxegnadieri#-3,20-dion, 1 em3 Essigsäureanhydrid und 1 CM3 Pyridin wurde sechs Stunden stehengelassen, dann in 20 cm3 Was ser geschüttet;
das wässrige Gemisch wurde auf etwa 5 gekühlt und filtriert. Der gesammelte Niederschlag wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und schliess lich aus Methanol umkristallisiert. Er ergab 6a- Methyl-9a-fluor- <I>l</I> lss,16a,17a,21, ,-;tetraoxy-n1,4-;preg- nadien - 3,20 - dion - 16,21- diacetat- (1-Dehydro-6a- methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacetat).
b) Ein Gemisch aus 0,2 g 6a-Methyl-9-fluor- llss,16a,17a,21 tetraoxy-1,4 -pregnadien-3,204dion, 1 cms Benzoylchlorid und 2 cmj Pyridin liess man bei Raumtemperatur (etwa 25 Grad) über Nacht stehen. Es wurde dann in 20 cm- Wasser gegossen und die wässrige Lösung wurde zweimal mit 10 cm3 Methylenchlorid extrahiert.
Die Methylenchloridan- teile wurden vereinigt, wiederholt mit Wasser gewa schen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der so erhaltene Rückstand wurde dreimal aus Athanol umkristallisiert. Er ergab 6a- Methyl-9a-fluori-1 lss,16a,17a,21@-'tetraoxy-@ 1,4-preg- nadien-3,20-dion-16,21-dibenzoat.
Aus obigem 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat (siehe Bei spiel 1) kann z. B. mit N-Bromacetamid 6a-Methyl- 16a,17a,21-trioxy-1,4,9(11) -pregnatrien-3,20-dion- 16,21-diacetat erhalten werden, das unter Einwir kung von Perchlorsäure und N-Bromacetamid 6a Methyl-9a-brom-11ss,16a,17a,21-tetraoxy.-1,4-preg- nadien-3,20-don-16,21-diacetat ergibt.
Letzteres lie fert beim Kochen mit wasserfreiem Kadiumacetat und Aceton 6a-Methyl-9ss,llss-oxido-16a,17a,21- trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat, das mit 480/aiger Fluorwasserstoffsäure und Perchlor- säure 6a-Methyl-9a-fluor-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat ergibt.
PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindun- gen der Formel 1
EMI0006.0055
und deren 9a-Fluoranalogen, dadurch gekennzeich net, dass man ein 6-Methyl-1 da-oxy-hydrocortison, dessen 21-Acylat oder 16,21-Diacylat bzw.
ein 6- Methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocortison, dessen 21- Acylat oder 16,21-Diacylat mittels eines eine Dop pelbindung in 1,2-Stellung einführenden Organismus vergärt.
Process for the production of steroid compounds The invention relates to a process for the production of steroid compounds of the formula I.
EMI0001.0003
and their 9a-fluoro analogs, which is characterized in that a 6-methyl-16cc-oxy-hydrocortisone, its 21-acylate or 16,21-diacylate or a 6-methyl-9a-fluoro-16a oxy-hydrocorti.son, its sen 21-acylate or 16,21-diacylate by means of a double bond in 1,
2-position introducing organism fermented.
The starting materials of the process according to the invention can be obtained; by reacting a 6-methyl-11 ss, 21-dioxy-4,16-pregnadiene-3,20-dione-21-acylate, in which the acyl group comes from a carboxylic acid, preferably a hydrocarbon carboxylic acid, with osmium tetroxide and hydrolyzed, whereby the 6-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acylate is obtained;
the monoester can be hydrolyzed to 6-methyl-16a-oxyhydrocortisone and the free diol esterified to the diester 6-methyl-16a-oxyhydrocortisone-16,21-diacylate, which is then subjected to the reaction according to the invention.
To prepare the fluorine-containing starting materials, the above diester can be treated with an N-haloacylamide or an N-haloacylamide and then with sulfur dioxide, the corresponding 6-methyl-16a, 17a, 21-trioxy-4,9 (11) -pregnadiene - 3,20-dione 16,21-diacylate is obtained;
the 6-methyl-16a, 17a-trioxy-4,9 (11) -pregnadiene-3,20-dione-16a, 21-diacylate prepared in this way is treated with a hypohalous acid which z. B. by reaction of an N-haloacylamide or an N-haloacyl imide, in which the halogen is chlorine or bromine, to the 6-methyl-9a-halogen-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3.20 -dione-16,21-diacylate reacted;
the 6-methyl-9a-halogen-11ss, 16a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-16,21-diacylate obtained in this way is either with a weak base such as sodium or potassium acetate, or the smallest calculated amount of a strong base dehydrohalogenated to give 6-methyl-9ss, 11ss-oxido-16a, 17a, 21-trioxy-4-pregnene-3,20-dione-16,21-diacylate;
this oxido compound is converted to the corresponding 6-methyl-9a-fluoro-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnene-3,20-dione-16,21-diacylate (6-methyl- 9a-fluoro-16a-oxyhydrocortisone-16,21-diacylate) implemented.
The 6a-methyl-9a-fluoro-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-16,21-diacylate or the free alcohol produced by hydrolysis with a base is then the fermentation component according to the invention effect by the d'-bond introducing organisms, z. B. species of the genus Septomyxa, Coryne- bacterium, Fusarium or the like, subjected to the production of the corresponding 4 'analog.
The corresponding 11-ketone analogues of these compounds can be obtained in acetic acid by oxidation of the 11-oxy-16,21-diester compounds with an oxidizing agent such as chromic anhydride. As starting compounds, preference is given to those which contain the methyl group in the 6a position.
The novel compounds obtainable according to the invention 1-dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortisone, 1-dehydro-6-methyl-9a-fluoro-16a-oxyhydrocortisone and their esters, in particular as 6a-epimers, are highly active adrenal hormones with a greater glucocorticoid effectiveness than hydrocortisone or cortisone. These compounds also have diuretic and salt loss-inducing properties that make them particularly useful in the treatment of chronic,
Congestive heart damage and liver cirrhosis, nephrotic and andrenogenital syndromes and in the treatment of eclampsia or preeclampsia.
The new compounds can be administered in oral, parenteral or topical compositions. The tablets intended for oral use can contain 5-10 mg of active compound per tablet and additionally inert substances such as lactose, sucrose, calcium stearate or the like, usually about 100-200 mg of inert binding substances.
When using 1- dehydro-6a-methyl-16a-oxyhydrocortisone in tablet form, amounts between 3-6 mg per tablet are preferred, with 1-dehydro-6-methyl-9a-fluoro-16a-oxyhydrocortisone tablets 1- 5 mg of the active substance is satisfactory. With topical treatment, the active steroid ingredients in the form of ointments, bougies, lotions, jellies, solutions or suspensions or as an aerosol, eg. B. in nasal treatments are used.
In these compositions, the 6a epimers are preferred, but the 6/3 methyl epimers can also be used in pharmaceutically equivalent amounts. Water-soluble esters of polybasic acids and their salts, such as 21-hemisuccinate sodium salt or the hemi- / 3, / 3-dimethylglutarate sodium salt of the above products, are particularly suitable for parenteral use.
The preparation of the starting materials of the present invention and possible reactions with the process products can take place as shown in preparations 1-33.
In the process according to the invention, 6-methyl-16a-oxyhydrocortisone or 6-methyl-9cc-fluoro-16a-oxyhydrocortisone is produced either as a 21-ester or as a 16,21-diester or as a free alcohol from the action of a dl bond in the ferment Organism, e.g.
B. a species of the genus Septomyxa, Cornebacterium, Fusarium, Proaminobacter, Microbacterium, Streptomyces (e.g. Lavadulae), Pseudomonas (e.g.
B. Testosteroni), Ophiobolus, Calonectria, Alternaria, Dydimella, Cylindrocarpon, Listeria, Colletotrichum, Erysipelothrix, Ba: cillus (especially B. sphaericus), Nocardia, members of the family Tuberculariaceae, Micromonospora and the like, preferably of the species Septomy, subject.
The fermentation is carried out in the usual way; preferably at Temperatu ren between 24 and 30, or, depending on the type of organism used, at slightly lower or higher temperatures, e.g. B. between 15 and 35, and the substrate is suspended in a nutrient mixture containing compounds containing assimilable carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus and the like.
After the mixture has been filtered and the solids have been washed with a water-immiscible organic solvent, the filtrate and the washing solutions have been extracted with an organic solvent and the solvent has evaporated, the 6-methyl-11 [>, 16a, 17a, 21-tetra-oxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione or its 9a-fluoro analogues, which can be purified by recrystallization and; "or chromatography.
The treatment, for example, of the monoester 6-methyl-11 / 3,16a, 17a, 21-tetraoxy- 4- pregnen- 3,20-dione-21-acylate or 6-methyl-11 / 3,16a, 17a, 21- Tetraoxy-3,20-dione with an acylating agent leads to the corresponding 16,21-diester of 6-methyl-16a-oxyhydrocortisone or 1-dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortisone.
<I> Preparation 1 </I> A solution containing 1.65 g of semicarbazide hydrochloride in 10 cm of water was added to a solution of 1 g of 6a-methyl-hydrocortisone acetate [Spero et al., J. Am. Chem. Soc. 78, p. 6213 (1956)] in 1.2 cm33 pyridine and 40 cm3 methanol. This mixture was refluxed for 18 hours, then concentrated to 20 cm3 and poured into 500 cm3 of ice-cold water.
The reaction mixture was then kept at 0 for 6 hours and then filtered. The precipitate was washed with ice water and dried. The colorless crystals, <B> 1.216 </B> g of 3,20-disemicarbazone of 6a-methyl-hydrocortisone-21-acetate, had a melting point of more than 300; [a] 1,: A-173 '(dioxane).
<I> Preparation 2 </I> 1 g of the 6a-methyl-hydrocortisone-acetate-3,20-bisemicarbazone prepared according to preparation 1 was dissolved in 20 cm-glacial acetic acid and 1 cm33 acetic anhydride. This mixture was refluxed for one hour in a nitrogen atmosphere. The reaction mixture was then concentrated in vacuo to about 12 cm, treated with 6 cm pyruvic acid and then kept at room temperature for 40 hours. The mixture is then heated to 60 ° C. for 2 hours, cooled and diluted with 600 cm33 of water.
The aqueous mixture is then extracted three times with 400 cm33 of chloroform each time, and the chloroform extracts are washed twice with 100 cm3 of sodium carbonate solution each time and three times with 100 cm33 of water each time. The chloroform extracts washed and combined in this way are dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness.
The crude residue containing 6a-methyl-llss, 21-dioxy-4,16-pregnadiene-3,20-dione-21-acetate was added to 70 g of aluminum oxide using benzene, benzene: ether, ether, ether: methylene chloride, Chromatographed methylene chloride and methanol, fractions of 60 cms each were removed.
The middle fractions obtained with ether WUR the combined, crystallized and recrystallized from benzene-hexane hydrocarbons and gave a total of 122 mg of 6a-Methylllss, 21-dioxy-4,16-pregnadiene-3,20-dione with a melting point of about 115 C and a second melting point of 152-1540 C; [a] D: + 177 C (chloroform).
<I> Preparation 3 </I> A reaction mixture of 90 mg 6a-methyl-11ss, 21-dioxy-4,16-pregnadiene-3,20-dione-21-acetate, 6.5 mg osmium tetroxide in 2.5 cm3 benzene and 0.12 cm3 of pyridine was left to stand at room temperature for 95 hours. A solution of 0.7 g of anhydrous sodium sulfite and 0.7 g of potassium bicarbonate in 65 liters of water was then added to the mixture while stirring, and stirring was continued for a further 16 hours. Then the mixture was diluted with 10 cm chloroform and filtered.
The residue on the filter was washed with a total of 100 cm3 of hot chloroform. The chloroform washing solutions and the filtrate were combined, saturated with a salt solution, and the chloroform layer was separated. The chloroform layer was then dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness.
The residue, weighing about 100 mg, was recrystallized twice from acetone-ether and yielded 39 mg of 6a-methyl-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione with a melting point of 215-217; [a] D: -I-680 (dioxane).
<I> Preparation 3a </I> A reaction mixture of 200 mg 6a-methyl-Iss, 21-dioxy-4,16-pregnadiene-3,20-dione-21-acetate, 145 mg osmium tetroxide in 6 cm3 benzene and 0 , 30 cm3 of pyridine were left to stand for 76 hours at room temperature. A solution of 1.5 g of anhydrous sodium sulfite and 1.5 g of potassium bicarbonate in 140 cubic meters of water was then added to the mixture while stirring, and stirring was continued for a further hour.
The mixture was diluted with 25 cm3 of chloroform and filtered and the residue on the filter was washed with a total of 200 cm3 of hot chloroform. The chloroform washes and the filtrate were combined, saturated with salt solutions, and the chloroform layers separated. Then the chloroform layer was dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness.
The residue was recrystallized twice from acetone-ether and gave 6a-methyl-I1ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate.
<I> Preparation 4 </I> 0.5 g of 6a-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate were in 20 cm3 of a solution of 0.3 g Sodium hydroxide dissolved in 18 cm3 methanol and 2 cm3 water and left to stand for 6 hours in a nitrogen atmosphere.
The solution was then diluted with 100 cm3 of water and cooled to 0-50. The aqueous mixture was then filtered and the precipitate was recrystallized twice from acetone-hexane hydrocarbons. Pure 6a-methyl-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnene-3,20-dione was obtained.
<I> Preparation 5 </I> A mixture of 0.2 g 6a-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione, 0.1 cm?, Acetic anhydride and 1 cm3 pyridine was left to stand for four hours. The mixture was then poured into 15 cm3 of water, the aqueous mixture was cooled to 0-50 and filtered. The precipitate collected in this way was repeatedly washed with water and recrystallized from methanol. 6a methyl1 0-16a, 17a, 21 -itetraoxy-4-apregnene-3,20-dione-16,21-diacetate were obtained.
<I> Preparation 6 </I> A mixture of 0.2 g6a-methyl-11ss, 16a, 1-7a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-21-acetate, 1 cm3 benzoyl chloride and 2 cm3 of pyridine was left to stand overnight (18 hours) at room temperature.
The mixture was poured into 30 cubic meters of water and the aqueous solution was extracted twice with 20 cm3 of methylene chloride each time. The methylene chloride extracts were combined, washed repeatedly with water, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated, and the residue thus obtained was extracted three times.
Recrystallized ethanol. It gave ba-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione16-benzoate, -21-acetate. <I> Example 1 </I> 6a-methyl-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione.
100 cm each of a medium made of 11 / o, glucose, 21 / o corn steep water (60% solids) and tap water in six 250 cm3 Erlenmeyer flasks were adjusted to a pH of 5.9.
This medium was sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with Septomyxa affinis ATCC 6737 growth for one to two days. The Erlenmeyer flasks were shaken at room temperature (about 240) for three days.
At the end of this time, the entire 600 cm3 was used as a vaccine for 10 liters of the same medium of glucose and corn steep liquor, which additionally contains 10: cm3 of an antifoam agent (a mixture of lard oil and 1% octadecanol). The fermentation tank was placed in a 280 water bath, the contents stirred (300 r.p.m.) and aerated (0.5 1 air / 10 1 fermentation medium).
After 17 hours of incubation, when good growth had developed and the acidity had risen to a pH of 6.7, 2 g of 6a-methyl-, 1 1ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4, pregnen - 3.20 - dione-21-acetate and 1 g of 3-keto-bisnor-4-cholen-22-al, dissolved in 115 cm3 of dimethylformamide. The incubation was continued for 24 hours at the same temperature and ventilation.
The mycelium was filtered off, the steroid material extracted with methylene chloride, the methylene chloride extracts evaporated to dryness and the residue obtained was chromatographed on a column of synthetic magnesium silicate (Florisil). The column contained 200 g of synthetic magnesium silicate and was filled five times with 400 cm3 fractions each, each consisting of methylene chloride,
Hexane hydrocarbon-acetone mixtures in the ratio 9: 1, 8: 2, 7: 3, 1: 1 and methanol passed, developed. The fraction eluted with hexane hydrocarbon-acetone (7: 3) was recrystallized twice from acetone to give 1-dehydro-6a-methyl-16aoxyhydrocortisone (6a-methyl-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4 -pregnadiene-3,20-dione).
In the manner shown in Example 1, fermentation with microorganisms of the species Corynebacterium, Didymella, Calonectria @, Alternaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Praminobacter, Ophiobolus, Septomyxa, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, Mycobacterium (Streptomy- ces.
B. Lavendulae), Pseudermonas (e.g. Testosteroni), Bacillus (especially B. sphaericus), Nocardia, Micromonospora and members of the family Tuberculariaceae 6-Methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy- 4- pregnen-3,20-dione and all mono- or diesters derived therefrom converted to 6a-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione.
The product of Example 1 can be converted into 1-dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortisone-16, 21-diacetate and oxidized to the 11-keto compound as follows: A mixture of 200 mg 6a-methyl-llss, 16a, 17a , 21-tetra; oxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione, 1 em3 of acetic anhydride and 2 cm3 of pyridine were left to stand for five hours at room temperature and then poured into 25 cm of water.
The aqueous solution was cooled to about 5 ° C. and filtered off and the precipitate, which was recrystallized twice from methanol, gave 6a-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dUon- 16,21-diacetate (1-dehydro-6a-methyl-16a-oxyhydrocortisone-16,21-diacetate).
A mixture of. 0.5 g of 6a-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate, 0.20 g of sodium dichromate, 10 cubic meters of glacial acetic acid and 1 cm3 of water stirred and then left to stand for eight hours at room temperature.
The mixture was then poured into ice water, neutralized by adding dilute sodium hydroxide, the resulting precipitate was collected on a filter and recrystallized three times from ethyl acetate and hexane hydrocarbons. It gave 6a-methyl-16u, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,11,20-trione-16,21-diacetate.
Similarly, 6a-methyl-9a-fluoro-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4 @ pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate can be converted into 6a-methyl-9a-fluoro-16a, 17a Oxidize, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3.11.20-trione-16,21-diacetate.
According to the above esterification process, using other acid anhydrides or acid halides in pyridine solution, the corresponding esters of 6a - methyl - 1 lss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione, e.g.
B. the dipropionate, dibutyrate, divalerate, dihexanoate, dilaurate, bis-tert-butyl acetate, di- (ss-cyclopentyl propionate), dibenzoate, bis-phenyl acetate, bis-phenyl propionate, bis (hemisuccinate), diacrylate, Bis-crotonate, dipropiolate,
Di (2-butinoate), bis-cinnamate and the like.
The 6/3 epimers are prepared using 6ss-methyl 1 lss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione as starting material in the same manner as the 6a-epimers.
<I> Preparation 7 </I> A mixture of 1 g 6a-methyl-11 /) ', 16a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dione-16,21-diacetate, 650 mg N-bromoacetamide and 6 cm3 pyridine was stirred in the dark for 30 minutes. The mixture was cooled in an ice-water bath and a stream of sulfur dioxide was applied to the surface of the stirred mixture until a negative potassium iodide starch test was obtained. The. The mixture was then treated with 50 cm3 of water and held at a temperature of about 5 for 30 minutes.
The precipitated white solid was filtered, washed with water and dried under vacuum. After recrystallization from acetone, 6 (.z-methyl-16a, 17a, 21-trioxy-4,9 (11) -pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate was obtained.
<I> Preparation 8 </I> A solution of 0.5 g of 6 (i-methyl-16a, 17a, 21-trioxy-4,9 (11) -pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate in 20 cm 3 of methylene chloride was mixed with a solution of 1 cm -1.71% perchloric acid in 10% water and 200 mg of N-bromoacetamide in 50 cm 3 of tert-butyl alcohol.The solution was kept at room temperature for 15 minutes and then with a solution of 0.3g sodium sulfite in 12 cm ?, water mixed.
The mixture was distilled under reduced pressure until the remaining solution became cloudy. The product was then precipitated by adding 100% of an ice-water mixture. The white crystalline precipitate was filtered off, washed with water, dried and recrystallized from a mixture of acetone and hexane hydrocarbons. It gave 6a-methyl-9abromo-1 li) ', 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnene-3,20-dione-16,21-diacetate.
<I> Preparation 9 </I> A mixture of 0.45 g of 6a-methyl-9a-bromo- lss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnene-3,20-dione-16,21-diacetate , 0.45 g of anhydrous potassium acetate and 20 cm3 of acetone were heated at reflux temperature for five hours. The mixture was then cooled, poured into water and extracted with methylene chloride. The methylene chloride extract was dried and poured over a column of 25 g of synthetic magnesium silicate.
The column was developed with hexane hydrocarbons containing increasing amounts of acetone. The eluate from hexane hydrocarbon + 10-0 / ü acetone contained the 6a-methyl - 9ss, 11 (3-oxido - 16a, 17a, 21-trioxy-4-pregnen 3,20-dione-16,21-d ' acetate.
<I> Preparation 10 </I> A solution of 1 g 6a-methyl-9ss, 11/3-oxido- 16r-i, 17a, 21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione-16,21- dti.acetat was dissolved in 50 cm3 of methylene chloride and treated with 5 cm3 of 48% hydrofluoric acid and 0.5 cm3 of 71% perchloric acid. The mixture was stirred vigorously for six hours and then poured into an excess of cold, aqueous, 5% sodium bicarbonate solution.
The methylene chloride layer was separated off, dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness, and the residue thus obtained was recrystallized from acetone and hexane hydrocarbons. It gave 6a-methyl-9a-fluoro-11ss, 16a, 17a-21-tetra.oxy-4-pregnene-3,20-dione-16,21-diacetate.
<I> Preparation 11 </I> Made from 0.5g 6 a-methyl-9a-fluoro-11 / 3.16a, 17a, 21-tetra oxy-4-pregnen-3,20-dione-16,2i-diacetate A solution was prepared, 100 mg of potassium hydroxide in 10 em3 1 cm? Of methanol containing water. This mixture was left to stand for six hours in a nitrogen atmosphere, poured into 50 cm 3 of ice water and neutralized with dilute hydrochloric acid. The aqueous mixture was then cooled to about 5, allowed to stand for two hours at this temperature and filtered.
The precipitate thus obtained was washed with water and recrystallized twice from acetone-hexane hydrocarbons. It gave 6a-methyl-9a-fluoro-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-ddon.
<I> Preparation 12 </I> 0.2 g 6a-methyl-9a-fluoro-11 / 3,16a, 17a, 21-tetra-oxy-4-pregnen-3,20-dione are mixed with 1 cm3 propionic acid anhydride mixed in 2 CM3 pyridine. The mixture was left to stand for about 18 hours and then poured into 50 cm3 of water. The precipitate formed was collected by filtration and, after washing three times, recrystallized from acetone-hexane hydrocarbons.
It gave 6a-methyl-9a-fluoro-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnene -3,20-dione-16,21-dipropionate.
<I> Example 2 </I> 6a-methyl-9a fluoro-11, ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione (1-dehydro-6a-methyl-9a- fluorine-16a-oxyhydrocortisone).
100 cm3 each of a medium made from <B> 10/9 </B> glucose, <B> 20/6 </B> corn steeple (60 0 / g solids) and tap water in three Erlenmeyer flasks, each with a capacity of 250 cm were adjusted to a pH of 4.9. This medium was sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 2 and inoculated with a one to two day old growth of Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737. The Erlenmeyer flasks were shaken for three days at room temperature (about 26 to 28 degrees).
At the end of this time, the 300 cm3 were used as a vaccine for 5 l of the same medium made from glucose and corn steep liquor, the additional 5 cm3 of an antifoam. (Mixture of lard oil and octadecanol) was used. The fermentation tank was placed in a 28 degree water bath, the contents were stirred (300 r.p.m.) and aerated (0.3 l air / 51 fermentation medium). After a 20 hour incubation period, considered a good one.
Growth had developed, 1 g of 6a-methyl-9a-fluoro-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dilone and 1/2 g of 3-keto-bisnor-4-cholen- 22-al, dissolved in 16 cm3 dimethylformamide, is added and the incubation is continued for 72 hours at the same temperature (28 degrees) and aeration (final pH 8.3). The mycelium was filtered off and extracted three times with 200 CM3 methylene chloride each time.
The extracts were then combined, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated, and the residue obtained was recrystallized three times from acetone-hexane hydrocarbons. It gave 6a-methyl-9a-fluoro-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4 -pregnadiene-3,20-dione (1-dehydro-6a-methyl-9 a-fluoro-16 a-oxyhydrocortisane) .
In an analogous manner, using other species of the genus Septomyxa under known fermentation conditions, preferably in the presence of a promoter such as 3-ketobisnor-4-cholen-22-al, progesterone, llss, 21-dioxy-1,4,17 (20) -pregnatrien-3-one, 3- ketobisnor-4-cholenic acid or the like, is obtained from 6-methyl-9a-fluoro-l 1ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pTegnen-3,20- dione 6-methyl-9a-fluoro-11ss,
16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione. Instead of Septomyxa, other microorganisms such as Corynebacterium, Didymella, Bacillus, Calonectria "Alternaria, Col'letotrichum, Cylindrocarpon, Proaminobacter, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysupelothrix, Mycobacterium,
Leptosphaeria, Cucurbitaria, Streptomyces, Nocardia, Pseudomonas, Micro- monospora and fungi of the family Tuberculariaceae are used to form a dl bond in the 6-methyl-9a-fluoro-1 lss, 16a, 17a, 21-tetraioxy-4 - to introduce pregnen- 3,20-dione.
If 6ss-methyl-9a-fluoro-1 lss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20 - dione is used as the starting steroid in the above fermentation, this leads to the production of 6ss-methyl-9a fluoro-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione.
The product of Example 2 can be esterified as follows: a) A mixture of 0.2 g of 6a methyl-9a-fluoro-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pxegnadieri # -3,20-dione, 1 em3 acetic anhydride and 1 cm3 pyridine was left to stand for six hours , then poured into 20 cm3 of water;
the aqueous mixture was cooled to about 5 and filtered. The collected precipitate was washed repeatedly with water and finally recrystallized from methanol. It gave 6a- methyl-9a-fluoro- <I> l </I> lss, 16a, 17a, 21,, -; tetraoxy-n1,4-; preg- nadiene - 3.20 - dione - 16.21- diacetate- (1-dehydro-6a-methyl-9a-fluoro-16a-oxyhydrocortisone-16,21-diacetate).
b) A mixture of 0.2 g of 6a-methyl-9-fluoro-llss, 16a, 17a, 21 tetraoxy-1,4-prepregnadiene-3,204dione, 1 cms benzoyl chloride and 2 cmj pyridine was left at room temperature (about 25 degrees ) stand overnight. It was then poured into 20 cm water and the aqueous solution was extracted twice with 10 cm 3 of methylene chloride.
The methylene chloride components were combined, washed repeatedly with water, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated, and the residue thus obtained was recrystallized three times from ethanol. It gave 6a-methyl-9a-fluoro-1 lss, 16a, 17a, 21 @ - 'tetraoxy- @ 1,4-pregnadiene-3,20-dione-16,21-dibenzoate.
From the above 6a-methyl-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate (see example 1) z. B. with N-bromoacetamide 6a-methyl-16a, 17a, 21-trioxy-1,4,9 (11) -pregnatriene-3,20-dione-16,21-diacetate can be obtained under the influence of perchloric acid and N-Bromoacetamide 6a gives methyl-9a-bromo-11ss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-don-16,21-diacetate.
The latter provides 6a-methyl-9ss, llss-oxido-16a, 17a, 21-trioxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate when boiled with anhydrous kadium acetate and acetone, which contains 480 / aiger hydrofluoric acid and perchloric acid gives 6a-methyl-9a-fluoro-llss, 16a, 17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione-16,21-diacetate.
PATENT CLAIM Process for the production of steroid compounds of formula 1
EMI0006.0055
and their 9a-fluoro analogs, characterized in that a 6-methyl-1 da-oxy-hydrocortisone, its 21-acylate or 16,21-diacylate or
a 6-methyl-9a-fluoro-16a-oxy-hydrocortisone whose 21-acylate or 16,21-diacylate ferments by means of an organism which introduces a double bond in the 1,2-position.