Verfahren zur Herstellung von Steroiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur fermentativen lla-Hydroxylie- rung von Steroiden der Pregnanreihe bei gleichzei tiger oxydativer Abspaltung der Seitenkette in 17- Stellung.
Das erfindungsgemässe Verfahren, das zur Bil dung von 11 a,17ss-Dihydroxysteroiden der Andro- stanreihe führt, ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Steroid der Pregnanreihe, das in 11-Stellung eine Methylengruppe aufweist, bei einer Belüftung mit mehr als 2 1 Luft/Min. pro<B>100</B> 1 Gärmedium mit einem Pilz der Gattung Sporotrichum in Berührung bringt. Dabei tritt gleichzeitig lla-Hydroxylierung und Abbau der 17ständigen Seitenkette ein.
Der Abbau der 17-Seitenkette von Steroidverbin dungen auf rein chemischem Wege ist bekannt, wobei niedrige Ausbeuten erzielt werden. Im vorliegenden Verfahren sind jedoch die Ausbeuten hoch. Der ein zige operative Schritt ist einfach, wobei es von be sonderem Vorteil ist, dass die 11-Methylengruppe gleichzeitig mit der Seitenkette unter Bildung eines 11 a-Hydroxysteroids oxydiert wird.
Die Wirksamkeit von Sporotrichumpilzen bezüglich der 11a-Hydroxy- lierung übersteigt auch diejenige anderer Pilze, die bei andern Substraten wie 1-Dehydrosteroiden einge- setzt werden. Ein weiterer Vorteil der Oxydation mit Sporotrichum besteht darin, dass im Vergleich zu an dern hydroxylierenden Organismen die Bildung von Nebenprodukten minimal ist.
Bei der Durchführung des Verfahrens gemäss vor liegender Erfindung wird das zu behandelnde Steroid- substrat, zweckmässig in einem Lösungsmittel wie Aceton gelöst, der Kultur eines Pilzes der Gattung Sporotrichum ausgesetzt.
Nach Clements und Shear, Genera of Fungi (Hafner Publishing Company, New York, 1954) gehört die Gattung Sporotrichum zur Familie der Moniliaceen der Klasse Deuteromycetes (Fungi Imperfecti). Zu den geprüften und im erfin dungsgemässen Verfahren verwendbaren Gliedern der Gattung Sporotrichum gehören die Arten: Sporotrichum sulfurescens A. T. C.
C. 7159 (Katalognummer der American Type Culture Collection), Sporotrichum carnis A. T. C. C.<B>11501,</B> Sporotrichum camis A. T. C. C. 15507, Sporotrichum epigaeum A. T. C. C. 7145, Sporotrichum bombycinum A. T. C.
C. 7139, Sporotrichum folücola Oud., Sporotrichum pulviniforme Thum, Sporotrichum olivaceum Fr., Sporotrichum globuliferum, Sporotrichum maritimem, Sporotrichum anthophilum, Sporotrichum griseolum,
Sporotrichum roseolum Oud. und Beijerinck, Sporotrichum poae PK., Sporotrichum epui, Sporotrichum Beurmanni M.
und Ram. und Sporotrichum Schencckü. Fermentation, Zusammensetzung des Nährme diums, Art der Beimpfung und Zugabe des Substrates sind nicht entscheidend für das vorliegende Ver fahren. Man kann z. B. nach den von Murray und Peterson in den USA-Patenten Nrn. 2<B>721828</B> und 2 602 769 eingehend beschriebenen Arbeitsweisen vorgehen. Die für die Fermentation zur Verfügung stehende Sauerstoffmenge ist von wesentlicher Bedeutung.
Geringe Mengen an Sauerstoff, das heisst weniger als etwa 21 Luft/Min. pro 1001 Gärmedium, bewirken nur eine Hydroxyherung in 11 a-Stellung, während grössere Mengen erfindungsgemäss den gleichzeitigen oxydati- ven Abbau der 17ständigen Seitenkette bewirken. Die genaue Sauerstoffmenge variiert mit der Art des ver wendeten Pilzes, der Temperatur, dem speziellen Substrat und der Dauer der Fermentierung. So erhält man z.
B. mit Sporotrichum sulfurescens bei einer Be lüftungsgeschwindigkeit von mindestens 5 1 Luft/Min. pro 100 1 Medium die erwünschte Oxydation bei 20 bis 25 . Vorzugsweise arbeitet man mit 8-15 1 Luft pro Min. <I>Beispiel 1</I> l la-Hydroxy-testosteron Man stellt 12 1 eines Mediums her, das pro 1 Lösung 2 g (NH@2S04, 1,0 g K2HP04, 30 g Cerelose, 0,01 g FeS04, 0,5g M9S04, 0,3g ZnS04, 0,5g KCl in Leitungswasser enthält,
sterilisiert und impft nach dem Abkühlen mit einer 24 Stunden alten Kultur von Sporotrichum epigaeum A. T. C. C. 7145. Nach einer weiteren Züchtungsperiode von 24 Stunden mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 1 Luft pro Minute (pro 12 1 Medium) setzt man eine Lösung von 3 g Progesteron in 50 ml Aceton zu. Die Fer mentation und Belüftung wird bei Zimmertemperatur während 48 Stunden fortgesetzt.
Nach dem Absaugen wird das Mycel auf dem Filter mit etwa 2 1 Wasser gewaschen, mit Aceton getrocknet und zweimal mit je etwa 1,5 1 Methylen- chlorid extrahiert. Das Filtrat wird mit etwa 3 1 Me- thylenehlorid, dann mit 6 1 Mycelextrakt und zwei mal mit 3 1 Methylenchlorid extrahiert.
Die ver- einigten Extrakte werden mit 1,5 1 2%iger Bicarbo- natlösung und 3 1 Wasser gewaschen und über Na triumsulfat getrocknet. Aus dem Extrakt erhält man beim Einengen 5,75 g Rückstand, der dreimal mit 20 ml Portionen Äther-Hexan verrieben wird. Man erhält 1,45 g kristallines lla-Hydroxy-testosteron vom Smp. 178-182 C; [a]v + 90 (Chloroform).
Gleiche Ergebnisse werden erhalten, wenn man Progesteron mit andern Arten von Sporotrichum wie Sporotrichum sulfur6scens, Sp. carnis, Sp. bomby- cinum usw. fermentativ abbaut.
In analoger Weise ergeben andere Substrate, nämlich: Desoxycorticosteron, 17a,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion oder 17a-Hydroxy-progesteron alle das gleiche Produkt, das heisst lla-Hydroxy- testosteron.
<I>Beispiel 2</I> 11 a,17ss-Dihydroxy-1,4-androstadien-3-on Verwendet man im Beispiel 1 eine 24stündige Kultur von Sporotrichum epigaeum A. T. C. C. 7145, so erhält man nach Zusatz von 3 g 21-Hydroxy-1,4- pregnadien-3,20-dion in<B>100</B> ml Aceton, Fermentie- rung und Belüftung (600 ml/Minute) und viermaliger Extraktion mit 3 1 Methylendichlorid nach Ent fernen des Extraktionsmittels 4,81g Rückstand, der dreimal mit je 20 ml Äther-Aceton (5 : 1) verrieben wird.
Es verbleiben 1,22 g kristallines lla,17ss-Di- hydroxy-1,4-androstadien-3-on vom Smp. 170 bis 174 C. Die gleiche Arbeitsweise ergibt mit andern Sub straten, wie: 1,4-Pregnadien-3,20-dion und 17a,21-Dihydroxy-1,4-pregnadien-3,20-dion die gleichen Ergebnisse.
<I>Beispiel 3</I> lla,17ss-Dihydroxy-4-androsten-3-on (11 a-Hydroxy-testosteron) 12 1 eines Mediums aus 1 /o Cerelose und 2% Corn steep liquor (60% Feststoffe)
in Leitungswasser wurden mit 5 % iger NaOH auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dazu gab man etwa 45 ml Speeköl- Octadecanol als Entschäumungsmittel. Man sterili sierte 45 Minuten bei einem Druck von 1,4 at und impfte mit 650 ml einer 48stündigen Kultur von Sporotrichum sülfurescens A. T. C. C. Nr. 7159. Das Medium wurde mit 200 U./Min. gerührt und mittels einer Fritte mit steriler Luft in einer Menge von 2 I/Min. belüftet. Nach 24 Stunden wurde eine Di spersion von 3 g 17a,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20- dion zugesetzt.
Nach 24stündiger Fermentation bei einer Belüftung von 2 I/Min. wurde gemäss Beispiel 1 extrahiert und aufgearbeitet, wobei man etwa 1,4 g lla-Hydroxy-testosteron erhielt. <I>Beispiel 4</I> Die Fermentation einer Dispersion von 5 g Pregnan - 3,20 - dion mit Sporotrichum epigaeum A. T. C. C.
Nr. 7159 in 24 1 Medium nach den An gaben des Beispiels 1 ergab bei einer Belüftung von 3 I/Min. für 24 1 Medium 11 a,17ss-Dihydroxy-ätio- cholan-3-on. Belüftete man mit etwa 10 1 Luft pro 100 1 Me dium unter sonst gleichen Fermentationsbedingungen wie im Beispiel 1, so ergab: a) 17a-Hydroxy-pregnan-3,20-dion das lla,17ss- Dihydroxy-5ss-androstan-3-on (lla,17ss-Dihydroxy- ätiocholan-3-on).
b) 3a,17a-Dihydroxy-pregnan-20-on das 3a,lla, 17ss-Trihydroxy-5ss-androstan. c) 3ss,17a-Dihydroxy-pregnan-20-on das 3ss,11 , 17ss-Trihydroxy-5,6-androstan. <I>d)</I> Pregnan - 3ss,20 - diol das 3ss,11 ,17ss - Tri- hydroxy-5ss\androstan.
e) Allopregnan - 3,20 - dion das l la,17ss - Di- hydroxy-Sa-androstan-3-on.
Process for the production of steroids The present invention relates to a new process for the fermentative Ila-hydroxylation of steroids of the pregnane series with simultaneous oxidative cleavage of the side chain in the 17-position.
The process according to the invention, which leads to the formation of 11a, 17ss-dihydroxysteroids of the androstane series, is characterized in that a steroid of the pregnane series, which has a methylene group in the 11-position, is aerated with more than 2 liters of air / Min. Bringing 1 fermentation medium into contact with a fungus of the genus Sporotrichum per <B> 100 </B>. At the same time, IIIa hydroxylation and degradation of the 17-position side chain occur.
The degradation of the 17-side chain of steroid compounds by purely chemical means is known, with low yields being achieved. In the present process, however, the yields are high. The only operational step is simple, and it is of particular advantage that the 11-methylene group is oxidized simultaneously with the side chain to form an 11 a-hydroxysteroids.
The effectiveness of sporotrichum fungi with regard to 11a-hydroxylation also exceeds that of other fungi that are used on other substrates such as 1-dehydrosteroids. Another advantage of oxidation with Sporotrichum is that the formation of by-products is minimal compared to other hydroxylating organisms.
When carrying out the method according to the present invention, the steroid substrate to be treated, suitably dissolved in a solvent such as acetone, is exposed to the culture of a fungus of the genus Sporotrichum.
According to Clements and Shear, Genera of Fungi (Hafner Publishing Company, New York, 1954) the genus Sporotrichum belongs to the Moniliaceen family of the class Deuteromycetes (Fungi Imperfecti). The members of the genus Sporotrichum which have been tested and which can be used in the method according to the invention include the species: Sporotrichum sulfurescens A. T. C.
C. 7159 (catalog number of the American Type Culture Collection), Sporotrichum carnis A. T. C. C. <B> 11501, </B> Sporotrichum camis A. T. C. C. 15507, Sporotrichum epigaeum A. T. C. C. 7145, Sporotrichum bombycinum A. T. C.
C. 7139, Sporotrichum folücola Oud., Sporotrichum pulviniforme Thum, Sporotrichum olivaceum Fr., Sporotrichum globuliferum, Sporotrichum maritimem, Sporotrichum anthophilum, Sporotrichum griseolum,
Sporotrichum roseolum Oud. and Beijerinck, Sporotrichum poae PK., Sporotrichum epui, Sporotrichum Beurmanni M.
and ram. and Sporotrichum Schencckü. Fermentation, composition of the nutrient medium, type of inoculation and addition of the substrate are not decisive for the present process. You can z. B. proceed according to the procedures described in detail by Murray and Peterson in US Pat. Nos. 2 721828 and 2 602 769. The amount of oxygen available for fermentation is essential.
Small amounts of oxygen, i.e. less than about 21 air / min. per 1001 fermentation medium, only bring about a hydroxylation in the 11 a-position, while according to the invention larger amounts bring about the simultaneous oxidative degradation of the 17-position side chain. The exact amount of oxygen varies with the type of fungus used, the temperature, the particular substrate and the duration of the fermentation. So you get z.
B. with Sporotrichum sulfurescens at a ventilation speed of at least 5 1 air / min. per 100 l medium the desired oxidation at 20 to 25. It is preferable to work with 8-15 liters of air per minute. <I> Example 1 </I> 1 la-hydroxy-testosterone 12 liters of a medium are prepared which contain 2 g (NH @ 2S04, 1.0 g K2HP04, 30 g Cerelose, 0.01 g FeS04, 0.5g M9S04, 0.3g ZnS04, 0.5g KCl in tap water,
sterilized and inoculated after cooling with a 24-hour old culture of Sporotrichum epigaeum ATCC 7145. After a further cultivation period of 24 hours with an aeration rate of 1 1 air per minute (per 12 1 medium), a solution of 3 g of progesterone in 50 ml of acetone. Fermentation and aeration are continued at room temperature for 48 hours.
After suction, the mycelium on the filter is washed with about 2 liters of water, dried with acetone and extracted twice with about 1.5 liters of methylene chloride each time. The filtrate is extracted with about 3 liters of methylene chloride, then with 6 liters of mycelium extract and twice with 3 liters of methylene chloride.
The combined extracts are washed with 1.5 1 2% strength bicarbonate solution and 3 1 water and dried over sodium sulfate. On concentration, the extract gives 5.75 g of residue, which is triturated three times with 20 ml portions of ether-hexane. 1.45 g of crystalline IIIa-hydroxy-testosterone with a melting point of 178-182 ° C. are obtained; [a] v + 90 (chloroform).
The same results are obtained if progesterone is broken down by fermentation with other types of Sporotrichum such as Sporotrichum sulfur6scens, Sp. Carnis, Sp. Bombycinum, etc.
In an analogous manner, other substrates, namely: deoxycorticosterone, 17a, 21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dione or 17a-hydroxy-progesterone, all give the same product, that is to say Ila-hydroxy-testosterone.
<I> Example 2 </I> 11a, 17ss-dihydroxy-1,4-androstadien-3-one If a 24-hour culture of Sporotrichum epigaeum ATCC 7145 is used in Example 1, 3 g of 21-hydroxy are obtained after addition -1,4-pregnadiene-3,20-dione in 100 ml acetone, fermentation and aeration (600 ml / minute) and four extractions with 3 l methylene dichloride after removing the extractant 4.81 g Residue which is triturated three times with 20 ml of ether-acetone (5: 1) each time.
There remain 1.22 g of crystalline IIIa, 17ss-dihydroxy-1,4-androstadien-3-one with a melting point of 170 to 174 C. The same procedure results with other substrates such as: 1,4-pregnadiene-3 , 20-dione and 17a, 21-dihydroxy-1,4-pregnadiene-3,20-dione have the same results.
<I> Example 3 </I> IIIa, 17ss-dihydroxy-4-androsten-3-one (11α-hydroxy-testosterone) 12 1 of a medium composed of 1 / o cerelose and 2% corn steep liquor (60% solids)
in tap water, the pH was adjusted to 4.9 with 5% NaOH.
About 45 ml of speek oil octadecanol were added as a defoaming agent. It was sterilized for 45 minutes at a pressure of 1.4 at and inoculated with 650 ml of a 48-hour culture of Sporotrichum sülfurescens A.T.C.C. No. 7159. The medium was at 200 rpm. stirred and using a frit with sterile air in an amount of 2 l / min. ventilated. After 24 hours a dispersion of 3 g of 17a, 21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dione was added.
After fermentation for 24 hours with an aeration of 2 l / min. was extracted and worked up according to Example 1, about 1.4 g of Ila-hydroxy-testosterone being obtained. <I> Example 4 </I> The fermentation of a dispersion of 5 g of pregnane - 3.20 - dione with Sporotrichum epigaeum A. T. C. C.
No. 7159 in 24 1 medium according to the information in Example 1 resulted in an aeration of 3 l / min. for 24 1 medium 11 a, 17ss-dihydroxy-etio-cholan-3-one. If one aerated with about 10 1 air per 100 1 medium under otherwise the same fermentation conditions as in Example 1, the result was: a) 17a-hydroxy-pregnane-3,20-dione das lla, 17ss-dihydroxy-5ss-androstane-3- on (lla, 17ss-dihydroxy-ethiocholan-3-one).
b) 3a, 17a-dihydroxy-pregnan-20-one das 3a, lla, 17ss-trihydroxy-5ss-androstane. c) 3ss, 17a-dihydroxy-pregnan-20-one the 3ss, 11, 17ss-trihydroxy-5,6-androstane. <I> d) </I> Pregnan - 3ss, 20 - diol das 3ss, 11, 17ss - tri-hydroxy-5ss \ androstane.
e) Allopregnan - 3.20 - dione das l la, 17ss - di-hydroxy-sa-androstan-3-one.