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Verfahren zur Herstellung von Zinkinsulin mit erhöhtem Zinkgehalt Es ist bekannt, Zinkinsulin mit erhöhtem Zinkgehalt sowohl in kristallinischer als amorpher Form dadurch herzustellen, dass man Insulin zu wässrigen Medien zusetzt, worin es schwer löslich ist, und die ein Zinksalz enthalten sowie einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7 aufweisen, eventuell unter Zusatz von bis zu 8 Gewichtsprozent Azeton, um auf das amorphe Insulin lösend zu wirken und die Kristallisation zu fördern.
Es ist ferner bekannt, injizierbare Suspensionen oder Lösungen von. Zinkinsulin sowie von Globininsulin, Protamininsulin und Methylalbumininsulin mit verschiedenem Zinkgehalt herzustellen, ausgehend sowohl voran amorphen wie vom kristallinischen Insulin.
Das Zinkinsulin ist in wässrigen Flüssig- lceiten bei dem pH-Wert des Blutes schwer lös- lieln und daher für medizinische Therapie, wo man eine retardierte Insulinwirkung wünscht, verwendbar. Eine Aufschlämmung amorpher oder kristallinischer Zinkinsulinteilchen, die bei denn pH-Wert des Organismus besonders schwer löslich sind und daher langsam resor- biert werden, kann direkt injiziert werden. Die Lösung kann mit der Blutflüssigkeit isotonisch sein.
Es wurde nun gefunden, dass Zinkinsulin mit erhöhtem Zinkgehalt vorteilhaft und mit praktisch quantitativer Ausbeute dadurch hergestellt werden kann, dass auf Insulin in einem organischen oder wässrig-organischen Medium mit höchstens 85 % Wasser eine Zinkverbindung zur Einwirkung gebracht wird.
Als organische Medien sind beispielsweise geeignet: sehwache organische Basen, z. B. Amine, Amide und Pyridine, Phenole, Kre- sole, organische Säuren, wie Eisessig, Milchsäure, Glykolsäure, Propionsäure oder Ameisensäure, mono- oder polyvalente Alkohole, deren Derivate, wie Ester und Äther, Ketone sowie Halogen- oder Thioderivate der genannten Stoffe.
Es kann zweckmässig sein, wenn das Me- ciium Wasser enthält. Weiterhin kann es zweckmässig sein, solche Medien zu verwenden, in denen das Insulin löslich ist.
Es kann ferner zweckmässig sein, das Insulin in fester Form mit einer organischen oder wässrig-organischen Zinklösung zur Reaktion zubringen, indem es in dieser aufgeschlämmt wird. Die kristallinischen oder amorphen Insulinteilehen setzen sieh leicht mit denn gelösten Zink um.
Bei der Verwendung von wasserhaltigen Medien kann es zweekinässig sein, z. B. NH3 und NI14C1 zuzusetzen, um zu vermeiden, dass Zinkhydroayd gefällt wird.
Der ganze Prozess kann unter Beachtung steriler -Massnahmen vorgenommen werden. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren lässt sieb die Menge Zink, die von dem Insu-
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lin aufgenommen wird, besonders leicht regulieren.
Gewöhnliches Insulin weist eine solche Anzahl von Carboxylgruppen auf, dass maimal 2,72 Prozent Zink, auf die Insulinmenge berechnet, gebunden werden können. In den erfindungsgemäss erhältlichen Präparaten kann das Zink bis zu einer entsprechenden Menge an die genannten Gruppen gebunden sein. während weiteres Zink offenbar in anderer Weise an das Insulin gebunden ist.
Zur Herstellung injizierbarer Suspensionen können den Insulin-Zink-Verbindungen Ionen von Zink, Kalzium oder Magnesium hinzugefügt werden. Beispiel. 1 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml absolutem Äthylalkohol, der pro ml h mg Zink in Form eines löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle durch Filtrieren isoliert, mit Äthylalkohol gewaschen und getrocknet. Sie enthalten etwa 5% Zink.
Die Kristalle können auch durch Zentrifugieren isoliert werden. Beispiel 2 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml absolutem Äthylalkohol, der pro ml 2,5 mg Zink in Form eines löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen mit Äthylalkohol und getrocknet. Sie enthalten etwa 4 % Zink. Beispiel 3 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml absolutem Äthylalkohol, der pro ml 0,5 mg Zink in Form eines löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert. gewaschen mit Äthylalkohol und getrocknet. Sie enthalten etwa 3,5% Zink. Beispiel 4 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml absolutem Äthylalkohol, der pro ml 0,3 mg Zink in Form eines löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt.
Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen mit Äthylalkohol und getrocknet. Sie enthalten etwa 3 % Zink.
Wenn man nur 0,1 mg Zink pro ml verwendet, erhält man Kristalle mit einem Zink- gelialt von etwa 1,5 %. Beispiel 5 1 g kristallinisches Insulin wird irr 100 g geschmolzenem wasserfreiem Phenol, das 1 % Zink in Form von ZnCl2 enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren wird ein gleiches Volumen Äthylalkohol zugesetzt, und die Kristalle werden wie oben isoliert, mit Äthylalkohol gewaschen und getrocknet. Die Kristalle enthalten etwa 5 % Zink.
Beispiel 6 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml ssenzylalkohol, der 20 mg Zink in Form von ZnCl2 enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, mit Äthylalkohol gewaschen und getrocknet. Die Kristalle enthalten etwa 2 % Zink.
Beispiel 7 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml Azeton, das pro ml 5 nag Zink in Form eines löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert und mit Azeton gewaschen und getrocknet. Die Kristalle ent- halten etwa 53 % Zink.
Beispiel 8 1. g kristallinisches Insulin wird in 100 nil Pyridin, das pro nil 1.0 in- Zink in Form eines löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt.
Nach zweistündigem -Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, mit Alkohol gewaschen und getrocknet. Die Kri- stalle enthalten etwa ')% Zink. Beispiel 9 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 in1 Eisessig, der pro ml 5 mg Zink in Form eine
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löslichen Zinksalzes enthält, aufgeschlämmt. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, mit Alkohol gewaschen und getrocknet. Die Kristalle enthalten etwa 5 % Zink.
Beispiel 10 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml eines Alkohol-Wasser-Gemisches mit 35 Vol.- Prozent Äthylalkohol aufgeschlämmt. Das Gemisch enthält pro ml 10 mg Zink in Form. von Zinkchlorid. Die Lösung weist einen pH-Wert von 4,5 auf. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen mit Alkohol und getrocknet. Die Kristalle weisen einen Zinkgehalt von etwa 3,5 % Zink auf.
Wenn man ein Alkohol-Wasser-Gemisch mit 20 Vol.-Prozent Äthylalkohol verwendet, das pro ml 1 mg Zink enthält, und bei einem pH-Wert von 4,7 arbeitet, erhält man Kristalle mit einem Zinkgehalt von etwa 1,7 %. Beispiel 11 1. g kristallinisches Insulin wird in 100 ml eines Alkohol-Wasser-Gemisches mit. 15 Vol.- Prozent Äthylalkohol aufgeschlämmt. Das Gemisch enthält pro ml 10 mg Zink in Form von Zinkchlorid. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen mit Alkohol und getrocknet. Die Kristalle weisen einen Zinkgehalt von etwa 2 % Zink auf.
Beispiel 12 1. g kristallinisches Insulin wird in 100 ml eines Alkohol-Wasser-Gemisches, das 50 Vol.- Prozent Äthylalkohol enthält, aufgeschlämmt. Das Gemisch enthält pro ml 10 mg Zink in Form von Zinkchlorid. Dem Gemisch wird eine NH3-NH4Cl-Lösung zugesetzt zur Erreichung ekles PH-Wertes von 7. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen und getrocknet. Die Kristalle enthalten etwa 7 % Zink. Beispiel 13 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml eines Alkohol-Wasser-Gemisches, 35 Vol.-Pro- zent Äthylalkohol enthaltend, aufgeschlämmt. Das Gemisch enthält pro ml 10 mg Zink in Form von Zinkchlorid. Dem Gemisch wird eine NH3- NH4Cl-Lösung zugesetzt. zur Erreichung eines pH-Wertes von 7. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen mit Alkohol und getrocknet.
Die Kristalle enthalten etwa 5,5% Zink.
Beispiel 14 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml eines Alkohol-Wasser-Gemisches, 15 Vol.-Pro- zent Äthylalkohol enthaltend, aufgeschlämmt. Das Gemisch enthält pro ml 10 mg Zink in Form von Zinkchlorid. Dem Gemisch wird eine NH3- NH4Cl-Lösung zugesetzt zur Erreichung eines pH-Wertes von 7. Nach zweistündigem Umrühren werden die Kristalle wie oben isoliert, gewaschen mit Alkohol und getrocknet. Die Kristalle enthalten etwa 5% Zink.
In sämtlichen obigen Beispielen kann man amorphes Insulin verwenden an Stelle von kristallinischem Insulin. Beispiel 15 1 g kristallinisches Insulin wird in 100 ml eines Alkohol-Wasser-Gemisches, das 30 Gew.- Prozent Äthylalkohol enthält, aufgeschlämmt. Das Gemisch enthält. pro ml 2,3 mg Zink in Form eines löslichen Zinksalzes und hat einen pH-Wert von 4,4. Das Insulin ist teilweise in Lösung gegangen.
Der nicht gelöste Teil der Kristalle wird abfiltriert, mit Alkohol gewaschen und ge- trocknet. Sie enthalten 2,2 % Zink.
Der pH-Wert des Filtrates wird auf 6,3 eingestellt. Amorphes Insulin wird ausgefällt, mit. Alkohol gewaschen und getrocknet. Das amorphe Insulin enthält etwa 4,5 0/0 Zink.
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Process for the production of zinc insulin with increased zinc content It is known to produce zinc insulin with increased zinc content in both crystalline and amorphous form by adding insulin to aqueous media in which it is sparingly soluble and which contain a zinc salt and a pH of approximately 6 to 7, possibly with the addition of up to 8 percent by weight acetone, in order to have a dissolving effect on the amorphous insulin and to promote crystallization.
It is also known to use injectable suspensions or solutions of. To produce zinc insulin as well as globin insulin, protamine insulin and methyl albumin insulin with different zinc content, starting with both amorphous and crystalline insulin.
The zinc insulin is difficult to dissolve in aqueous liquids at the pH value of the blood and can therefore be used for medical therapy where a delayed insulin effect is desired. A suspension of amorphous or crystalline zinc insulin particles, which are particularly sparingly soluble at the pH value of the organism and are therefore slowly absorbed, can be injected directly. The solution can be isotonic with the blood fluid.
It has now been found that zinc insulin with an increased zinc content can be produced advantageously and with practically quantitative yield by bringing a zinc compound to act on insulin in an organic or aqueous-organic medium with at most 85% water.
Examples of suitable organic media are: weak organic bases, e.g. B. amines, amides and pyridines, phenols, creoles, organic acids such as glacial acetic acid, lactic acid, glycolic acid, propionic acid or formic acid, mono- or polyvalent alcohols, their derivatives such as esters and ethers, ketones and halogen or thio derivatives of the above Fabrics.
It can be useful if the calcium contains water. It can also be useful to use media in which the insulin is soluble.
It can furthermore be expedient to react the insulin in solid form with an organic or aqueous-organic zinc solution by being suspended in this. The crystalline or amorphous insulin parts react easily with the dissolved zinc.
When using water-containing media, it can be two-dimensional, e.g. B. add NH3 and NI14C1 to avoid that zinc hydroxide is precipitated.
The whole process can be carried out under observance of sterile measures. In the process according to the invention, the amount of zinc that is consumed by the insu-
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lin is absorbed particularly easily.
Ordinary insulin has such a number of carboxyl groups that a maximum of 2.72 percent zinc, calculated on the amount of insulin, can be bound. In the preparations obtainable according to the invention, the zinc can be bound to the groups mentioned up to a corresponding amount. while other zinc is apparently bound to insulin in a different way.
Ions of zinc, calcium or magnesium can be added to the insulin-zinc compounds to create injectable suspensions. Example. 1 1 g of crystalline insulin is suspended in 100 ml of absolute ethyl alcohol, which contains mg of zinc per ml in the form of a soluble zinc salt. After stirring for two hours, the crystals are isolated by filtration, washed with ethyl alcohol and dried. They contain about 5% zinc.
The crystals can also be isolated by centrifugation. Example 2 1 g of crystalline insulin is suspended in 100 ml of absolute ethyl alcohol which contains 2.5 mg of zinc per ml in the form of a soluble zinc salt. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with ethyl alcohol and dried. They contain about 4% zinc. Example 3 1 g of crystalline insulin is suspended in 100 ml of absolute ethyl alcohol which contains 0.5 mg of zinc per ml in the form of a soluble zinc salt. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above. washed with ethyl alcohol and dried. They contain about 3.5% zinc. Example 4 1 g of crystalline insulin is suspended in 100 ml of absolute ethyl alcohol which contains 0.3 mg of zinc per ml in the form of a soluble zinc salt.
After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with ethyl alcohol and dried. They contain about 3% zinc.
If you only use 0.1 mg zinc per ml, you get crystals with a zinc gelation of about 1.5%. Example 5 1 g of crystalline insulin is slurried in 100 g of molten anhydrous phenol containing 1% zinc in the form of ZnCl2. After stirring for two hours, an equal volume of ethyl alcohol is added and the crystals are isolated as above, washed with ethyl alcohol and dried. The crystals contain about 5% zinc.
Example 6 1 g of crystalline insulin is slurried in 100 ml of senzyl alcohol containing 20 mg of zinc in the form of ZnCl2. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with ethyl alcohol and dried. The crystals contain about 2% zinc.
Example 7 1 g of crystalline insulin is slurried in 100 ml of acetone which contains 5 nag zinc in the form of a soluble zinc salt per ml. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above and washed with acetone and dried. The crystals contain about 53% zinc.
Example 8 1. g of crystalline insulin is slurried in 100 nil pyridine which contains 1.0 nil per nil in zinc in the form of a soluble zinc salt.
After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with alcohol and dried. The crystals contain about 1% zinc. Example 9 1 g of crystalline insulin is dissolved in 100 in1 glacial acetic acid containing 5 mg of zinc per ml in the form of a
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contains soluble zinc salt, slurried. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with alcohol and dried. The crystals contain about 5% zinc.
Example 10 1 g of crystalline insulin is suspended in 100 ml of an alcohol-water mixture with 35 percent by volume of ethyl alcohol. The mixture contains 10 mg of zinc in the form per ml. of zinc chloride. The solution has a pH of 4.5. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with alcohol and dried. The crystals have a zinc content of around 3.5% zinc.
If you use an alcohol-water mixture with 20 percent by volume of ethyl alcohol, which contains 1 mg of zinc per ml, and works at a pH of 4.7, you get crystals with a zinc content of about 1.7%. Example 11 1. g of crystalline insulin is added to 100 ml of an alcohol-water mixture with. 15 percent by volume ethyl alcohol slurried. The mixture contains 10 mg of zinc per ml in the form of zinc chloride. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with alcohol and dried. The crystals have a zinc content of around 2% zinc.
Example 12 1. g of crystalline insulin is slurried in 100 ml of an alcohol-water mixture containing 50 percent by volume of ethyl alcohol. The mixture contains 10 mg of zinc per ml in the form of zinc chloride. An NH3-NH4Cl solution is added to the mixture to achieve a disgusting pH value of 7. After stirring for two hours, the crystals are isolated, washed and dried as above. The crystals contain about 7% zinc. Example 13 1 g of crystalline insulin is suspended in 100 ml of an alcohol-water mixture containing 35 percent by volume of ethyl alcohol. The mixture contains 10 mg of zinc per ml in the form of zinc chloride. An NH3-NH4Cl solution is added to the mixture. to achieve a pH value of 7. After two hours of stirring, the crystals are isolated as above, washed with alcohol and dried.
The crystals contain about 5.5% zinc.
Example 14 1 g of crystalline insulin is slurried in 100 ml of an alcohol-water mixture containing 15 percent by volume of ethyl alcohol. The mixture contains 10 mg of zinc per ml in the form of zinc chloride. An NH3-NH4Cl solution is added to the mixture to achieve a pH value of 7. After stirring for two hours, the crystals are isolated as above, washed with alcohol and dried. The crystals contain about 5% zinc.
In all of the above examples, amorphous insulin can be used in place of crystalline insulin. Example 15 1 g of crystalline insulin is slurried in 100 ml of an alcohol-water mixture containing 30 percent by weight of ethyl alcohol. The mixture contains. 2.3 mg zinc per ml in the form of a soluble zinc salt and has a pH value of 4.4. The insulin has partially gone into solution.
The undissolved part of the crystals is filtered off, washed with alcohol and dried. They contain 2.2% zinc.
The pH of the filtrate is adjusted to 6.3. Amorphous insulin is precipitated with. Alcohol washed and dried. The amorphous insulin contains about 4.5% zinc.